Apoenzyme
On octobre 24, 2021 by admin5.11.3 Rôle de la protéine-Interactions entre l’enzyme, le coenzyme et le substrat
Dans tous les cas, le coenzyme est lié à l’apoenzyme sans changement profond du spectre d’absorption. Cette observation suggère que l’enzyme ne déforme pas l’anneau corrine de sa conformation en solution à l’état fondamental. Cependant, aucune information sur l’identité du ligand α-axial n’est disponible à partir du spectre d’absorption UV-visible du complexe coenzyme-protéine. Des études ont montré que le ligand α-axial 5,6-diméthylbenzimidazole est remplacé par une chaîne latérale histidine de la protéine respective dans au moins trois enzymes dépendantes de la cobalamine : la méthionine synthase,4,7 la méthylmalonyl-CoA mutase,8,45,46 et la glutamate mutase47. En revanche, le ligand 5,6-benzimidazole de la cobalamine occupe toujours la position de ligand α-axial dans l’AdoCbl lié à la diol déshydrase48 et à la ribonucléotide réductase (voir chapitre 5.08).
Pour permettre la coordination par la chaîne latérale de l’histidine, la » boucle nucléotidique » de la base 5,6-diméthylbenzimidazole, du ribofuranosylphosphodiester et de la chaîne latérale du propionamide doit s’écarter du cycle corrine et s’insérer dans une poche de liaison à l’intérieur de la protéine. La séquence consensus DxHxxG a été identifiée dans les enzymes cobalaminodépendantes qui substituent une chaîne latérale histidine au ligand α-axial.7,49,50 L’histidine qui se coordonne à l’atome de cobalt interagit très certainement avec le résidu aspartate par une liaison hydrogène. Au-delà du rôle de ligand coordinateur, la fonction exacte de la dyade His/Asp en tant que modulateur de l’activité enzymatique n’est pas encore claire.49 D’autres résidus du site actif peuvent également participer à un réseau étendu de liaisons hydrogène pour contrôler la réactivité au niveau du centre métallique7.
Les enzymes dépendantes de l’adénosylcobalamine doivent augmenter le taux d’homolyse de la liaison CoC par au moins un facteur de 1012 pour atteindre le taux de catalyse observé.14 La labilisation de l’adénosylcobalamine exige l’affaiblissement de la liaison CoC pour permettre la fission homolytique. Bien que ce concept ne soit pas prouvé dans les enzymes dépendantes de la cobalamine, l’énergie suffisante pour déformer (affaiblir) la liaison CoC pourrait facilement provenir de l’utilisation de l’énergie de liaison excédentaire qui est dérivée des multiples interactions de liaison hydrogène avec le cofacteur cobalamine, y compris les chaînes latérales amides qui décorent le cycle corrine.51 Les chaînes latérales amides sont également des éléments de reconnaissance importants pour la liaison aux protéines de transport non enzymatiques de la cobalamine, la transcobalamine, l’haptocorrine et le facteur intrinsèque.52 L’élimination ou la dérivatisation chimique de chaînes latérales amides spécifiques modifie la liaison à la transcobalamine de 3 à 40 fois52 et l’élimination complète de la chaîne latérale c-amide permet l’introduction d’une double liaison supplémentaire dans le squelette macrocyclique, aplatissant ainsi le cycle corrine avec un déplacement vers le rouge du maximum d’absorption qui l’accompagne53.
En plus de favoriser la réaction désirée, les enzymes dépendantes de l’adénosylcobalamine remplissent une deuxième fonction importante en empêchant les réactions secondaires indésirables qui accompagnent souvent les réactions radicalaires.54 Cette fonction de catalyse négative54 exige une surface d’énergie libre hautement contrainte qui pourrait être envisagée comme un profond canyon à travers lequel la réaction progresse le long de la surface d’énergie libre. Ce canyon doit présenter des parois abruptes pour empêcher les réactions secondaires et contraindre l’intermédiaire radicalaire hautement réactif. À la fin de la séquence réactionnelle, l’intermédiaire radicalaire est éteint par recombinaison du radical 5′-désoxyadénosyle et du cob(II)alamine, régénérant ainsi l’état fondamental (état de repos) du cofacteur adénosylcob(III)alamine. Si l’enzyme investit 25 kcal mol-1 pour promouvoir l’homolyse de la liaison C-Co afin de commencer le cycle catalytique, cette énergie doit être récupérée à la fin de la séquence réactionnelle. La récupération de l’énergie ne serait pas possible si une séquence indésirable de réarrangements se produisait pour produire un radical thermodynamiquement plus stable que le radical 5′-désoxyadénosyle. Par conséquent, l’enzyme doit empêcher le radical alkyle de se réarranger en un intermédiaire de faible énergie, ou de migrer à travers l’échafaudage protéique pour former un radical stable qui ne peut pas participer à la catalyse.55
