Génétique de la myasthénie grave : une étude d’association cas-témoin dans la population hellénique

Abstract

La myasthénie grave (MG) est une maladie auto-immune hétérogène caractérisée par la production d’auto-anticorps contre les protéines de la membrane postsynaptique, dans la jonction neuromusculaire. La contribution des facteurs génétiques à la susceptibilité à la MG a été évaluée par des études de familles et de jumeaux, mais le contexte génétique précis de la maladie reste difficile à cerner. Nous avons mené une étude d’association cas-témoins sur 101 patients non apparentés d’origine hellénique et 101 volontaires sains afin d’évaluer l’implication de variantes génétiques communes dans la prédisposition à la MG. Nous nous sommes concentrés sur trois gènes candidats qui ont été clairement associés à plusieurs maladies auto-immunes, afin d’étudier leur implication potentielle dans la pathogenèse de la MG. Il s’agit du facteur 5 de régulation de l’interféron (IRF-5), de la protéine 3 induite par le TNFα (TNFAIP3), également appelée A20, et de l’interleukine-10 (IL-10), des molécules clés dans la régulation de la fonction immunitaire. Une tendance statistique d’association () entre les polymorphismes mononucléotidiques (SNP) du promoteur de l’IL-10 et les sous-groupes de patients atteints de MG à apparition précoce et tardive a été révélée. Aucune différence statistiquement significative n’a été observée pour le reste des variants examinés. À notre connaissance, il s’agit de la première tentative mondiale d’aborder l’association possible entre les variants génétiques communs IRF-5 et TNFAIP3 et la base génétique de la MG.

1. Introduction

La myasthénie grave (MG) est une maladie auto-immune spécifique à un organe, causée par des auto-anticorps dirigés contre des protéines de la membrane postsynaptique, entraînant une altération de la transmission neuromusculaire. Cliniquement, la MG se caractérise par une faiblesse musculaire et une fatigue rapide aggravée par l’exercice et soulagée par le repos. Le principal auto-antigène, chez 80 à 90 % des patients atteints de MG, est le récepteur musculaire de l’acétylcholine (AChR), un canal pentamérique qui assure la médiation de la transduction synaptique à la jonction neuromusculaire. Chez plusieurs des autres patients atteints de MG, des auto-anticorps dirigés contre la tyrosine kinase spécifique du muscle (MuSK) ou contre la protéine 4 liée aux lipoprotéines (LRP4) sont détectés. MuSK et LRP4 forment tous deux un complexe de récepteurs qui se lie à l’agrine, protéoglycane de la matrice extracellulaire, ce qui entraîne un regroupement des AChR, critique pour la fonction de la jonction neuromusculaire.

Bien que la MG soit une maladie qui affecte les deux sexes, à tous les âges et dans toutes les races , les preuves de plusieurs études épidémiologiques ont montré une distribution bimodale du taux d’incidence dépendant du sexe et de l’âge, avec un pic dans les deuxième et troisième décennies de la vie, observé principalement chez les femmes, et le second dans les sixième et septième décennies de la vie survenant principalement chez les hommes . L’observation ci-dessus a conduit à la classification de la MG en deux catégories : la MG précoce, qui apparaît avant 50 ans et qui est généralement liée à une hyperplasie du thymus, et la MG tardive (>50 ans) avec un thymus normal ou atrophique.

L’étendue de la contribution génétique à la susceptibilité à la MG a été évaluée par des études de famille et de jumeaux, reflétant le regroupement familial de la maladie et par la suite l’héritage génétique. Les taux élevés de concordance de la MG observés chez les jumeaux monozygotes par rapport aux jumeaux dizygotes suggèrent fortement l’implication de facteurs génétiques dans la pathogenèse de la MG . En outre, plusieurs études ont rapporté que les patients atteints de MG peuvent être atteints d’une autre maladie auto-immune, le plus souvent des troubles de la thyroïde et de la polyarthrite rhumatoïde. Cette constatation conduit à l’hypothèse d’une perturbation plus généralisée de la fonction immunologique.

