AmpC β-Lactamase CITM et gènes DHAM à médiation plasmidique parmi les isolats cliniques Gram-négatifs

Background

La résistance aux médicaments parmi certaines des bactéries Gram-négatives (Enterobacterales, Acinetobacter baumannii, et Pseudomonas aeruginosa) a émergé et s’est répandue dans le monde entier. Parmi la famille des Enterobacterales, Escherichia coli et Klebsiella spp. sont des organismes fréquemment isolés qui présentent des propriétés notables de résistance aux médicaments. Les β-lactamines sont les médicaments couramment prescrits contre ces souches récalcitrantes, et constituent à elles seules environ deux tiers des prescriptions cliniques récentes.Ce groupe contient quatre grandes classes chimiques : les pénicillines, les céphalosporines, les carbapénèmes et les monobactames, dans lesquelles les carbapénèmes sont utilisés comme médicaments de dernier recours dans le traitement empirique contre les souches pathogènes de bactéries à Gram positif, à Gram négatif et anaérobies2.

La résistance aux β -lactamines est attribuable à la production de β-lactamases, ces enzymes hydrolytiques capables d’inactiver les antibiotiques avant qu’ils n’atteignent les protéines de liaison à la pénicilline (PBP) situées sur la membrane cytoplasmique.3 Les principales familles de β-lactamases comprennent les β-lactamases à spectre étendu (BLSE) à médiation plasmidique, les AmpC, les céphalosporinases et les carbapénémases. Toutes les classes ont été détectées dans le monde entier, quelques-unes étant concentrées dans des pays spécifiques.1

Les gènes codant pour la β-lactamase AmpC se sont largement répandus et sont largement détectés dans les plasmides bactériens. Le premier variant AmpC codé par un plasmide a été identifié pour la première fois en 1989 à partir de Klebsiella pneumoniae isolé en Corée du Sud. Il a été nommé CMY-1 en raison de son trait phénotypique associé à la céphamycinase et était notoirement résistant à la céfoxitine.4,5 En peu de temps, de nombreuses familles de variants AmpC à médiation plasmidique ont été détectées, principalement à partir d’isolats de K. pneumoniae et E. coli. Les bactéries possédant des génotypes d’AmpC à médiation plasmidique ont été attribuées sur la base de l’homologie dans la séquence d’acide nucléique, formant un plus grand nombre de genres bactériens qui ont agi comme une source de ces plasmides et un certain nombre de familles d’AmpC6. À ce jour, les familles d’AmpC suivantes ont été signalées dans le monde entier : deux familles de β-lactamases CMY (CMY-1 et CMY-2) isolées respectivement d’Aeromonas hydrophila et de Citrobacter freundii ; les enzymes de type FOX et de type MOX isolées d’Aeromonas spp.la famille ACC dérivée de H. alvei ; la famille LAT des céphalosporinases isolée de C. freundii ; les familles MIR et ACT provenant d’Enterobacter spp. et la famille DHA isolée de Morganella morganii.4,6,7 La majorité des gènes AmpC codés par plasmide sont présents dans les isolats d’E. coli et de K. pneumoniae lors d’infections nosocomiales, tandis que la résistance d’autres bactéries à Gram négatif comme E. cloacae, C. freundii, S. marcescens et M. morganii est conférée par des β-lactamases AmpC à médiation chromosomique, ce qui renforce la résistance aux céphalosporines à large spectre8. Les organismes produisant des BLSE souvent caractérisés par la co-expression avec des β-lactamases AmpC constituent une menace sérieuse dans le diagnostic et le traitement des agents pathogènes.

De plus, les gènes de β-lactamase AmpC, en particulier MOXM, CITM, DHAM, EBCM, FOXM et ACCM sont responsables du développement de la résistance à large spectre à la plupart des β-lactamines (autres que le céfépime et les carbapénèmes). En outre, l’acquisition de ces gènes dans les bactéries peut renforcer la résistance car les inhibiteurs des enzymes de classe A (notamment l’acide clavulanique, le sulbactam et le tazobactam) et le p-chloromercuribenzoate ne sont pas efficaces contre les β-lactamases AmpC, bien que certaines d’entre elles puissent être inhibées par le tazobactam ou le sulbactam6.

