La voie ubiquitine-protéasome : La complexité et les myriades de fonctions de la mort des protéines

Notre perception de la dégradation des protéines intracellulaires a radicalement changé au cours de la dernière décennie. D’un processus de  » point final  » charognard, non régulé et non spécifique, il est devenu clair que la protéolyse des protéines cellulaires est un processus hautement complexe, temporellement contrôlé et étroitement régulé qui joue des rôles majeurs dans une variété de voies fondamentales pendant la vie et la mort cellulaire. Deux cascades protéolytiques majeures ont été décrites. Les caspases sont impliquées dans la mort cellulaire programmée (apoptose), tandis que la dégradation de la plupart des protéines cellulaires régulatrices à courte durée de vie est médiée par la voie ubiquitine-protéasome. Parmi celles-ci, on trouve des régulateurs du cycle et de la division cellulaires tels que les cyclines mitotiques et G1 et les inhibiteurs de la kinase dépendante des cyclines, des régulateurs de croissance tels que c-Fos et c-Jun, des suppresseurs de tumeurs tels que p53, des récepteurs de surface tels que le récepteur de l’hormone de croissance, et des canaux ioniques, le régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) par exemple. Le système est également impliqué dans la protéolyse sélective des protéines anormales/mutées et dans le traitement des antigènes restreints de classe I du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). La découverte de l’implication du système dans la dégradation de c-myc et dans l’activation protéolytique en deux étapes de NF-κB, par exemple, a marqué l' »entrée » de la dégradation médiée par l’ubiquitine dans le domaine de la régulation transcriptionnelle. Par le biais de la dégradation de protéines régulatrices clés et à courte durée de vie, le système semble jouer des rôles importants dans divers processus cellulaires de base. Parmi ceux-ci figurent la régulation du cycle et de la division cellulaires, l’implication dans la réponse cellulaire au stress et aux modulateurs extracellulaires, la morphogenèse des réseaux neuronaux, la modulation des récepteurs de surface cellulaire, des canaux ioniques et de la voie de sécrétion, la réparation de l’ADN, la biogénèse des organelles et la régulation des réponses immunitaires et inflammatoires. Des preuves récentes indiquent que le système est également impliqué dans l’apoptose. Avec un tel éventail de substrats et de processus, il n’est pas surprenant que des aberrations dans le processus aient récemment été impliquées dans la pathogenèse de plusieurs maladies, tant héréditaires qu’acquises. Parmi celles-ci, citons la dégénérescence musculaire qui suit une dénervation ou une immobilisation prolongée, certaines formes de la maladie d’Alzheimer, la stérilité masculine et le syndrome d’Angelman (pour des examens récents du système de l’ubiquitine, voir les réf. 1-4).