Le complexe HLA (human leukocyte antigen) est la région génomique proéminente impliquée dans l’apparition de la MG. Les allèles HLA-A1 et B8 pour la classe I et DR3 pour la classe II constituent un haplotype ancestral appelé « 8.1 » qui a été associé de manière reproductible à l’apparition précoce de la MG et à l’hyperplasie thymique. D’autres recherches orientées vers la dissection de cet haplotype étendu A1-B8-DR3, ont conduit à l’identification du locus MYAS1, une région de 1,2 Mb englobant 36 gènes, à la limite de la classe III et de la région proximale de la classe I, excluant ainsi les loci de la classe II et confirmant l’association prédominante de l’allèle B8 par rapport à celle de DR3 .

En dehors du HLA, un certain nombre de loci génétiques non liés au HLA ont également été étudiés quant à leur implication dans la susceptibilité à la MG. Ces résultats ont principalement été dérivés par des études de gènes candidats, tandis que les gènes qui ont été rapportés comme étant associés ou non à la MG sont discutés en détail dans .

Le facteur 5 de régulation de l’interféron (IFN) (IRF-5) est un membre de la famille des facteurs de transcription IRF. IRF-5 est activé par l’IFN-α/B et régule à la hausse un ensemble de cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-6, le TNF-α et l’IL-12, tandis qu’il induit en outre l’expression du gène de l’IFN. Les résultats de plusieurs études, passés en revue dans , ont impliqué IRF-5 comme un gène de susceptibilité dans le LED. La recherche de variants communs qui influencent les niveaux d’IRF-5 a conduit à l’identification du SNP rs10954213 (c.*555G > A), situé dans la séquence signal polyA+ AATAAA dans le 3′ UTR. L’allèle G perturbe le site de polyadénylation et la transcription se termine loin en aval, produisant ainsi des transcrits d’ARNm IRF-5 plus longs et moins stables . En outre, un variant d’insertion-délétion in-frame de 30 pb (rs60344245) dans le sixième exon d’IRF-5 détermine la formation de deux familles d’isoformes de protéines qui ont une capacité différentielle à initier la transcription des gènes cibles d’IRF-5 .

La protéine 3 induite par le TNFα (TNFAIP3), également connue sous le nom de A20, est une molécule clé dans la régulation par rétroaction négative des réponses dépendantes du NF-κB. L’effet inhibiteur de TNFAIP3 sur la signalisation NF-κB est généré par l’activité coopérative de ses deux domaines d’édition de l’ubiquitine : le domaine de tumeur ovarienne (OTU) N-terminal, responsable de la déubiquitination de la protéine interagissant avec le récepteur 1 (RIP1), une protéine adaptatrice essentielle de la voie de signalisation induite par le TNF, et le domaine contenant un doigt de zinc C-terminal, qui fonctionne comme une ubiquitine ligase E3 favorisant la dégradation protéasomique de RIP1 .

Le SNP rs13207033 (g.137965418G > A), situé dans la région intergénique 6q23, environ 185 kb en amont de TNFAIP3, affecte probablement l’expression du gène par la présence d’éléments ADN régulateurs potentiels . Une autre étude a indiqué qu’un SNP codant non synonyme (c.380T > G, rs2230926) entraînant un changement de phénylalanine en cystéine au niveau du résidu 127 (p.F127C), dans le domaine OTU de la protéine TNFAIP3, est associé au LED chez les individus d’ascendance européenne .

L’interleukine-10 (IL-10) est une cytokine pléiotrope sécrétée par différents types de cellules, comme les cellules T et les cellules de la lignée myéloïde. L’IL-10 a été caractérisée comme une cytokine anti-inflammatoire en raison de ses effets stimulants sur les cellules TH2 et de la suppression simultanée des cellules TH1. En outre, l’IL-10 induit la prolifération et la différenciation des lymphocytes B activés, ce qui entraîne une nouvelle activation de la réponse humorale. Dans la MG auto-immune expérimentale (EAMG), l’administration d’IL-10 a provoqué l’augmentation des niveaux d’anticorps anti-AChR, suggérant un rôle d’aggravation de la maladie de l’IL-10 .