Bien que des efforts soient faits pour freiner la croissance et la propagation des pathogènes résistants aux médicaments, les études sur les β-lactamases AmpC dans les milieux à ressources limitées sont encore insuffisantes. L’étape la plus importante pour faire face à l’augmentation de la résistance aux antimicrobiens (RAM) est la détection précise des souches pathogènes (et/ou résistantes) dans les laboratoires de diagnostic. Néanmoins, les protocoles de laboratoire pour les rapports de routine n’offrent pas de résultat précis au Népal car les β-lactamases AmpC sont difficiles à identifier par des tests phénotypiques seuls et sont souvent détectées à tort comme des BLSE dans les laboratoires cliniques. Les isolats d’Enterobacterales qui sont positifs dans le test de dépistage du phénotype BLSE mais négatifs dans le test de confirmation sont généralement considérés comme des producteurs potentiels d’AmpC β-lactamases, soit conférés par dépression chromosomique, soit par transfert de plasmide.9

Même les microbiologistes cliniques experts ne parviennent pas à identifier l’AmpC β-lactamase à médiation plasmidique, ce qui suggère la nécessité d’une méthode plus précise et spécifique pour la détection rapide. Cependant, certaines de ces procédures sont gourmandes en ressources et nécessitent souvent des réactifs qui ne sont pas facilement disponibles.10 Pour ces raisons, les β-lactamases AmpC ne sont pas détectées dans les spécimens cliniques. Ainsi, un protocole de laboratoire plus fiable et valide consistant en une réaction en chaîne par polymérase multiplex (PCR) a été conçu pour faciliter le diagnostic des gènes AmpC codés par plasmide qui est responsable de l’expression de la β-lactamase AmpC dans diverses infections cliniques.11

La plupart des études se concentrent sur la prévalence des enzymes BLSE dans les isolats cliniques Gram-négatifs au Népal.12-16 Il existe un nombre limité d’études sur les enzymes β-lactamases AmpC dans les bactéries Gram-négatives au Népal. Une étude menée dans la vallée de Katmandou a rapporté que 27,8% des isolats d’Enterobacterales étaient des producteurs de β-lactamases AmpC en utilisant la méthode phénotypique.17 A notre connaissance, il existe peu d’études liées à la détection et à la caractérisation des enzymes β-lactamases AmpC chez les bactéries Gram-négatives en utilisant les méthodes phénotypiques et génotypiques au Népal. Il est essentiel de mettre en place des méthodes phénotypiques et génotypiques standard pour les tests de sensibilité aux antibiotiques afin de dépister les pathogènes résistants aux médicaments dans les hôpitaux. Cette étude a été entreprise pour isoler et identifier les gènes des β-lactamases AmpC (blaCITM et blaDHAM) dans les isolats bactériens Gram négatif en utilisant à la fois le dépistage phénotypique et les méthodes de confirmation.

Méthodes

Plan d’étude

Il s’agit d’une étude transversale en milieu hospitalier réalisée de juin 2017 à janvier 2018 à l’Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences (ANIAS). Un total de 1151 échantillons cliniques non dupliqués ont été collectés et ont été traités pendant la période d’étude. Les échantillons comprenaient de l’urine (n=412), du sang (n=206), l’extrémité d’un cathéter (n=163), du pus (n=132), des selles (n=89), du LCR (n=53), un écouvillon de plaie (n=58) et un écouvillon vaginal (n=38). Les échantillons ont été obtenus dans un récipient stérile, bien étiqueté et étanche, et traités dès que possible.18 Tous les patients en visite suspectés d’avoir une infection bactérienne et ayant donné leur consentement ont été inclus dans l’étude. Les participants à l’étude ayant des informations démographiques inadéquates ont été exclus.

Culture des échantillons et identification des isolats

Les échantillons ont été collectés conformément aux directives microbiologiques standard pour la collecte d’urine, de selles, de pus, de sang, de LCR et d’embout de cathéter. Les échantillons admissibles ont ensuite été inoculés sur une gélose au sang (BA), une gélose au chocolat (CA) et une gélose MacConkey (MA). En outre, les échantillons d’urine ont été inoculés dans la gélose Chromogenic UTI. Les isolats ont été identifiés en utilisant des paramètres microbiologiques standard tels que l’apparence morphologique des colonies, les réactions de coloration et les propriétés biochimiques.19,20

