Applications émergentes des spores bactériennes en nanobiotechnologie

Les enveloppes des spores sont composées de protéines, ont des réseaux ordonnés de sous-unités protomériques, présentent un auto-assemblage et ont des propriétés protectrices . En tant que formes de vie métaboliquement inactives et dormantes, les spores peuvent survivre indéfiniment dans un état desséché, et en effet, il a été documenté qu’elles ont survécu intactes pendant des millions d’années . La spore peut résister à des températures allant jusqu’à 90°C ainsi qu’à l’exposition à des produits chimiques nocifs. La plupart des bactéries sporulées (mais pas toutes) appartiennent à deux genres principaux, Bacillus et Clostridium. Les spores de Clostridia, contrairement à celles de Bacillus, ne se différencient que dans des conditions anaérobies, ce qui fait de Bacillus le genre le plus propice à l’étude.

Les espèces de Bacillus produisent une seule spore ou endospore (par opposition aux exospores fongiques), à l’intérieur de la cellule bactérienne par un processus de différenciation nécessitant l’action coordonnée de centaines de gènes de développement . Typiquement, les spores matures mesurent 0,8 à 1,2 μm de long et ont une forme sphérique ou ellipsoïdale (voir Figure 1A). L’unique chromosome bactérien est condensé au centre de la spore appelé noyau. Des couches de membrane lipidique et de peptidoglycane modifié entourent le noyau de la spore, mais la structure la plus importante est l’enveloppe de la spore. Cette enveloppe protéique laminée confère à la spore une résistance aux solvants organiques et au lysozyme. Chez Bacillus subtilis, jusqu’à 25 protéines d’enveloppe différentes sont présentes dans deux couches d’enveloppe distinctes (Figure 1B), l’enveloppe interne et l’enveloppe externe, mais chez d’autres espèces, il est prouvé que l’enveloppe est moins complexe et peut dans certains cas n’être constituée que de quelques types de protéines. La structure et l’assemblage du manteau de la spore apparaissent aujourd’hui comme un système modèle permettant de comprendre les processus complexes d’assemblage morphogénétique, à l’instar des études classiques sur l’assemblage du phage T4. La couche externe, dense en électrons, du manteau de B. subtilis est composée de 5 polypeptides principaux, CotA (65 kDa), CotB (59 kDa), CotG (24 kDa), CotC (11 kDa) et CotF (8 kDa). CotA est une oxydase multi-cuivre et peut s’accumuler sous des formes multimériques (observées au microscope) dans les cellules sporulantes de certains mutants défectueux du manteau. On peut supposer que l’oligomérisation et l’auto-assemblage de CotA précèdent son dépôt sur la surface du manteau de la spore. Il a également été démontré que les protéines CotG et CotB interagissent de manière covalente et, de plus, CotG et CotC ont des séquences d’acides aminés extrêmement inhabituelles contenant des répétitions multiples (>13) de 12-13 acides aminés riches en lysines et en tyrosines. En outre, de nombreuses protéines de l’enveloppe de la spore présentent des profils inhabituels, c’est-à-dire des formes multimériques et des masses moléculaires aberrantes, lorsqu’elles sont examinées par SDS-PAGE. Récemment, il a été démontré que l’enveloppe de la spore est en fait flexible et peut s’étendre et se contracter, et que cette caractéristique est essentielle pour la formation de la spore lorsque celle-ci se déshydrate et de même pour la germination lorsque la spore se réhydrate. Cet aspect d’une structure auto-assemblée est particulièrement intéressant et pourrait offrir un certain nombre d’applications futures dans l’administration de médicaments, la nanofabrication et les revêtements de surface.

Endospores bactériennes. Le panneau A montre des endospores de B. subtilis dont l’une est encore retenue dans la « cellule mère » en forme de bâtonnet. Chez B. subtilis, les spores mesurent environ 1,2 μm de long et sont ellipsoïdales. Les spores libérées ont une enveloppe protectrice transparente connue sous le nom de manteau de spore et est composée de pas moins de 25 composants protomères différents assemblés en couches discrètes. Le panneau B montre un fractionnement typique SDS-PAGE (12,5 %) des protéines du manteau de la spore solubilisées révélant les espèces prédominantes.

