ISH : protocole d’hybridation in situ

Stockage des échantillons

Conservation de l’ARN
La conservation de l’ARN est rendue difficile par la présence de l’enzyme RNase. Cette enzyme se trouve sur la verrerie, dans les réactifs et sur les opérateurs et leurs vêtements. La RNase détruit rapidement tout ARN dans la cellule ou la sonde d’ARN elle-même, les utilisateurs doivent donc s’assurer qu’ils utilisent des techniques, des gants et des solutions stériles pour éviter la contamination de la sonde ou de l’ARN du tissu par la RNase.

Conservation générale des échantillons lors de l’utilisation de coupes congelées
Pour obtenir de meilleurs résultats sur des lames plus anciennes, ne stockez pas les lames à sec à température ambiante. Au lieu de cela, stockez-les dans de l’éthanol à 100% à -20°C, ou dans une boîte en plastique recouverte d’une pellicule saran à -20°C ou -80°C. Un tel stockage permet de conserver les lames pendant plusieurs années.

Choix de la sonde

Sondes d’ARN

Les sondes d’ARN doivent avoir une longueur de 250 à 1500 bases ; les sondes d’environ 800 bases présentent la plus grande sensibilité et spécificité. Les modèles de transcription doivent permettre la transcription des ARN de la sonde (brin antisens) et du contrôle négatif (brin sens). Pour ce faire, clonez-les dans un vecteur avec des promoteurs opposables. Les modèles circulaires doivent être linéarisés avant de fabriquer une sonde, bien que les modèles PCR puissent également être utilisés.

Sondes ADN

Les sondes ADN offrent une grande sensibilité pour l’hybridation in situ. Elles ne s’hybrident pas aussi fortement aux molécules d’ARNm cibles par rapport aux sondes d’ARN, de sorte que le formaldéhyde ne doit pas être utilisé dans les lavages post hybridation.

La spécificité de la sonde est importante. Si la séquence nucléotidique exacte de l’ARNm ou de l’ADN dans la cellule est connue, une sonde complémentaire précise peut être conçue. Si >5% des paires de bases ne sont pas complémentaires, la sonde ne s’hybridera que faiblement à la séquence cible. Cela signifie que la sonde est plus susceptible d’être emportée lors des étapes de lavage et de détection et peut ne pas être correctement détectée.

Protocole d’hybridation in situ de sondes d’ARN marquées à la digoxigénine (DIG)

Ce protocole décrit l’utilisation de sondes d’ARN monocaténaires marquées à la DIG pour détecter l’expression du gène d’intérêt dans des sections incluses en paraffine.

1) Déparaffinisation

Pour les sections congelées, commencez à l’étape 2. Si vous utilisez des sections fixées au formaldéhyde et incluses dans la paraffine, continuez avec cette étape.

Avant de procéder, les lames doivent être déparaffinées et réhydratées. Une élimination incomplète de la paraffine peut entraîner une mauvaise coloration de la section.

Placez les lames dans un portoir et effectuez les lavages suivants :

• Xylène : 2×3 min
• Xylène 1:1 avec éthanol 100% : 3 min
• Éthanol 100% : 2×3 min
• Éthanol 95% : 3 min
• 70 % éthanol : 3 min
• 50 % éthanol : 3 min
• Rincer à l’eau froide du robinet

Garder les lames dans l’eau du robinet jusqu’à la récupération de l’antigène. A partir de ce moment, les lames ne peuvent pas sécher car cela entraînerait une liaison non spécifique des anticorps et une coloration de fond élevée.

2) Récupération de l’antigène

Digérer avec 20 µg/mL de protéinase K dans du Tris 50 mM préchauffé pendant 10-20 min à 37°C. Le temps d’incubation et la concentration en protéinase K peuvent nécessiter une optimisation.

Nous recommandons d’essayer une expérience de titrage de la protéinase K pour déterminer les conditions optimales. Une digestion insuffisante réduira le signal d’hybridation et une digestion excessive entraînera une mauvaise morphologie des tissus, rendant la localisation du signal d’hybridation très difficile. La concentration optimale de protéinase K variera en fonction du type de tissu, de la durée de fixation et de la taille du tissu.

3) Rincer les lames 5 fois dans de l’eau distillée.
4) Immerger les lames dans de l’acide acétique à 20% (v/v) glacé pendant 20 sec. Cela perméabilise les cellules pour permettre l’accès à la sonde et à l’anticorps.
5) Déshydrater les lames en les lavant pendant environ 1 min par lavage dans de l’éthanol à 70%, de l’éthanol à 95% et de l’éthanol à 100%, puis les sécher à l’air.
6) Ajouter 100 µL de solution d’hybridation à chaque lame.