Tests de sensibilité aux antibiotiques

Tous les isolats Gram-négatifs identifiés ont ensuite été soumis à un test de sensibilité aux antimicrobiens in-vitro en utilisant la méthode modifiée de diffusion sur disque de Kirby-Bauer.21 Tout d’abord, les inoculums ont été faits en transférant les colonies bactériennes de la gélose nutritive à une solution saline normale stérile. La turbidité des inoculums a été fixée à l’équivalent de 0,5 McFarland standard, conformément aux directives du CLSI. La culture sur tapis des inoculums testés a également été préparée sur de la gélose Muller-Hinton (MHA). Des disques d’antibiotiques (HiMedia India Pvt. Ltd, Bengaluru, Inde) ont été utilisés dans les proportions suivantes : amoxicilline (10 μg), azithromycine (10 μg), amikacine (30 μg), aztréonam (30 μg), céfoxitine (30 μg), ceftazidime (30 μg), ciprofloxacine (5 μg), imipénème (10 μg), pipéracilline/tazobactam (100/10 μg), ertapénème (10 μg), méropénème (10 μg), cotrimoxazole (25 μg) et céfépime (30 μg). La plaque inoculée a été incubée en aérobiose à 37°C jusqu’à 18 heures. Après une incubation suffisante, les zones d’inhibition (ZOI) autour des disques ont été mesurées et le résultat a été classé comme sensible, intermédiaire ou résistant.21 Les isolats présentant une résistance à trois antibiotiques ou plus de classes différentes ont été interprétés comme multirésistants22.

Dépistage des β-Lactamases AmpC

Les isolats ont d’abord été dépistés pour une éventuelle production de β-lactamases AmpC selon les directives du CLSI, 2019.23 Pour le dépistage, la ceftazidime ou la céfotaxime ou la céfoxitine ou la ceftriaxone, chacune de 30 µg ont été soumises en test AST et les organismes résistants à ces antibiotiques (présentant une zone d’inhibition de diamètre ≤ 18mm) ont été dépistés comme producteurs potentiels d’AmpC et ont subi d’autres tests de confirmation.

Confirmation pour les β-Lactamases AmpC

Les producteurs de β-lactamases AmpC positifs au dépistage ont été confirmés par un test sur disque AmpC et un test de confirmation basé sur les inhibiteurs (test à l’acide boronique).

Dans le test à l’acide boronique, la culture sur tapis de l’organisme testé a été réalisée sur une plaque MHA en prenant des solutions de 0,5 McFarland. Deux disques de céfoxitine (30µg), dont l’un a été additionné d’acide borique phénylique (400 µg) ont été placés sur la culture en tapis sur plaque MHA et incubés et les résultats ont été interprétés. S’il y avait une augmentation de la zone d’inhibition de ≥5 mm lorsque le disque antibiotique désiré (ceftazidime ou céfotaxime) était évalué en combinaison avec l’acide phénylborique que pendant le test sans la combinaison (disque antibiotique seul), l’isolat était marqué comme ayant un test de confirmation positif.

Dans le test de rapprochement des disques, des disques ont été placés sur la culture de tapis d’E. coli ATCC 25922. Un disque de 30μg de ceftazidime a été placé au centre de la plaque, suivi de disques de 10μg d’imipenem, de 30μg de céfoxitine et de 20/10μg d’amoxicilline/clavulanate qui ont été placés à une distance de 20mm du disque de ceftazidime. Les colonies de l’organisme à tester ont été ajoutées à un disque, puis la plaque a été inversée et incubée pendant 24 heures à 37°C en aérobiose. Toute indentation ou aplatissement de la ZOI indiquait la production d’AmpC β-lactamase par les isolats.20,24

Préservation des isolats positifs à l’AmpC β-Lactamase

La méthode de préparation de stock de glycérol a été utilisée pour la conservation. Les organismes ont été conservés dans un bouillon Tryptic Soy (TSB) contenant 40% de glycérol et stockés à -20ºC.25

Extraction d’ADN plasmidique brut

Une colonie isolée de l’organisme testé a été inoculée dans un bouillon Luria Bertani (LB). L’inoculum a été incubé en aérobiose à l’aide d’un agitateur de bain-marie à 37°C pendant 18-24 heures. La culture pure ainsi obtenue a été soumise à la méthode de lyse alcaline pour extraire l’ADN plasmidique. L’ADN plasmidique extrait a ensuite été mis en suspension dans un tampon TE et stocké à -20°C jusqu’à des recherches ultérieures.26