Ingénierie du manteau de la spore bactérienne

Une stratégie d’ingénierie des spores de Bacillus subtilis pour afficher des antigènes hétérologues sur la surface de la spore a été récemment rapportée et est illustrée dans la figure 2. Un système d’affichage basé sur les spores fournit plusieurs avantages par rapport aux systèmes basés sur l’utilisation de cellules bactériennes, ceux-ci incluent la robustesse de la spore bactérienne permettant le stockage sous forme desséchée, la facilité de production, la sécurité et une plateforme technologique soutenue par des outils étendus pour la manipulation génétique.

L’affichage de la surface des spores en utilisant les protéines de l’enveloppe des spores. La spore de B. subtilis est composée d’un noyau interne (jaune) entouré d’un cortex de type peptidoglycane (en rouge) et d’un manteau protéique subdivisé en une partie interne (gree) et une partie externe (noire). La protéine de fusion, composée d’une partie porteuse (en bleu) et d’une partie passagère (en violet) est exposée à la surface de la spore.

Contrairement à la richesse des informations disponibles sur la façon dont l’expression des gènes contrôle la différenciation d’une cellule en croissance en une spore dormante, on connaît peu les mécanismes d’incorporation des protéines dans le manteau, la nature des composants structurels formant la partie la plus externe du manteau et l’existence éventuelle de motifs d’ancrage. Les premières tentatives d’exposition de protéines hétérologues à la surface des spores se sont concentrées sur deux composants du manteau, CotB et CotC. Dans le cas de CotB, cette protéine du manteau de la spore est connue pour être localisée à la surface, tandis que pour CotC, par rapport aux autres protéines du manteau, cette espèce a une abondance relative élevée. L’observation que ces deux composants de l’enveloppe étaient dispensables pour la formation d’une spore apparemment normale ainsi que pour sa germination, a été une caractéristique positive supplémentaire dans le choix de CotB et CotC comme protéines porteuses potentielles.

Deux antigènes ont été initialement sélectionnés comme protéines modèles à afficher à la surface des spores : i) le fragment C-terminal non toxique de 459 acides aminés de la toxine tétanique (TTFC), un peptide bien caractérisé et hautement immunogène de 51.8 kDa peptide , codé par le gène tetC de Clostridium tetani ; et ii) la sous-unité B de 103 acides aminés de la toxine thermolabile des souches entérotoxiques d’Escherichia coli (LTB), un peptide de 12 kDa, codé par le gène eltB .

CotB comme protéine porteuse

Comme d’autres composants du manteau, CotB a été associé à la couche externe du manteau sur la base de preuves génétiques et ce n’est que récemment qu’une analyse immunocytofluorimétrique réalisée sur des spores intactes a montré que CotB est accessible aux anticorps spécifiques de CotB et donc qu’il est très probablement exposé à la surface des spores .

Le gène de structure CotB, cotB, est sous le double contrôle transcriptionnel de σK et de la protéine de liaison à l’ADN GerE. En conséquence, cotB est transcrit uniquement dans le compartiment de la cellule mère de la cellule sporulante . Une fois synthétisé dans le cytoplasme de la cellule mère, CotB est assemblé autour de la spore en formation d’une manière qui dépend en partie de CotE, CotG et CotH. Par conséquent, CotB et la protéine hétérologue éventuellement fusionnée à elle, ne subissent pas une étape de translocation de la paroi cellulaire, typique des systèmes d’affichage dans d’autres bactéries.

CotB a une moitié C-terminale fortement hydrophile formée par trois répétitions de 27 acides aminés riches en résidus de sérine, lysine et glutamine. Les résidus de sérine représentent plus de 50% de la moitié C-terminale de CotB. Il a été suggéré que les résidus de lysine dans les répétitions de CotB représentent des sites de réticulation intra- ou inter-moléculaire, par analogie avec les protéines du tissu conjonctif que sont le collagène et l’élastine. La protéine CotB a une masse moléculaire déduite de 46 kDa, mais migre sur SDS-PAGE comme un polypeptide de 59 kDa. Récemment, la divergence entre le poids moléculaire mesuré et déduit a été expliquée en montrant que CotB est initialement synthétisé comme une espèce de 46 kDa, et converti en un homodimère de 59 kDa , qui conserve à la fois les extrémités N- et C-terminales prédites à partir de la séquence nucléotidique cotB.