La dégradation d’une protéine par la voie de l’ubiquitine procède en deux étapes discrètes et successives : (i) la fixation covalente de multiples molécules d’ubiquitine au substrat protéique, et (ii) la dégradation de la protéine ciblée par le complexe protéasome 26S avec la libération d’ubiquitine libre et réutilisable. Pour garantir l’élimination efficace et spécifique d’une certaine protéine à un moment donné, la conjugaison de l’ubiquitine et la dégradation des substrats marqués doivent être étroitement régulées. Dans une étude publiée dans ce numéro des Proceedings (5), Zhang et ses collègues rapportent l’identification d’une région d’activation dans la sous-unité α de l’activateur du protéasome PA28 (REG). Pour intégrer cette découverte dans le contexte biochimique et physiologique approprié, nous allons brièvement passer en revue notre compréhension actuelle de la voie protéolytique de l’ubiquitine. Ce système (représenté sur la figure 1) est constitué de plusieurs composants qui agissent de concert. L’un d’entre eux, l’ubiquitine, une protéine de 76 résidus conservée au cours de l’évolution, est activée dans son extrémité C-terminale Gly en un intermédiaire thiol-ester de haute énergie, une réaction catalysée par l’enzyme activatrice d’ubiquitine, E1. Après activation, l’une des nombreuses enzymes E2 (protéines porteuses d’ubiquitine ou enzymes conjuguant l’ubiquitine, UBC) transfère le fragment d’ubiquitine activé de E1 à un membre de la famille des ubiquitine-protéines ligases, E3, auquel la protéine substrat est spécifiquement liée. E3 catalyse la dernière étape du processus de conjugaison, la fixation covalente de l’ubiquitine au substrat. Le premier fragment d’ubiquitine est transféré au groupe ɛ-NH2 d’un résidu Lys du substrat protéique pour générer une liaison isopeptidique. Au cours de réactions successives, une chaîne de polyubiquitine est synthétisée par transfert progressif de fragments activés supplémentaires sur la Lys48 de la molécule d’ubiquitine précédemment conjuguée. La chaîne sert, très probablement, de marqueur de reconnaissance pour le protéasome (voir ci-dessous). L’ubiquitine K48R ou l’ubiquitine méthylée (dans laquelle tous les groupes amino libres ont été chimiquement modifiés) ne peuvent pas générer de chaînes de polyubiquitine et servent de terminateurs de chaîne. Par conséquent, lorsqu’elles sont surexprimées dans les cellules ou introduites dans des systèmes acellulaires, elles inhibent la protéolyse. La liaison du substrat à la E3 est spécifique et implique que les E3 jouent un rôle majeur dans la reconnaissance et la sélection des protéines pour la conjugaison et la dégradation ultérieure. La structure du système semble être hiérarchique : une seule E1 semble réaliser l’activation de l’ubiquitine nécessaire à toutes les modifications. Plusieurs espèces majeures d’enzymes E2 ont été caractérisées dans les cellules de mammifères. Il semble que chaque E2 puisse agir avec une ou plusieurs enzymes E3. Bien que seules quelques enzymes E3 aient été décrites jusqu’à présent, il semble que les ubiquitine ligases appartiennent à une grande famille d’enzymes en pleine expansion. Quant au mode de reconnaissance des ligases, à l’exception de quelques cas, il est peu probable que chaque E3 cible un seul substrat. Il est plutôt concevable que plusieurs protéines cellulaires différentes soient reconnues par une seule ligase via un motif structurel similaire, mais clairement non identique. Quelques protéines peuvent être reconnues via leur résidu N-terminal libre et  » déstabilisant  » ( » règle de l’extrémité N  » ; réf. 6). Cependant, la grande majorité des protéines cellulaires sont acétylées à leur extrémité N-terminale ou ont des extrémités aminées  » stabilisantes  » et sont ciblées par différents signaux. Certaines sont reconnues par des séquences primaires qui se trouvent en aval du résidu N-terminal. D’autres sont ciblés via une ou plusieurs modifications secondaires, post-traductionnelles, telles que la phosphorylation, ou après association avec des protéines auxiliaires telles que des oncoprotéines ou des chaperons moléculaires.

Après la conjugaison, la fraction protéique de l’adduit est dégradée par le complexe protéasome, et l’ubiquitine libre et réutilisable est libérée (pour des revues récentes sur les protéasomes, voir les réfs 7-10). Bien que le consensus actuel soit que le protéasome 26S sert de bras protéolytique principal du système d’ubiquitine, le spectre de substrat de l’enzyme peut être plus large et inclure également des protéines non ubiquitinylées. Un cas bien étudié est celui de l’ornithine décarboxylase (ODC). L’ODC est dégradée après une association non covalente avec un antizyme qui peut fonctionner dans le processus de reconnaissance comme une chaperonne de type ubiquitine spécifique au substrat. D’autres substrats, principalement des protéines du réticulum endoplasmique (RE), peuvent également être dégradés par le protéasome sans ubiquitinylation préalable, bien que cela n’ait pas été fermement établi. Il peut s’agir, par exemple, de molécules mal repliées de la chaîne lourde du CMH (HC), de la 3-hydroxy-3-méthyl glutaryl CoA (HMG-R) des mammifères et de la variante Z de l’α-1-antitrypsine (α1-ATZ) (revue dans la réf. 11). De plus, il est maintenant clair que toutes les protéines ubiquitinylées ne sont pas ciblées pour être dégradées par le protéasome. C’est surtout le cas des protéines membranaires matures de la surface cellulaire, comme le récepteur de l’hormone de croissance. Pour ces protéines, la modification de l’ubiquitine se produit après la liaison du ligand et est nécessaire pour leur endocytose et leur ciblage vers le lysosome (voir réf. 12). La dégradation des protéines ancrées dans la membrane par le système d’ubiquitine soulève des problèmes mécanistiques importants, encore non résolus, qui sont principalement liés à la question de savoir comment deux événements topologiquement distincts, tels que le mauvais repliement dans le RE et la dégradation dans le cytosol, ou la liaison du ligand dans le domaine extracellulaire et l’ubiquitinylation sur la queue cytosolique d’un récepteur, se rencontrent. Pour les protéines membranaires de surface, un problème évident est lié au rôle de la modification par l’ubiquitine : est-elle nécessaire pour l’endocytose de la protéine marquée ou, à un stade ultérieur, pour son ciblage spécifique et son absorption par le lysosome. Pour les protéines du RE dégradées par le protéasome cytosolique, les questions importantes concernent les mécanismes qui sous-tendent la récupération de ces protéines à travers la membrane et leur retour dans le cytosol. Le domaine transmembranaire des protéines ancrées dans la membrane est hydrophobe et son retrait de la membrane implique probablement un transport spécialisé, dépendant de l’énergie et basé sur des canaux. Pour les protéines luménales du RE, la question est de savoir comment elles sont ramenées dans le cytosol.