Amplification des gènes de β-Lactamase AmpC (blaCITM et blaDHAM) par PCR

Les gènes de β-lactamases AmpC (blaCITM et blaDHAM) ont été amplifiés par PCR en utilisant la préparation d’ADN plasmidique comme matrice. Les amorces utilisées pour le gène blaCITM étaient CLR5-F (5ʹ TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA -3ʹ) et CLR5-R (5ʹ- TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC -3ʹ) comme amorce directe et inverse respectivement tandis que les amorces pour le gène blaDHAM étaient la séquence directe DHAM pour (5ʹ AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG -3ʹ) et la séquence inverse DHAM_rev (3ʹ CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC -5ʹ).11 Le volume de réaction a été fixé à 25µL en ajoutant 12.5µL de master mix 1X (5× HOT FIREPol Blend Master Mix Ready to Load, Solis BioDyne, Estonia), 0.5µL de chacune des amorces avant et arrière et 4µL de matrice d’ADN et 7.5µL de ddH2O. L’amplification PCR optimisée des deux gènes était de 94ºC pendant 3 minutes pour la dénaturation initiale ; 35 cycles de dénaturation à 94ºC pendant 30 secondes ; 25 cycles de recuit à 62ºC pendant 30 secondes ; 35 cycles d’extension à 72º pendant 1 minute ; et extension finale à 72ºC pendant 7 minutes.11,27

Purification de l’ADN

L’ADN plasmidique a été purifié par la méthode de précipitation à l’éthanol. Dans cette méthode, le culot d’ADN a été rincé avec de l’éthanol 70% glacé et laissé sécher pendant 10 minutes ce qui facilite l’évaporation de l’alcool. Le culot d’ADN a été suspendu dans une solution tampon contenant du Tris, de l’EDTA et des RNases pour laver les impuretés restantes.

Détection des produits PCR par électrophorèse sur gel

Les produits amplifiés ont été visualisés en utilisant l’électrophorèse sur gel dans un gel d’agarose à 1,5% coloré avec 0,1µL de bromure d’éthidium. Après la préparation du gel, 2µL d’échelle d’ADN de 100bp ont été ajoutés au premier puits comme marqueur, 2µL de contrôle négatif ont été ajoutés à un autre puits, 2µL de contrôle positif ont été ajoutés à un autre puits et 2µL de produits PCR ont été ajoutés aux puits restants. Enfin, le gel a été visualisé sous trans-illuminateur UV.28

Contrôle de qualité

Une procédure aseptique standard a été adoptée pour les procédures de cette étude. Tous les lots de milieux de culture et de réactifs chimiques ont été traités avec des techniques aseptiques selon les directives du CLSI. Dans l’AST, le contrôle de qualité a été assuré en utilisant les souches de contrôle d’E. coli ATCC 25922. Lors de la PCR, le contrôle de qualité a été assuré par l’utilisation d’isolats de Klebsiella portant les deux gènes en question, tandis que des contrôles blancs ou négatifs ont été préparés sans application d’acides nucléiques. Tous ces contrôles ont été utilisés dans chaque lot du test PCR.

Analyse statistique

Les données ont été saisies et analysées en utilisant le logiciel SPSS version 24.0. Les associations ont été explorées à l’aide de tests du Chi carré à un intervalle de confiance (IC) de 95% entre les variables démographiques telles que le sexe, et l’âge des sujets.

Résultats

Caractère démographique et clinique des patients inscrits

Parmi les 1151 patients inscrits, 54,2% (624/1151) étaient des hommes et 45,8% (527/1151) étaient des femmes. Sur 253 croissances bactériennes, 47,8% (121/253) provenaient d’hommes et 52,2% (132/253) de femmes. Sur le total (253) des proliférations bactériennes, 26,1 % (66/253) provenaient d’échantillons d’urine, suivis par les embouts de cathéter (17,4 % ; 44/253), le sang (16,2 % ; 41/253), le pus (11,9 % ; 30/253) et les écouvillons de plaie (10,7 % ; 27/253). En ce qui concerne la répartition des patients selon l’âge, la croissance la plus élevée des agents pathogènes bactériens a été observée dans le groupe d’âge 16-45 ans (39,5 % ; 100/253), suivi par le groupe 46-60 ans (30,1 % ; 76/253), le groupe >60 ans (24,1 % ; 61/253) et le groupe 0-15 ans (6,3 % ; 16/253) respectivement (Tableau 1).