La stratégie pour obtenir des spores recombinantes de B. subtilis exprimant CotB-TTFC ou CotB-LTB à leur surface était basée sur (i) l’utilisation du gène cotB et de son promoteur pour la construction de fusions translationnelles et (ii) l’intégration chromosomique des fusions des gènes cotB-tetC et cotB-eltB dans la séquence codante du gène non essentiel amyE (Figure 3A) . Le fait de placer les protéines de fusion sous les signaux transcriptionnels et traductionnels de cotB a permis d’assurer un timing correct de l’expression pendant la sporulation, tandis que son intégration chromosomique a garanti la stabilité génétique de la construction. En raison du manque d’informations sur l’assemblage du manteau de CotB et sur les exigences des motifs d’ancrage, les premières tentatives ont été effectuées en positionnant la protéine passagère à l’extrémité C-terminale, à l’extrémité N-terminale ou au milieu de CotB (Fig. 3B).

Système d’affichage sur surface de pore chez B. subtilis . (A) Vue schématique de l’intégration des fusions de gènes sur le chromosome. Les barres rouges représentent la fusion de gènes, les barres grises et vertes représentent respectivement le gène amyE non essentiel de B. subtilis utilisé comme site d’intégration et le gène chloramphénicol acétyl transférase (cat) utilisé comme marqueur de sélection. (B) Représentation schématique des protéines de fusion utilisant soit la longueur totale de CotB (380 acides aminés), soit CotBΔ105 (275 acides aminés), soit CotC (66 acides aminés) comme protéines porteuses (toutes en bleu). Les trois répétitions de 27 acides aminés de la longueur totale de CotB et la partie restante dans CotBΔ105 sont en noir. Les barres violettes représentent la partie hétérologue des fusions (TTFC ou LTB).

Lorsque TTFC et LTB ont été fusionnées à l’extrémité C-terminale de CotB, les protéines chimériques n’ont pas réussi à s’assembler correctement à la surface des spores (Isticato et Ricca, non publié). Ces échecs initiaux ont été attribués à une instabilité potentielle des constructions, soit au niveau de l’ADN (séquences d’ADN répétitives), soit au niveau de la protéine. Afin de contourner ces problèmes, TTFC et LTB ont été fusionnés à l’extrémité C-terminale d’une forme de CotB supprimée des trois répétitions de 27 acides aminés, CotBΔ105-TTFC (Fig. 3A). Contrairement à la version complète, la protéine chimérique CotBΔ105-TTFC était correctement assemblée et exposée à la surface des spores. Un dot blot quantitatif a montré que chaque spore recombinante exposait une quantité de protéine de fusion CotBΔ105-TTFC égale à 0,00022 pg, ce qui permet de conclure que 1,5 × 103 molécules chimériques sont présentes à la surface de chaque spore recombinante .

Contrairement à CotBΔ105-TTFC, CotBΔ105-LTB n’était pas correctement assemblée. La souche exprimant cette chimère a montré des efficacités de sporulation et de germination réduites et ses spores n’étaient pas résistantes au lysozyme. Ces observations, ainsi que l’analyse SDS-PAGE des protéines d’enveloppe libérées, ont suggéré que la présence de CotBΔ105-LTB modifiait fortement la couche d’enveloppe des spores. Une analyse in-silico a montré une certaine homologie entre le produit chimérique (dans la région de fusion) et LytF, une endopeptidase associée à la paroi cellulaire produite par B. subtilis pendant la croissance végétative, ce qui soulève la possibilité que le produit chimérique puisse interférer avec la formation correcte du manteau en dégradant certains composants du manteau (Mauriello et Ricca, données non présentées).

En plus de la fusion à l’extrémité C-terminale décrite ci-dessus, la protéine passager modèle TTFC a été fusionnée également à l’extrémité N-terminale et au milieu de CotB (figure 3B). Dans les deux cas, la forme CotBΔ105 de CotB a été utilisée pour éviter les problèmes rencontrés avec la fusion C-terminale (voir ci-dessus). Les fusions N-terminales et en sandwich ont donné naissance à des produits chimériques qui étaient correctement assemblés dans la structure du manteau, tant du point de vue qualitatif que quantitatif. Au moins dans le cas de CotB, il était alors possible de conclure que là où la protéine passagère est exposée, elle n’affecte pas l’affichage sur la surface des spores.