Des preuves récentes suggèrent que le principe de la modification par l’ubiquitine n’est pas limité au ciblage des protéines pour leur dégradation. Il semble que l’ubiquitine soit un membre d’une plus grande famille, et plusieurs protéines de type ubiquitine ont également été décrites. Un cas intéressant concerne le ciblage dans des structures complexes. On a découvert que la localisation de RanGAP1, une protéine d’activation de la GTPase Ran, à la protéine RanBP2 du complexe du pore nucléaire, dépend d’une modification covalente unique et stable par une protéine de type ubiquitine de 11,5 kDa et de 101 résidus, SUMO-1 (13). La réaction d’activation est similaire à celle de l’ubiquitine et implique E1 et une E2 spécifique, UBC9. Ainsi, la modification covalente post-traductionnelle par l’ubiquitine et les molécules de type ubiquitine sert un large spectre de fonctions. Elle est impliquée dans le ciblage des protéines pour leur dégradation par le protéasome et le lysosome, mais sert également des fonctions non protéolytiques.

Le complexe protéasome le mieux étudié et impliqué dans la dégradation des protéines marquées à l’ubiquitine est le complexe protéasome 26S. Il s’agit d’une structure symétrique en forme de « coquille d’œuf » composée d’une unité catalytique centrale, un complexe protéasome 20S en forme de tonneau, qui est flanqué des deux côtés par des complexes protéasomes 19S régulateurs (19S-20S-19S). La structure cristalline du protéasome 20S eucaryote (levure) a été résolue à 2,4 Å (14). Cette étude a corroboré les prédictions antérieures sur la structure du complexe, mais a également révélé certaines caractéristiques inattendues. Le complexe de la levure est disposé comme un empilement de quatre anneaux, chacun contenant sept sous-unités distinctes, α1-7β1-7β1-7α1-7. Les différentes sous-unités α et β ont des masses moléculaires de l’ordre de 25-30 kDa. Les sites actifs résident dans trois sous-unités β, β1, β2 et β5, mais pas dans les sous-unités α. L’analyse topologique de la localisation des différentes sous-unités a révélé que pour les trois activités protéolytiques distinctes, celle de type trypsine, celle de type chymotrypsine et celle d’hydrolyse postglutamyl peptidyle, les sites actifs sont générés par des paires adjacentes de sous-unités de type β identiques résidant dans différents anneaux β. L’analyse des résidus du site actif révèle un nouveau type de mécanisme protéolytique. Les trois sous-unités β subissent une autocatalyse entre le dernier résidu Gly du pro-peptide et Thr1 de la sous-unité mature qui participe au processus autocatalytique et devient une partie essentielle du site catalytique. La résolution de la structure cristalline a également permis de mieux comprendre le mode d’action des différents inhibiteurs du protéasome. Thr1 dans les β1, β2 et β5 se lie à l’inhibiteur moins spécifique de la calpaïne I, l’acétyl-Leu-Leu-Norleucinal (ALLN). Lactacystine, un inhibiteur plus spécifique, peut être lié de manière covalente à β5 où il peut générer, en plus, une foule de liaisons hydrogène avec d’autres chaînes latérales environnantes. L’analyse mutationnelle a révélé que les autres sous-unités β, en particulier β4 et β7 qui résident de manière adjacente à β5 et β1, affectent l’activité de ces sous-unités. Les β6 et β7 sont également générées à partir de pro-protéines via un traitement spécifique. Les β3 et β4 ne sont pas transformées. En raison de leur rôle possible dans l’établissement de contacts intersous-unités et la stabilisation de la structure du complexe, il semble que les propeptides soient essentiels à la biogenèse et à la stabilisation de la structure protéasomale, et que le traitement n’ait lieu qu’après l’assemblage. La structure du cristal a également montré que les chaînes α, bien que catalytiquement inactives, jouent un rôle essentiel dans la stabilisation de la structure à deux anneaux des chaînes β. Elles doivent également jouer un rôle dans la liaison des complexes de la coiffe 19S, mais la structure des contacts et les mécanismes de liaison ne seront élucidés que lorsque la structure cristalline du complexe 26S sera résolue. La structure cristalline a également révélé une distance de 28 Å entre les résidus Thr1 des sous-unités β actives adjacentes. Cette distance détermine probablement la longueur des peptides générés lors du processus protéolytique (résidus ≈8-aa) et explique le rôle du protéasome dans la génération des peptides antigéniques présentés sur les molécules de CMH de classe I. L’existence, cependant, de produits intermédiaires de longueur variable suggère un second site hydrolytique en aval de Thr1 (voir ci-dessous).