Tableau 1 Caractère démographique et clinique des patients fréquentant l’Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences

Distribution des isolats bactériens dans les échantillons cliniques

Sur un total de 1151 échantillons cliniques, 22% (253/1151) ont montré une croissance sur les milieux de culture. Sur 253 isolats bactériens, la plupart (89,3% ; 226/253) étaient des bactéries Gram-négatives. Parmi les bactéries, E. coli (28,5 % ; 72/253) était l’organisme prédominant, suivi par Pseudomonas aeruginosa (16,2 % ; 41/253), Acinetobacter baumannii (15,8 % ; 40/253), les bactéries Gram positives (10,7 % ; 27/253), Klebsiella pneumoniae (9,9 % ; 25/253) et Klebsiella oxytoca (4.7% ; 12/253) (Figure 1)

Figure 1 Distribution des genres bactériens dans les spécimens cliniques positifs à la culture (n=253).

Patron de sensibilité aux antibiotiques des bactéries Gram-négatives isolées

Sur 226 isolats de bactéries Gram-négatives, 66.8% (151/226) ont été trouvés résistants à la céfoxitine, suivis par la ceftazidime (58,4% ; 132/226), la ciprofloxacine (53,5% ; 121/226) et le céfépime (51.8% ; 117/226), tandis que les isolats étaient plus sensibles au méropénème (69% ; 156/226), à l’ertapénème (68,6% ; 155/226), à l’imipénème (66,8% ; 151/226), à l’amikacine (61,1% ; 138/226), à la pipéracilline/tazobactam (56,6% ; 128/226) et à l’azithromycine (53.1% ; 120/226) (Tableau 2).

Tableau 2 Schéma de sensibilité aux antibiotiques des isolats bactériens à Gram négatif (n=226)

Schéma de multirésistance (MDR) des isolats

Sur 226 isolats, 46.9% (106/226) des isolats étaient MDR. Le pourcentage le plus élevé de MDR a été trouvé chez E. coli (31,1% ; 33/106) suivi par P. aeruginosa (20,8% ; 22/106), A. baumannii (18,9% ; 20/106), K. pneumoniae (9,4% ; 10/106) et K. oxytoca (4,7% ; 5/106) respectivement (Figure 2). Dans les espèces individuelles, le pourcentage le plus élevé de multirésistance a été trouvé chez C. freundii (100% ; 8/8), suivi de P. aeruginosa (53,6% 22/41), C. koseri (50% ; 2/4), A. baumannii (50% ; 20/40) et E. coli (45,8% 33/72), respectivement (Figure 2).

Figure 2 Distribution des bactéries MDR et % global de MDR et MDR au sein de chaque espèce.

Détection de l’AmpC par différents tests

Sur 226 isolats Gram-négatifs, 50% (113/226) ont montré une résistance à la céfoxitine. Les isolats producteurs de β-lactamase AmpC ont été confirmés par deux tests de confirmation différents, les tests Disk et les tests à l’acide boronique. Sur les quatre-vingt-onze isolats, 91,2% (83/91) ont montré un résultat positif dans les deux tests et 8,8% (8/91) isolats ont montré un résultat positif seulement dans le test de l’acide boronique confirmé par au moins un test et ont été considérés comme des producteurs de β-lactamase AmpC.

Prévalence des gènes blaCITM et blaDHAM dans les isolats Gram-Négatifs producteurs de β-Lactamase AmpC

Dans le test PCR, 90,1% (82/91) et 87,91% (80/91) des isolats ont été testés positifs pour blaCITM et blaDHAM. Respectivement, les gènes amplifiés blaCITM et blaDHAM avec leur taille d’amplicon 465bp et 405bp ont été détectés (Figures 3 et 4).

Figure 3 Electrophorèse sur gel d’agarose (1,5%) utilisée pour la séparation des produits de la PCR. Couloir 2, contrôle positif ; les couloirs 3, 5 et 7 sont des CITM positifs ; les couloirs 4 et 6, des CITM négatifs ; et le couloir 8. contrôle négatif.