Plusieurs variants ont été remarqués dans la séquence flanquante 5′ du gène humain de l’IL-10. Trois SNP, à savoir, rs45552637 (A/C), rs1800872 (T/C), et rs1800896 (A/G), situés aux positions -592, -819, et -1082, respectivement, déterminent la formation de trois haplotypes (GCC, ACC, et ATA). La position de ces SNP est basée sur la séquence U16720 précédemment publiée, déposée dans la base de données EMBL-EBI. Une étude de Turner et de ses collègues a rapporté la corrélation de ces haplotypes avec la production de la protéine IL-10 in vitro. Plus précisément, le génotype GCC/GCC était associé à une production élevée d’IL-10 induite par la concanavaline A, les génotypes GCC/ACC et GCC/ATA à une production moyenne et les génotypes ACC/ACC, ATA/ATA et ACC/ATA à une faible production d’IL-10.

Dans la présente étude, une approche guidée par des hypothèses a été adoptée afin d’évaluer l’implication de certains variants communs dans la susceptibilité à la MG. Ainsi, nous avons mené une étude cas-témoins de gènes candidats, en nous concentrant sur les gènes ayant un rôle critique dans la fonction du système immunitaire, visant à identifier si les associations précédemment rapportées entre les gènes susmentionnés et d’autres maladies auto-immunes pourraient être vraies pour la MG.

2. matériel et méthodes

2.1. Population étudiée

Un total de 101 patients MG non apparentés, tous d’ascendance hellénique, ont été recrutés dans cette étude. Les échantillons de sang des patients atteints de MG ont été recueillis à l’Institut Pasteur hellénique lors d’une enquête diagnostique de routine. Seuls les patients MG AChR-positifs ont été inclus dans notre étude. Le diagnostic de MG était basé sur la présence d’anticorps anti-AChR dans le sérum du patient, en utilisant un test de radio-immunoprécipitation (RIPA). Nous avons intentionnellement exclu de l’analyse génétique les patients qui ont été identifiés comme positifs pour les auto-anticorps contre MuSK, afin de réduire l’hétérogénéité du groupe d’étude. Bien que les sérums des patients atteints de MG n’aient pas été analysés pour la recherche d’auto-anticorps anti-LRP4, l’absence de ce test ne pose aucun problème d’hétérogénéité dans la population étudiée, en raison de la coexistence rare d’anticorps anti-LRP4 et anti-AChR. Les principales caractéristiques du groupe MG anti-AChR (âge au début de la maladie et sexe) sont résumées dans le tableau 1. Les patients ont donné leur consentement éclairé par écrit. Le groupe témoin était composé de 101 individus sains appariés sur le plan ethnique et du sexe.

2.2. Génotypage

L’ADN génomique de chaque individu a été extrait d’un échantillon de sang veineux périphérique à l’aide du kit QIAamp Blood Midi (Qiagen GmbH, Hilden, Allemagne). Les réactions en chaîne par polymérase (PCR) ont été réalisées avec le kit KAPA2G Fast HotStart ReadyMix (KAPABIOSYSTEMS, Woburn, MA, USA). Les séquences d’amorces sont présentées dans les matériaux supplémentaires en tant que tableau supplémentaire 1 (voir le tableau 1 dans les matériaux supplémentaires disponibles en ligne à http://dx.doi.org/10.1155/2012/484919), tandis que les conditions de réaction sont disponibles sur demande.

L’amplification par PCR et l’analyse par électrophorèse sur gel d’agarose ont été utilisées pour génotyper le variant d’insertion/délétion de 30 pb d’IRF5.

Un test de polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP) basé sur la PCR a été utilisé pour la détection du SNP rs2230926 (T > G) dans TNFAIP3. Les fragments amplifiés de 549 pb ont été digérés avec l’enzyme de restriction Fnu4HI (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) et ont ensuite été analysés par séparation électrophorétique sur gel d’agarose à 2% p/v. L’allèle G crée un site de restriction Fnu4HI, ce qui entraîne la digestion des amplicons en fragments de 319 et 230 pb.