Un problème important, encore non résolu, concerne l’entrée des substrats protéiques et la sortie des produits protéolytiques du protéasome. Le protéasome des archaebactéries (Thermoplasma acidophilum) contient deux pores d’entrée de ≈13 Å aux deux extrémités du cylindre entourés de segments définis des sept chaînes α. En contraste frappant et plutôt surprenant, ces ports d’entrée n’existent pas dans le protéasome 20S eucaryote, et l’entrée dans la chambre catalytique inter-β anneaux n’est pas possible depuis les extrémités du complexe. Les domaines N-terminaux de α1, α2, α3, α6 et α7 font saillie les uns vers les autres et remplissent l’espace de plusieurs couches de chaînes latérales en interaction étroite. Ainsi, l’entrée par les extrémités ne sera possible qu’après un réarrangement substantiel qui peut potentiellement se produire après l’association avec le complexe 19S. Un tel réarrangement peut également nécessiter une énergie métabolique qui peut être fournie par l’activité ATPase de plusieurs des sous-unités du complexe 19S. Le complexe de levure présente quelques orifices latéraux étroits, notamment à l’interface entre les anneaux α et β. Ces orifices mènent directement aux sites actifs Thr1. Ils sont recouverts de résidus polaires qui peuvent potentiellement se réarranger pour générer des ouvertures de ≈10 Å par lesquelles les substrats protéiques dépliés et étendus peuvent entrer.