Figure 4 Electrophorèse sur gel d’agarose (1,5%) utilisée pour la séparation des produits PCR. Couloir 2, contrôle positif ; les couloirs 3, 4, 6 et 7 sont positifs pour le Dham ; le couloir 5, négatif pour le Dham ; et le couloir 8, contrôle négatif.

Distribution des gènes AmpC β-Lactamase, blaCITM et blaDHAM parmi les isolats à Gram négatif et leur relation avec le sexe, l’âge, les spécimens cliniques et les isolats cliniques

Sur 91 producteurs d’AmpC, 50,6 % (46/91) des isolats provenaient de femmes et 49,4 % (45/91) de patients masculins. De même, des pourcentages égaux (50% ; 41/82) de gènes blaCITM ont été obtenus à partir de spécimens des deux sexes tandis que 51,3% (41/80) et 48,7% (39/80) de gènes blaDHAM ont été détectés dans les spécimens obtenus à partir de patients masculins et féminins respectivement. Il n’y avait aucune association significative du sexe du patient avec la production d’enzymes AmpC et de gènes AmpC (tableau 3).

Tableau 3 Distribution des gènes AmpC β-Lactamase, CITM et DHAM parmi les isolats bactériens à Gram négatif et leur relation avec le sexe, l’âge et les spécimens cliniques

Le plus grand nombre de producteurs de β-lactamase AmpC (40.7% ; 37/91) et la prévalence des isolats produisant blaCITM (40,2% ; 33/82) et blaDHAM (41,2% ; 33/80) ont été obtenus dans le groupe d’âge (46-60) ans, suivi par (16-45) ans (30,8% ; 28/91), (29,3%;24/82) et 31,3% ; 25/80) respectivement. Il y avait une association significative entre la production d’enzymes β-lactamase AmpC et le groupe d’âge (p=0,01) tandis que d’autres facteurs, y compris l’acquisition des gènes blaCITM et blaDHAM, n’avaient pas d’association significative avec l’âge du patient (Tableau 3).

Parmi les échantillons cliniques, le plus grand nombre d’isolats producteurs de β-lactamase AmpC (20,9 % ; 19/91) ont été détectés dans le sang et les embouts de cathéter, suivis par l’urine (18,7 % ; 17/91), le pus (13,3 % ; 12/91) et les écouvillons de plaie (9,9 % ; 9/91). De même, le nombre le plus élevé d’isolats producteurs de blaCITM et de blaDHAM a été détecté dans les embouts de cathéter (21,9 % ; 18/82) ; (22,5 % ; 18/80), suivis par le sang (19,5 % ; 16/82) ; (21,3 % ; 17/80), l’urine (17,0 % ; 14/82) ; (17,5 % ; 14/80) et le pus (13,4 % ; 11/82) ; (8,8 % ; 7/80), respectivement. Il n’y avait pas d’association significative entre les spécimens cliniques, la production de β-lactamase AmpC et les gènes : blaCITM et blaDHAM (tableau 3).

Distribution des β-lactamases AmpC et acquisition des gènes blaCITM et blaDHAM dans diverses bactéries Gram-négatives

La prévalence la plus élevée des enzymes β-lactamases AmpC a été trouvée chez E. coli (28,6 % ; 26/91), suivie de P. aeruginosa (26,4 % ; 24/91), A. baumannii (13,2 % ; 12/91) et K. pneumoniae (10,9 % ; 10/91). La prévalence la plus élevée des gènes blaCITM et blaDHAM a été détectée chez E. coli (30,6 % ; 25/82) (31,3 % ; 25/80), suivie par P. aeruginosa (25,7 % ; 21/82), (22,5 % ; 18/80) A. baumannii (12,2 % ; 10/82), (12,4 % ; 10/80) et K. pneumoniae (10,9 % ; 9/82), (12,4 % ; 10/80), respectivement (tableau 3).

Discussion

L’incidence croissante de la résistance aux antimicrobiens reste comme l’un des principaux problèmes de santé publique dans les pays en développement comme le Népal29 qui a conduit à la prolongation du séjour à l’hôpital, à l’augmentation des coûts de traitement, à la contrainte des options thérapeutiques et à l’augmentation de la morbidité et de la mortalité29,30. La production de β-lactamases est le principal mécanisme de défense contre les β-lactamines. Cette étude a été menée pour explorer la présence de β-lactamases de classe C ambrées (AmpC) dans les organismes Gram-négatifs provenant d’échantillons cliniques obtenus à l’ANIAS, Katmandou, Népal. Cette étude a également évalué la prévalence des gènes de β-lactamase AmpC (blaCITM et blaDHAM) par test PCR. Nous avons trouvé une prévalence élevée de ces enzymes et de ces gènes, bien que la prévalence de ces enzymes varie d’une région géographique à l’autre, dans et entre les pays.