Solution saline (20x)

• 4 M NaCl
• 100 mM EDTA
• 200 mM Tris-HCl pH 7,5
• 100 mM NaH2PO4.2H2O

Solution deenhardt (100x)

• 10 g de Ficoll
• 10 g de PVP (polyvinylpyrrolidine)
• 10 g d’albumine de sérum bovin (BSA)

.

• 500 mL de dH2O stérile

7) Incubez les lames pendant 1 h dans une chambre d’hybridation humidifiée à la température d’hybridation souhaitée. Les températures d’hybridation typiques se situent entre 55 et 62°C.
8) Diluez les sondes dans la solution d’hybridation dans des tubes PCR. Chauffez à 95°C pendant 2 minutes dans un bloc PCR pour dénaturer la sonde ARN ou ADN. Refroidir immédiatement sur glace pour éviter la ré-annexion.
9) Égouttez la solution d’hybridation. Ajoutez 50-100 μL de sonde diluée par section, en couvrant l’ensemble de l’échantillon. Incuber dans la chambre d’hybridation humidifiée à 65°C pendant la nuit. Couvrez l’échantillon avec une lamelle couvre-objet pour éviter l’évaporation.

Pendant cette étape, la sonde d’ARN s’hybridera à l’ARNm correspondant, ou la sonde d’ADN s’hybridera à l’ADN cellulaire correspondant. Optimiser la température d’hybridation en fonction de la séquence de la sonde utilisée, ainsi que du type de cellule ou de tissu. Cette température doit être optimisée pour chaque type de tissu analysé.

La température optimale d’hybridation des sondes dépend du pourcentage de bases présentes dans la séquence cible. La concentration de cytosine et de guanine dans la séquence sont des facteurs importants.

10) Lavages rigoureux

Les paramètres de la solution tels que la température, la concentration en sel et en détergent peuvent être manipulés pour éliminer les interactions non spécifiques.

Pour préparer 1 L de citrate de sodium salin 20x (SSC)

• 175,3 g de NaCl (3 M)
• 88.2 g de citrate de sodium
• 800 mL de dH2O stérile
• Ajuster à pH 5 en utilisant de l’acide citrique, remplir à 1 L et autoclaver

Lavage 1

• 50% de formamide dans 2x SSC
• 3×5 min, 37-45°C

Eliminer l’excès de sonde et de tampon d’hybridation avec des températures plus élevées (jusqu’à 65°C) pendant de courtes périodes. Si on le laisse trop longtemps, cela peut laver une trop grande partie de la sonde hybridée ARN/ADN.

Lavage 2

• 0,1-2x SSC
• 3×5 min, 25-75°C

Cette étape élimine l’hybridation ADN/ARN non spécifique et/ou répétitive.

Suivez ces directives pour optimiser la température et la concentration en sel pour les lavages de rigueur :

• Pour les sondes ADN/ARN très courtes (0.5-3 kb) ou des sondes très complexes, la température de lavage doit être plus basse (jusqu’à 45°C) et la stringence plus basse (1-2x SSC).
• Pour les sondes à locus unique ou de grande taille, la température doit être autour de 65°C et la stringence élevée (inférieure à 0.5x SSC).
• La température et la stringence doivent être les plus élevées pour les sondes répétitives (telles que les répétitions alpha-satellites).

11) Lavez deux fois dans du MABT (tampon d’acide maléique contenant du Tween 20) pendant 30 min à température ambiante. Le MABT est plus doux que le PBS et convient mieux à la détection des acides nucléiques.

Pour préparer un stock de 5 MABT

• 58 g d’acide maléique
• 43,5 g de NaCl
• 55 g de Tween-20
• 900 mL d’eau

Amener le pH à 7,5 en ajoutant de la base Tris. Environ 100 g seront nécessaires. Amener le volume final à 1 L.

12) Séchez les lames.
13) Transférer dans une chambre humidifiée et ajouter 200 µL de tampon de blocage à chaque section (MABT + 2% de BSA, lait ou sérum). Bloquer pendant 1-2 h à température ambiante.
14) Egoutter le tampon de blocage. Ajouter l’anticorps anti-marquage à la dilution requise dans le tampon de blocage. Vérifier la fiche technique de l’anticorps pour connaître la concentration/dilution recommandée. Incuber pendant 1 à 2 h à température ambiante.
15) Laver les lames 5×10 min avec le MABT à température ambiante.
16) Laver les lames 2×10 min chacune à température ambiante avec le tampon de pré-coloration (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2).
17) Pour la détection par fluorescence, passez à l’étape 18. Pour les autres formes de détection, remettez les lames dans la chambre humidifiée et suivez les instructions du fabricant pour le développement de la couleur.

18) Rincer les lames dans de l’eau distillée.
19) Sécher à l’air les lames pendant 30 min. Lavez dans de l’éthanol à 100% et séchez à l’air complètement.
20) Montez en utilisant la solution de montage DePeX.