La régulation de l’activité du protéasome 20S se produit à plusieurs niveaux. Après stimulation des cellules présentatrices d’antigènes par l’interféron γ, trois sous-unités β constitutives, 1, 2 et 5, sont remplacées par de nouvelles sous-unités β distinctes, β1i (LMP2), β2i (MECL1) et β5i (LMP7). Les nouvelles sous-unités sont relativement plus efficaces dans la génération de peptides antigéniques reconnus par les molécules du CMH de classe I et par les cellules T cytotoxiques appropriées via les récepteurs des cellules T. Un autre type de régulation implique la formation de complexes avec des complexes régulateurs. Le protéasome 26S est généré après l’association ATP-dépendante du complexe 20S avec deux complexes 19S. Les complexes 19S sont composés d’au moins 18 protéines distinctes dont la masse moléculaire est comprise entre 25 et 110 kDa. Ce complexe sert de port d’entrée dans le noyau catalytique et assure les différentes fonctions de régulation nécessaires pour assurer la dégradation sélective des substrats marqués à l’ubiquitine. Il s’agit, par exemple, d’un site de liaison pour les chaînes d’ubiquitine, d’une activité de recyclage de l’ubiquitine et de plusieurs ATPases, ainsi que de la capacité à stimuler les différentes activités peptidases du complexe 20S. En effet, des sous-unités qui exercent de telles activités ont été identifiées. La sous-unité de liaison de la chaîne d’ubiquitine qui a été décrite chez les mammifères (S5a) et les plantes (MBP1) est particulièrement intéressante. Ces sous-unités lient les monomères d’ubiquitine ; cependant, les chaînes de polyubiquitine, et en particulier celles qui contiennent plus de quatre fragments, se lient avec une plus grande affinité. Récemment, le gène de levure codant pour la chaîne homologue, Mcb1, a été cloné. De manière surprenante, les mutants de délétion Δmcb1 ne présentent aucun défaut de croissance et dégradent les protéines ubiquitinylées normalement, à l’exception de la protéine modèle de fusion linéaire ubiquitin-Pro-β-Gal. Ils présentent cependant une légère sensibilité au stress, comme l’exposition à des analogues d’acides aminés (15). Une explication possible de ces résultats inattendus est que les protéines ubiquitinylées sont reconnues par une sous-unité protéasomique supplémentaire, encore non définie. L’un de ces candidats est l’enzyme désubiquitinylante Doa4, qui a pour fonction de retirer les fragments d’ubiquitine des substrats protéolytiques. Il est également possible que le protéasome ne reconnaisse pas les fragments d’ubiquitine, mais que, comme les chaperons moléculaires, il s’associe à des motifs mal définis et mal repliés dans le substrat protéique. Ces motifs sont générés après la « dénaturation » de la protéine par le marquage à l’ubiquitine. L’identification de la spécificité de reconnaissance du protéasome et le rôle que joue l’ubiquitine dans ce processus sont essentiels pour comprendre les mécanismes d’action de la protéase en particulier et du système ubiquitine en général. Une autre fonction de régulation du protéasome 19S implique l’édition de la chaîne de polyubiquitine. Le complexe contient une isopeptidase de 37 kDa qui élimine les fragments d’ubiquitine uniques de l’extrémité distale des courtes chaînes de poly-ubiquitine (16). On suppose que cette isopeptidase est impliquée dans l’édition et le sauvetage de la dégradation des protéines faiblement ubiquitinylées ou lentement dégradées. Elle est différente à cet égard de Doa4 et d’une isopeptidase ATP-dépendante qui est associée au protéasome. Les deux enzymes sont impliquées dans le recyclage de l’ubiquitine et le maintien du niveau d’ubiquitine libre dans la cellule.

Un autre complexe qui s’associe au protéasome 20S et augmente considérablement son activité est PA28 (REG ou le régulateur 11S ; réfs 17 et 18). Contrairement à l’association avec le 19S, la formation du complexe avec PA28 est indépendante de l’ATP. Après association, PA28 augmente le Vmax et diminue le Km du complexe 20S vers toute une série de peptides différents. Le complexe PA28-20S-PA28 est cependant inactif vis-à-vis des protéines natives intactes ou conjuguées à l’ubiquitine. L’activateur pur est un complexe de deux sous-unités ≈28-kDa, PA28α et PA28β, qui sont ≈50% identiques. L’immunoprécipitation avec des anticorps spécifiques aux sous-unités et des expériences de réticulation chimique ont révélé que PA28 est un hexamère de forme annulaire qui est composé de sous-unités α et β alternées avec une stœchiométrie de (αβ)3 (19). Il est intéressant de noter que ces sous-unités sont également identiques à 30-40% à une protéine nucléaire de fonction inconnue jusqu’à présent, l’antigène Ki, qui réagit avec les sérums de patients atteints de la maladie auto-immune du lupus érythémateux systémique. Le complexe hexamérique a une structure en forme d’anneau (Fig. 1) et il coiffe le complexe protéasome 20S sur l’une ou les deux plaques terminales. La structure de la coiffe est traversée par un canal central avec une ouverture de 20 Å à l’extrémité et une ouverture de 30 Å à la surface de liaison du protéasome (20, 21). Les ouvertures et le canal servent, très probablement, comme une partie du mécanisme de translocation des substrats peptidiques en route vers la chambre catalytique du complexe 20S. PA28α peut générer des hexa- ou hepta-homultimères qui s’associent au complexe 20S et l’activent, bien que, moins efficacement que l’hétéromultimère (αβ)3. En revanche, PA28β ne s’associe pas au complexe 20S et n’a pas d’activité stimulante. Le rôle des sous-unités β est probablement de moduler l’activité de PA28 en influençant indirectement l’activité des sous-unités α ou en modifiant l’affinité de la particule PA28 avec le protéasome 20S.