L’identification des génotypes des SNP du promoteur de l’IL-10 a été réalisée par séquençage direct de l’ADN par Sanger. Un fragment de 585 pb, incluant les trois variants, a été amplifié par PCR. Les produits PCR ont été purifiés par le kit de purification PureLink PCR sur colonne (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). La séquence du fragment de 585 pb a été déterminée à l’aide du kit BigDye Terminator chemistry v3.0 sur un séquenceur d’ADN Applied Biosystems (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Les amorces utilisées étaient les mêmes que celles utilisées pour l’amplification de cette région.

Les deux SNP, rs10954213 (A/G) dans l’UTR 3′ de IRF5 et rs13207033 (G/A) situé dans une région intergénique 6q23, ont été génotypés par PCR en temps réel et analyse de la courbe de fusion haute résolution (HRM) sur un cycleur en temps réel RotorGene Q (Qiagen GmbH, Hilden, Allemagne). L’amplification du fragment contenant le SNP d’intérêt a été réalisée à l’aide du kit PCR Type-it HRM (Qiagen GmbH, Hilden, Allemagne), conformément aux instructions du fabricant. Pendant la HRM, la température augmente de 65 à 95°C, avec une vitesse de chauffage de 0,1°C/2 sec, ce qui entraîne la dénaturation des produits PCR et la génération de courbes de fusion, caractéristiques de chaque génotype. Étant donné qu’un changement d’une seule paire de bases entraîne un déplacement significatif de la température de fusion (), le génotypage est basé sur l’analyse des profils de fusion : les homozygotes pour l’allèle A présentent des profils de fusion similaires et avec une plus faible , par rapport aux homozygotes G/G, tandis que les hétérozygotes se différencient par un changement de la forme de la courbe de fusion.

Les contrôles sans gabarit ont été méticuleusement inclus dans tous les processus de génotypage. Les échantillons témoins négatifs et positifs ont été initialement identifiés par séquençage de l’ADN et ont été, par la suite, utilisés dans toutes les méthodes de génotypage. Chaque échantillon a été testé en double, sauf ceux analysés par PCR-RFLP et séquençage de l’ADN.

2.3. Analyse statistique

Les différences dans la distribution des génotypes et les fréquences alléliques entre les cas et les contrôles ont été calculées par analyse ou par le test exact de Fisher.Les valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

3. Résultats

Les distributions des génotypes de tous les variants étaient conformes à l’équilibre de Hardy-Weinberg dans les groupes de patients MG et de contrôle (données non présentées).

Les fréquences alléliques et génotypiques du variant IRF-5 rs60344245 ont montré une distribution analogue dans les groupes dépistés de 101 patients MG et 100 contrôles (). En ce qui concerne le SNP IRF-5 rs10954213, on a constaté que le génotype A/G était un peu plus fréquent chez les patients atteints de MG que chez les témoins (54,8 % contre 45,5 %), mais l’analyse n’a révélé aucune différence significative (). Les fréquences des allèles et des génotypes des deux variants d’IRF-5 sont présentées dans le tableau 2.

La fréquence du génotype TNFAIP3 rs13207033 G/G a montré une augmentation chez les témoins sains (44,6%) par rapport aux patients MG (33,3%). Cependant, l’analyse statistique n’a pas indiqué de différence significative entre les deux groupes (). Dans le cas du SNP codant rs2230926, les génotypes sont distribués de façon similaire chez les 73 patients atteints de MG et les 81 témoins examinés, comme le laisse supposer la valeur . Les fréquences des génotypes du variant rs2230926, tant chez les patients atteints de MG que chez les témoins, sont conformes à celles obtenues à partir d’échantillons d’ascendance européenne (CEU) qui font partie du projet international HapMap. En outre, notre groupe d’étude a présenté des fréquences de génotype rs13207033 qui sont comparables aux fréquences rapportées dans les populations européennes, dans la base de données dbSNP. Les résultats du génotypage des deux variants TNFAIP3 sont résumés dans le tableau 3.

L’âge d’apparition de la maladie a également été évalué en divisant les patients atteints de MG en patients à apparition précoce et tardive. Aucune différence significative dans la distribution des génotypes n’a été détectée entre les deux sous-groupes et le groupe témoin (données non présentées).