CotC comme protéine porteuse

CotC est un composant de 12 kDa, soluble dans les alcalis, du manteau des spores de B. subtilis, précédemment identifié par génétique inverse et ensuite associé à la couche externe du manteau sur la base de preuves génétiques . CotC a été initialement considéré comme un candidat porteur en raison de son abondance relative dans le manteau (Figure 1B). Avec CotG et CotD, CotC représente environ 50 % du total des protéines solubilisées du manteau. De telles quantités relativement élevées pourraient permettre l’assemblage d’un nombre significatif de chimères basées sur CotC sur le manteau, assurant ainsi un affichage hétérologue efficace. L’expression du gène cotC est sous le contrôle du facteur σ spécifique de la cellule mère σK et des régulateurs transcriptionnels GerE et SpoIIID. Comme dans le cas de CotB, CotC est également transcrit dans la cellule mère et son assemblage sur le manteau ne nécessite pas de translocation membranaire. Le produit primaire du gène CotC est un polypeptide de 66 acides aminés extrêmement riche en résidus de tyrosine (30,3%) et de lysine (28,8%) . Cependant, il a été récemment démontré que la CotC est assemblée en au moins quatre formes protéiques distinctes, dont la taille varie entre 12 et 30 kDa . Deux d’entre elles, ayant des masses moléculaires de 12 et 21 kDa et correspondant très probablement à une forme monomère et homodimère de CotC respectivement, sont assemblées sur la spore en formation juste après leur synthèse, huit heures après le début de la sporulation. Les deux autres formes, 12,5 et 30 kDa, sont probablement les produits de modifications post-traductionnelles des deux autres formes, se produisant directement sur la surface du manteau pendant la maturation de la spore.

Dans le cas de CotC, seules des fusions C-terminales ont été construites jusqu’à présent (Figure 3B). Les fusions de gènes CotC-TTFC et CotC-LTB ont été obtenues en clonant tetC ou eltB dans le cadre du dernier codon cotC sous le contrôle transcriptionnel et traductionnel de la région du promoteur cotC. La fusion de gènes a ensuite été intégrée dans le chromosome de B. subtilis au locus amyE par double recombinaison croisée (Figure 3A). Ces deux protéines chimériques ont été assemblées sur le manteau des spores recombinantes sans effet majeur sur la structure et/ou la fonction des spores, puisqu’elles sont apparues identiques aux spores de type sauvage en termes d’efficacité de sporulation et de germination et de propriétés de résistance. Le Western blot, l’analyse cytofluorimétrique et, pour CotC-TTFC, la microscopie à immunofluorescence (Figure 4) ont montré que les deux chimères basées sur CotC étaient affichées à la surface des spores recombinantes. Une détermination quantitative des protéines recombinantes exposées sur les spores de B. subtilis a révélé que ca. 9,7 × 102 et 2,7 × 103 molécules de CotC-TTFC et CotC-LTB, respectivement, ont été extraites de chaque spore.

Détection de la présence de CotC-LTB et CotC-TTFC par microscopie à immunofluorescence. La sporulation des souches de B. subtilis a été induite par la méthode de remise en suspension, et des échantillons ont été prélevés 6 h après le début de la sporulation et analysés par microscopie à immunofluorescence comme décrit précédemment . Les échantillons ont été marqués avec un anticorps anti-LTB de souris suivi d’un conjugué IgG-TRITC anti-souris (fluorescéine rouge, Panneaux A & B), ou un anticorps anti-TTFC de lapin suivi d’un conjugué IgG-FITC anti-lapin (fluorescéine verte, Panneaux C & D). Panneaux A & C, spores de type sauvage ; Panneau B, spores isogéniques exprimant CotC-LTB) ; Panneau D, spores isogéniques exprimant CotC-TTFC.

Bien que CotC semble plus abondant que CotB dans le manteau, des quantités comparables de protéines hétérologues sont exposées par les systèmes basés sur CotC et CotBΔ105. Ce résultat était quelque peu inattendu, puisque CotC semble être beaucoup plus abondant que CotB dans le manteau. Une explication possible vient de la découverte récente que l’extrémité C-terminale de CotC n’est pas seulement essentielle pour l’interaction avec d’autres molécules de CotC, mais aussi avec d’autres composants du manteau (Isticato et Ricca, manuscrit en préparation) et montre donc que l’utilisation de CotC comme support doit encore être optimisée.