PA28α contient dans sa partie centrale une séquence unique, le motif KEKE qui est un domaine hydrophile composé d’une alternance de résidus Lys chargés positivement et de résidus Glu chargés négativement. Il a été postulé que ce motif, qui n’existe pas dans PA28β, favorise l’interaction protéine-protéine entre les sous-unités α de la particule PA28 et les sous-unités α du protéasome 20S (22). Une analyse mutationnelle a toutefois révélé que la ΔKEKE PA28α conserve son activité stimulatrice (23). La liaison au protéasome 20S nécessite toutefois une terminaison C intacte de la PA28α et pourrait impliquer la sous-unité α C2 du protéasome 20S (8). Il a été suggéré que la phosphorylation active l’activité stimulante de PA28α, cependant, ce mode de régulation n’a pas été fermement établi.

L’analyse mutationnelle de PA28α par Zhang et ses collègues (5) a révélé plusieurs mutations inactivatrices dans une boucle définie à la base de la molécule. Certaines des protéines mutantes se lient étroitement au complexe 20S, mais ne peuvent pas l’activer (5). Ainsi, la liaison au protéasome peut être clairement séparée de l’activité stimulante de PA28. Il est intéressant de noter qu’il y a un grand écart dans la distribution des mutations inactivatrices couvrant les résidus d’acides aminés 51-122. Cette zone sans mutation représente une région qui est unique à chaque sous-unité du complexe PA28. Elle n’est probablement pas impliquée dans l’interaction de PA28 avec le complexe 20S ou dans la stimulation de son activité protéolytique. Elle peut plutôt jouer un rôle dans la fonction de la particule dans la cellule intacte, comme dans sa localisation intracellulaire ou son association avec d’autres composants qui déterminent son activité et ses interactions spécifiques.

Un problème important concerne les rôles physiologiques de PA28. Les deux sous-unités sont nettement induites par l’interféron γ, suggérant un rôle de la particule dans la fonction de traitement des antigènes du protéasome. La surexpression de PA28α dans une lignée de fibroblastes de souris exprimant la protéine pp89 du cytomégalovirus entraîne une amélioration marquée de la reconnaissance par les cellules T cytotoxiques spécifiques de la pp89. De même, la présentation d’une nucléoprotéine de la grippe a également été améliorée (24). Des études dans un système acellulaire ont révélé qu’en utilisant un mécanisme coordonné de double clivage, le complexe PA28-20S-PA28 peut efficacement couper de grands peptides (qui ont des séquences flanquantes sur les extrémités N et C) aux épitopes antigéniques précis reconnus par le complexe CMH et la cellule T cytotoxique appropriée (25). Ainsi, il semble que PA28 joue un rôle important dans le traitement des antigènes pour la présentation sur les molécules du CMH de classe I. Comme le protéasome PA28-20S-PA28 ne peut pas digérer les protéines natives intactes ou ubiquitinylées, il doit agir en aval du protéasome 19S-20S-19S qui dégrade les protéines marquées à l’ubiquitine ou les grands peptides. Il est également possible, bien que cela n’ait pas été démontré, qu’il existe un seul protéasome 19S-20S-PA28 asymétrique capable de réaliser ce processus protéolytique en deux étapes, la protéolyse initiale en grands peptides et l’élagage final. Les protéasomes symétriques ou asymétriques putatifs contenant PA28 peuvent également être impliqués dans la dégradation terminale des peptides en acides aminés libres, une activité qui ne peut être catalysée par le protéasome 19S-20S-19S (Fig. 1). Ainsi, il semble que l’élucidation des rôles cellulaires du complexe PA28 devra attendre de nouvelles expériences.

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