Sur 1151 échantillons cliniques, seuls 253 (21,9%) ont montré une croissance significative des organismes. Sur le total (253) de la croissance bactérienne, plus de quatre-vingt-dix pour cent étaient des bactéries Gram-négatives, E. coli était les isolats les plus prédominants parmi eux. Nos résultats sont conformes aux études précédentes rapportées par l’hôpital Everest, Baneshwor,14 l’hôpital Alka, Jawlakhel,31 le laboratoire national de santé publique, Teku,32 le collège universel des sciences médicales, Bhairahawa,33 l’institut des sciences de la santé B.P Koirala, Dharan,34 le collège médical Nobel, Biratnagar,35 New Delhi, Inde,36 la ville d’Al-Najaf, Irak,37 l’hôpital de référence Shashemene, Éthiopie,38 et Mexico, Mexique39. Un taux légèrement plus élevé d’infections bactériennes à Gram négatif a été observé chez les patientes, ce qui pourrait être dû à une prévalence plus élevée d’infections urinaires chez les femmes. Ces résultats sont conformes aux études antérieures menées au Model Hospital de Katmandou17 et dans l’Andra-Pradesh, en Inde40 . Comme dans cette étude, une étude menée dans l’État de l’Uttar Pradesh, en Inde, a révélé un taux plus élevé d’infections par le pus chez les femmes (63,33 %) que chez les hommes (43,75 %) dans les cas postopératoires41 .

Dans cette étude, les isolats de bactéries à Gram négatif présentaient une résistance plus élevée aux antibiotiques suivants : céfoxitine, ceftazidime, ciprofloxacine et céfépime, suivis par le cotrimoxazole tandis que le méropénème, l’imipénème, la pipéracilline-tazobactam et l’azithromycine étaient signalés comme les antibiotiques les plus sensibles. Un schéma comparable a été observé dans certains résultats antérieurs du Chitwan Medical College, Chitwan,42 du Padma Hospital, Pokhara.43 La céfoxitine et la ceftazidime, dont les taux de sensibilité sont faibles, sont les médicaments de première ligne qui sont facilement hydrolysés par les enzymes bactériennes et sont moins utiles dans le traitement des infections causées par des pathogènes Gram-négatifs. Comme dans notre étude, l’imipénème et le méropénem ont été trouvés comme les médicaments les plus sensibles dans les études précédentes du Model Hospital, Katmandou,17 de Madrid, Espagne,44 et du Wisconsin, USA.45

La résistance aux antimicrobiens (RAM) avec la propagation croissante de la MDR est une préoccupation mondiale, et ses impacts sont plus élevés dans les pays à revenu faible et moyen où le fardeau des maladies infectieuses est élevé.30 Le traitement des microbes MDR est coûteux et difficile, et il est encore aggravé par la forte prévalence des infections nosocomiales.46 Dans cette étude, près de la moitié des isolats Gram-négatifs isolés (46,9% ; 106/226) se sont avérés être MDR. Une prévalence plus élevée de bactéries MDR a été signalée dans d’autres études menées à Katmandou46-49 et dans d’autres districts du Népal.15,50,51 La production de BLSE, de métallo-β-lactamase (MBL) ou de β-lactamase AmpC pourrait être à l’origine de la moindre sensibilité aux antibiotiques de nouvelle génération52. De plus, la multirésistance se produit en raison de l’agrégation et de l’expression de différents gènes sur des plasmides résistants (R) ou des gènes qui codent pour des pompes d’efflux multidrogues.53 En outre, les gènes responsables de l’expression des enzymes β-lactamases sont constamment associés aux antibiotiques nonβ-lactames comme les aminoglycosides et les fluoroquinolones.

