ESSAI DE PLAQUE VIRALE

Matériels:

30ml de culture exponentielle de cellules SF9 à 5×105 cellules/ml

6 plaques à puits (2 chacune)

1bouteille de gel d’agarose à 4%

1bouteille de milieu SF-900 (1.3X) milieu

1bouteille stérile

0,5ml de surnageant de baculovirus

100ml SFM

1. Dans des conditions stériles, distribuer 2 ml de suspension cellulaire par puits.

2. Laisser les cellules se déposer au fond de la plaque et incuber, couvert, à RT pendant 1h.

3. Placerle flacon de gel d’agarose dans le bain-marie à 70oC. Placer le flacon vide et le SF-900 (1,3X) dans le bain à 40oC.

4. Après1h d’incubation des plaques à RT, observer les monocouches au microscope inversé pour confirmer la fixation des cellules et la confluence à 50%.

5. Produireune dilution sérielle de huit logs du surnageant viral récolté en diluant séquentiellement 0,5 ml de la dilution précédente dans 4,5 ml de milieu SFM dans des tubes de 12 mldispositifs. Vous devriez conclure avec 8 tubes contenant chacun une dilution de 10-1à 10-8 du stock de virus original.

7. Retirer séquentiellement le surnageant de chaque puits, le jeter, et le remplacer immédiatement par 1ml de la dilution virale respective à chaque puits dupliqué. Incuber pendant 1h àRT.

8. Déplacer les flacons des bains-marie vers la hotte stérile lorsque l’agarose est liquide (20 à 30 min).Distribuer rapidement 30 ml du milieu SF-900 (1,3X) et 10 ml du gel d’agarose à 4% dans le flacon vide et mélanger doucement. Remettez le flacon de recouvrement de plaquage dans le bain-marie à 40oC jusqu’à son utilisation.

9. Après cette seconde incubation de 1h, remettre le flacon d’agarose dilué et les plaques à 6 puits dans la hotte.

10.Séquentiellement(de la haute à la basse dilution), retirer le virus des puits et le remplacer par 2ml d’agarose dilué. Travaillez rapidement pour éviter la dessiccation de la monocouche.Une pipette Pasteur reliée à une pompe à vide élimine facilement les traces d’inoculum.

11.Laissez le gel durcir pendant 10 à 20 min avant de le déplacer.

12.Incubez à 27oC dans un incubateur humidifié pendant 4 à 10 jours.

13.Le recombinantvirus produit des plaques laiteuses/grises de léger contraste visibles sans coloration ou autres méthodes de détection.

14.Surveiller les plaques quotidiennement jusqu’à ce que le nombre de plaques comptées ne change pas pendant deux jours consécutifs.

15.Pour déterminer le titre de l’inoculum employé, une gamme optimale pour compter est de 3 à 20 plaques par puits d’une plaque à 6 puits. Le titre (pfu/ml) peut être calculé par la formule suivante :

16. Superposition de l’agarose avec le colorant rouge naturel :

Préparer une solution d’agarose à 0,5% dans SFM

Ajouter une solution de rouge naturel à une concentration finale de 50mg/ml (diluer le stock de 3,33mg/ml 1:66,6).

Ouvrir 1ml de la solution de colorant à chaque puits (sur une plaque à 6 puits).