L’analyse de la séquence d’ADN de la région promotrice de l’IL-10 a montré que le génotype ACC/GCC était le génotype le plus fréquemment observé à la fois chez les patients atteints de MG et chez les témoins (23,72% et 28%, respectivement), suivi par le génotype de faible sécrétion ATA/ACC, qui a été détecté chez 21,62% du total des MG et 18% des témoins (tableau 4). Cependant, l’étude actuelle n’a pas révélé de différence statistiquement significative dans la distribution du génotype IL-10 entre la cohorte complète de patients atteints de MG (c’est-à-dire la MG totale) et le groupe témoin (). La comparaison entre les sous-ensembles en fonction de l’âge de début de la maladie a montré que le génotype GCC/GCC à forte sécrétion d’IL-10 se trouve à une faible fréquence dans les cas de MG à début précoce (4 %), alors qu’il est surreprésenté dans les cas de MG à début tardif (20 %) (tableau 4). Une tendance statistique d’association () entre la distribution du phénotype IL-10 et les deux sous-groupes de début précoce et tardif a été révélée (Figure 1).

Figure 1

Distribution du phénotype de l’IL-10 dans les sous-groupes de patients atteints de MG à début précoce et tardif.

4. Discussion

La MG est une maladie auto-immune hétérogène avec une prédisposition génétique claire. En plus des loci HLA, plusieurs variantes communes dans les gènes non liés au HLA ont été associées à la susceptibilité à la MG . Un grand nombre de ces gènes associés au risque sont largement distribués parmi diverses maladies auto-immunes, soutenant l’idée que les maladies auto-immunes sont caractérisées par des voies pathogéniques communes. Dans cette étude, nous avons réalisé une étude d’association cas-témoins afin d’examiner la contribution des variantes communes situées dans les gènes IRF-5, TNFAIP3 et IL-10 à la susceptibilité à la MG. Ces gènes ont été considérés comme de bons candidats en raison de leur rôle critique dans la régulation de la réponse immunitaire et de leur implication déjà connue dans le processus auto-immun. Seuls les patients présentant des anticorps anti-AChR dans leur sérum ont été inclus dans l’analyse génétique, car on s’attendait à ce qu’ils représentent un sous-groupe plus homogène que le groupe plus large de MG. Ce sous-groupe a ensuite été divisé en deux entités pathologiques distinctes : les patients atteints de MG à début précoce, comprenant principalement des femmes, et les patients atteints de MG à début tardif, montrant une plus grande proportion d’hommes.

A notre connaissance, il s’agit de la première étude, dans n’importe quelle population, à examiner l’association entre la MG et les variants communs des gènes IRF-5 et TNFAIP3. Selon des études antérieures, passées en revue dans , plusieurs variantes du locus IRF-5 ont été associées de manière reproductible au LED, impliquant IRF-5 comme un gène de susceptibilité dans le lupus. On a découvert que le SNP rs10954213 influence la polyadénylation de l’ARNm, ce qui a pour effet de réduire les niveaux de protéine IRF-5 ; les homozygotes A/A expriment des niveaux d’IRF-5 immunoréactif environ 5 fois plus élevés que les homozygotes G/G . Quant au variant rs60344245, la délétion de 30 pb (GGCCGCCTACTCTGCAGCCGCCCACTCTGC/-) supprime 10 acides aminés de la protéine IRF-5 et altère un domaine riche en proline, acide glutamique, sérine et thréonine (PEST). Dans la famille des protéines IRF, ces domaines participent aux interactions protéiques et provoquent également une dégradation protéolytique rapide. Malgré leur rôle fonctionnel évident, l’étude actuelle n’a pas réussi à démontrer une association significative des variants IRF-5 rs10954213 et rs60344245 avec la MG ( et , respectivement), ce qui suggère que IRF-5 pourrait ne pas être impliqué dans la pathogenèse de la MG.

En outre, les résultats récents des études GWA ont révélé des associations significatives entre les variants du locus humain TNFAIP3 et un large éventail de maladies auto-immunes. Une analyse GWA de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, avec des anticorps anti-peptides nitrullinés, a détecté des preuves solides d’association du SNP rs13207033 avec le développement de la PR . De même, une étude de Musone et de ses collaborateurs a signalé l’association du SNP codant non synonyme rs2230926 avec le LED. Des études fonctionnelles visant à déterminer l’impact biologique du rs2230926 ont démontré que la protéine Cys127 mineure présente une activité inhibitrice réduite. Pourtant, aucune association n’a été observée entre la MG et les SNP rs13207033 () et rs2230926 () de TNFAIP3.