Stabilité des protéines affichées par les spores

L’une des principales raisons de proposer l’utilisation de la spore bactérienne comme système d’affichage favorable est sa stabilité bien documentée. Les spores peuvent être simplement stockées à température ambiante pendant une longue période sans réduction de leurs propriétés de résistance et de stabilité. Il s’agit d’une propriété extrêmement utile pour toute une série d’applications biotechnologiques. À titre d’exemple, si la protéine passagère est un antigène, la spore recombinante pourrait devenir un vaccin oral thermostable idéal pour une utilisation dans les pays en développement, où la thermostabilité est la plus préoccupante en raison de la mauvaise distribution et du stockage.

Cependant, alors que la stabilité des spores est bien documentée , la stabilité des protéines hétérologues exposées à la surface des spores n’a été étudiée que récemment. Des spores exprimant CotBΔ105-TTFC (voir ci-dessus) et des spores parentales ont été stockées à -80°C, -20°C, +4°C et à température ambiante et analysées à différents temps de stockage jusqu’à 12 semaines. Dans tous les cas, la quantité de protéine hétérologue présente à la surface des spores recombinantes est apparue identique entre les spores fraîchement préparées et celles stockées jusqu’à 12 semaines (Fig. 5). Ces résultats, indiquant que les protéines hétérologues peuvent être exposées de manière stable à la surface des spores recombinantes, confirment le système à base de spores comme une approche d’affichage très prometteuse qui pourrait surmonter certains inconvénients d’autres systèmes et qui pourrait trouver des applications dans une variété de domaines biotechnologiques divers.

Analyse par transfert de points des protéines extraites des spores de type sauvage et des spores exposant la chimère CotBΔ 105 -TTFC. Des spores fraîchement purifiées exprimant la chimère CotBΔ105-TTFC (t0) ou après 4, 8 ou 12 semaines (t4, t8 et t12) de stockage à température ambiante ont été examinées par dot blotting des protéines extraites du manteau des spores. Les concentrations de TTFC purifié (en nanogrammes) et de protéines de revêtement (en microgrammes) sont indiquées. Les protéines ont été chargées et ont réagi avec des anticorps monoclonaux anti-TTFC (Boeringher), puis avec des anticorps secondaires conjugués à la phosphatase. Des signaux d’intensité similaire ont été obtenus avec des spores fraîchement purifiées et des spores stockées à température ambiante jusqu’à 12 semaines.

Preuve de principe pour la vaccination orale en utilisant le tétanos comme maladie modèle

Des spores exprimant CotBΔ105-TTFC ont été utilisées pour immuniser des souris par voie orale . Les IgG sériques et les sIgA fécaux ont montré une séroconversion claire au TTFC. Le programme d’administration a utilisé trois séries de trois doses (1,67 × 1010) sur 5 semaines et était basé sur des régimes optimisés pour les immunisations orales. Les titres d’IgG spécifiques du TTFC après 33 jours (>103) suggéraient qu’ils étaient à des niveaux protecteurs et que les souris exposées à une toxine tétanique correspondant à 10 LD50 étaient totalement protégées. Sur huit souris exposées à une dose de 20 LD50, sept ont survécu, ce qui suggère qu’il s’agit du seuil de protection. Une étude similaire a été réalisée en utilisant l’immunisation nasale avec des spores CotB-TTFC mais avec une dose plus faible et trois immunisations. Dans ce cas, les réponses IgG spécifiques au TTFC étaient plus faibles mais montraient toujours une séroconversion. Ces études montrent que des spores modifiées exprimant un antigène hétérologue peuvent être utilisées pour une immunisation protectrice. De plus, bien que les réponses muqueuses ne soient pas importantes pour la protection contre Clostridium tetani (un agent pathogène systémique), elles sont manifestement importantes pour les agents pathogènes des muqueuses. D’autres études seront nécessaires pour optimiser les régimes de dosage (moins de doses et moins de spores) mais ces études séminales ont ouvert la voie au développement contre des agents pathogènes spécifiques des muqueuses. Bien que ces études soient encourageantes et démontrent des réponses humorales, il n’y a pas encore de preuves claires indiquant des réponses cellulaires. Cependant, il a été démontré que les spores se disséminent dans le GALT et se retrouvent dans les plaques de Peyer (PP) et les ganglions lymphatiques mésentériques. La petite taille de la spore (1 μm) lui permettrait d’être prise en charge par les cellules M et transportée vers le PP où elle pourrait interagir avec les cellules présentatrices d’antigènes. Les premières études ont montré que les spores peuvent germer et persister pendant une courte période dans les macrophages intestinaux, ainsi que déclencher des cytokines Th 1 in vivo telles que l’IFN-γ .

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