Une espèce paramagnétique ne se forme pas tant que tous les composants de la réaction ne sont pas présents dans le complexe enzyme-substrat, car la formation d’un radical dérivé d’un coenzyme en l’absence de substrat pourrait entraîner des réactions secondaires indésirables. Des expériences de RPE avec la méthylmalonyl-CoA mutase46,55 confirment que l’homolyse de la liaison CoC ne se produit qu’après l’addition du substrat, comme l’indique l’apparition d’un signal RPE semblable à celui du produit.46 De même, des expériences de spectrophotométrie à flux arrêté avec l’éthanolamine ammoniaque lyase montrent que la signature de la cob(II)alamine n’apparaît dans le spectre visible qu’après l’association de l’enzyme et du coenzyme avec des niveaux saturants de substrat56.-59
La photolyse, la thermolyse et l’homolyse favorisée par l’enzyme de la liaison CoC de l’adénosylcobalamine aboutissent à la paire de radicaux singuliers constituée de cob(II)alamine et du radical 5′-désoxyadénosyle.60,61 Comme tous ces processus conduisent à la formation de la même paire de radicaux, les informations provenant de la dynamique de réaction des études de photolyse peuvent être reliées aux mécanismes de réaction enzymatique proposés. La photomolyse de l’adénosylcobalamine commence par une promotion électronique π → π* dans le cycle corrine et doit impliquer un état intermédiaire de transfert de charge sur le chemin de l’homolyse de la liaison CoC60,61. Les études de photolyse picoseconde de l’adénosylcobalamine révèlent des taux de recombinaison des paires de radicaux géminés de 109 s-1, avec des efficacités de recombinaison fractionnelle de la cage, Fc, d’environ 94 %.42,62-64 Les études de photolyse nanoseconde et à ondes continues des cobalamines confirment une recombinaison efficace des paires de radicaux dans la cage géminée, avec un rendement quantique photochimique global d’environ 20 % pour l’adénosylcobalamine et 35 % pour la méthylcobalamine.65,66 En l’absence d’enzyme, une grande fraction des paires de radicaux géminés se recombine avant qu’une séparation diffusionnelle significative ne se produise. Pour stabiliser le radical 5′-déoxyadénosyle et favoriser la catalyse, l’enzyme doit augmenter la distance de séparation des paires de radicaux, probablement par un changement de conformation. Quel que soit le mécanisme, le taux élevé de recombinaison géminée dans la paire de radicaux exige qu’une des fonctions de l’enzyme soit de séparer les radicaux ou de piéger temporairement un des radicaux pour empêcher une recombinaison prématurée.
Bien que les paires de radicaux singlet {5′-deoxyadenosyl radical:cob(II)alamin} résultantes aient des états électroniques identiques,59-61,67 l’homolyse enzymatique de la liaison CoC ne peut pas accéder à un état électronique excité et doit commencer par un autre processus pour affaiblir la liaison CoC et déplacer l’équilibre vers la dissociation (voir section 5.11.2). Le clivage induit par la contrainte entraînera non seulement l’homolyse de la liaison CoC, mais ce processus augmentera également la distance de séparation des paires radicalaires si une composante de la distorsion se produit le long de l’axe apical du cobalt. Cette approche de force brute d’étirement de la liaison CoC peut être la méthode la plus efficace pour obtenir à la fois l’homolyse et une diminution nette du taux de recombinaison des paires de radicaux.
Il est également possible que l’enzyme renforce la liaison CoC et défavorise l’homolyse en comprimant l’interaction apicale Co-α-N. Les propriétés thermodynamiques des analogues + et + de l’adénosylcobinamide ont été étudiées.68 Une liaison CoC plus forte a été observée dans + avec une distance de liaison CoN plus courte par rapport à la pyridine comme base α-axiale. La liaison CoC plus forte conduit à un changement significatif vers l’hétérolyse comme voie préférée. Dans ce système modèle, l’enzyme étudiée, la méthylmalonyl-CoA mutase, doit soit empêcher l’hétérolyse CoC, soit suivre une voie hétérolytique.68
Dans la méthionine synthase, la portion corrine de la cobalamine est prise en sandwich entre deux domaines d’un fragment de 27 kDa, la queue du nucléotide pénétrant dans une poche profonde formée par les résidus du domaine C-terminal.7,69,70 Cette séquence contient une région d’hydrophobie modérée qui est flanquée de segments hydrophiles étendus.71 Des similitudes structurelles sont attendues parmi les domaines qui s’interfacent avec l’anneau de corrine. Le domaine α/β qui se lie à la moitié inférieure de l’anneau de corrine et qui accueille la queue nucléotidique étendue (fragment phosphodiester et groupe 5,6-diméthylbenzimidazole) dans la méthionine synthase et la méthylmalonyl-CoA mutase est également attendu dans la glutamate mutase (vide infra).
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