Dans l’ensemble, nos données peuvent indiquer que la MG spécifique à un organe pourrait avoir un fond génétique différent conduisant à sa séparation d’un large groupe de maladies auto-immunes systémiques comprenant le LED et la PR . Une autre explication de l’absence d’association dans notre étude pourrait être liée à la puissance statistique insuffisante en raison de la taille relativement faible des échantillons. Comme on le sait généralement, les variantes communes représentent une proportion modeste du risque génétique concernant les maladies auto-immunes. Dans de tels cas, des milliers d’échantillons peuvent être nécessaires pour détecter un signal d’association qui puisse être distingué du bruit de fond. Cependant, dans les maladies à faible prévalence, comme la MG, le recrutement d’échantillons de grande taille est très difficile. Il convient de mentionner que l’unité de diagnostic de la MG à l’Institut Pasteur hellénique est la seule unité en Grèce qui reçoit et analyse systématiquement des échantillons de sang depuis 1983. Par conséquent, notre collection d’échantillons d’ADN de MG est actuellement la plus importante en Grèce et elle est constamment enrichie par de nouveaux cas.

De plus, malgré la sélection spécifique des patients anti-AChR et leur division en cas de début précoce et tardif, une classification supplémentaire en fonction des anomalies du thymus (thymome ou hyperplasie) aurait pu être informative ; cependant, les données histologiques n’étaient pas disponibles.

Enfin, un résultat inattendu a été l’absence d’association des SNP du promoteur de l’IL-10 avec la MG. Comme ces variants sont présumés se situer dans la région du promoteur de l’IL-10, ils peuvent affecter la liaison des facteurs de transcription qui régulent l’expression de l’IL-10. Une étude récente d’Alseth et de ses collègues, menée sur la population norvégienne, a révélé une association entre le génotype ACC/ACC et le sous-groupe de patients atteints de MG positive aux anticorps anti-titine, tandis qu’une augmentation statistiquement significative de la fréquence ATA/ATA a été observée chez les patients atteints de MG à début précoce. Dans notre groupe de cas de MG helléniques, aucune preuve d’association n’a été détectée, lorsque nous avons comparé la distribution des génotypes entre la cohorte complète de patients atteints de MG et le groupe témoin (). Cependant, le génotype GCC/GCC a révélé une tendance statistique d’association avec la MG, dans les sous-groupes distincts de patients atteints de MG à début précoce et tardif (). Ainsi, d’autres études portant sur des échantillons plus importants pourraient mettre en évidence des associations possibles entre la MG et l’IL-10. Il convient également de noter que les fréquences alléliques d’un SNP donné peuvent varier considérablement d’un groupe ethnique à l’autre. La différence remarquée dans la fréquence du génotype ACC/ACC entre les groupes de contrôle norvégiens et helléniques (3,4% contre 15%) reflète cette condition.

Dans l’ensemble, il s’agit du premier effort, à notre connaissance, pour aborder l’association possible entre les variantes génétiques communes d’IRF-5 et de TNFAIP3 et la base génétique de la MG, dans n’importe quelle population, alors que d’autres études sont nécessaires pour démêler le fond génétique, encore largement inconnu, de la MG.

Remerciements

Les auteurs remercient les patients atteints de MG et les volontaires qui ont participé à notre étude. Anna Kokla et Maria Belimezi de l’Institut Pasteur hellénique sont remerciées pour leur aide dans la collecte d’échantillons de patients atteints de MG. La présente étude a été soutenue financièrement par des subventions de la Commission européenne Fight MG à S. J. Tzartos et GEN2PHEN (FP7-200754) à G. P. Patrinos, avec la participation de fonds du projet Thales (auto-immunité) à S. J. Tzartos et K. Poulas et du projet de collaboration bilatérale Hellas/Turquie (MuSK-myasthénie grave) à K. Poulas.

Matériel supplémentaire

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