Dans cette étude, la production d’AmpC a été trouvée plus élevée chez les patients masculins (41,67%) que chez les femmes (38,98%). Les résultats de cette étude sont cohérents avec d’autres études menées à Kano, dans le nord-ouest du Nigeria.54 Cependant, nos résultats diffèrent des études rapportées au Bénin, au Nigeria.55 Une prévalence plus élevée d’infections urinaires avec multirésistance chez les femmes a été rapportée par de nombreuses études, cela peut être dû à une prévalence plus élevée de pathogènes producteurs d’AmpC chez les femmes car elles sont plus sujettes aux infections urinaires que les hommes.

L’utilisation de la résistance à la céfoxitine dans les laboratoires de diagnostic sert d’agent de dépistage/marqueur fiable pour détecter la production d’AmpC. En outre, ce marqueur offre une bonne valeur prédictive négative.

Malgré leur large portée, certaines études ont souligné l’utilisation de la céfoxitine comme un mauvais agent de dépistage de la production d’AmpC. Cela pourrait être dû à l’existence de mécanismes alternatifs autres que l’AmpC (l’un d’entre eux est la mutation du canal de la porine) qui peuvent conduire à une interprétation faussement positive (comme la résistance à la céfoxitine).52 Notre étude a révélé qu’un tiers des isolats Gram-négatifs (>40%) étaient responsables de la production d’AmpC. Les résultats de cette étude contrastent avec ceux de l’étude du Model Hospital de Katmandou.17 La différence peut être due à la méthode de détection phénotypique utilisée dans cette étude qui a utilisé le test de résistivité à la céfoxitine et la méthode du test sur disque AmpC utilisant la céfoxitine (30µg). Le test de confirmation utilisé était le test de l’acide phénylboronique en utilisant la céfoxitine 30µg/400µg d’acide phénylboronique. Les dérivés de l’acide boronique se sont avérés être des inhibiteurs réversibles des enzymes β-lactamase AmpC.56

Dans cette étude, la production d’AmpC a été observée dans 91 (80,53%) isolats sur 113. Le taux de production d’AmpC dans notre étude est légèrement plus élevé que d’autres études rapportées par le Model Hospital, Kathmandu,17 le Chitwan Medical College,57 Bharatpur, Chitwan,58 et l’Inde.59

Afin de compenser les limitations dues à l’une des méthodes, l’intégration des deux techniques dans le diagnostic de routine peut augmenter la sensibilité et la spécificité des tests dans les milieux cliniques.

Un total de 73 isolats Gram-négatifs ont montré la présence des deux gènes blaCITM et blaDHAM. Ces résultats sont cohérents avec ceux d’une étude précédente rapportée à Ilam, en Iran.27 Dans le même type d’étude rapportée en Inde, il a été montré que les gènes blaCITM étaient plus répandus chez E. coli.60 Dans notre étude, la prévalence des gènes associés à l’AmpC (blaCITM et blaDHAM) a été étudiée par des méthodes phénotypiques et génotypiques. Cette étude fournit une large analyse des bactéries Gram-négatives associées à la production de β- lactamase AmpC et de leurs profils de sensibilité aux antibiotiques parmi les isolats cliniques. Les résultats de cette étude sont importants pour éclairer les profils de résistance de divers organismes aux céphalosporines. La surveillance de la multirésistance aux β-lactamases, y compris la production de BLSE, de LBM et d’AmpC, est nécessaire pour une pratique clinique de routine afin d’optimiser le traitement et de prévenir toute nouvelle résistance aux β-lactamines.13,61,62

Forts et limites

Il s’agit de la première étude explorant les gènes de β-lactamase AmpC (blaCITM et blaDHAM) en utilisant à la fois le test phénotypique et moléculaire chez les patients fréquentant un centre de soins tertiaires du Népal. Les résultats de cette étude peuvent éclairer la politique antimicrobienne des centres de soins tertiaires, notamment en préparant la gestion des infections hospitalières, le protocole de traitement et la procédure de diagnostic. Cette étude comporte quelques limites, notamment l’étude d’un nombre limité de β-lactamases AmpC, la courte durée de l’étude et le fait qu’elle ait été menée dans un seul centre de soins tertiaires. Les études futures peuvent s’appuyer sur cette étude pour mener une étude longitudinale dans plusieurs centres de soins tertiaires avec l’exploration de toutes les β-lactamases telles que la BLSE, la LBM, la CPK et les principaux gènes responsables de la résistance. Néanmoins, en tant que première étude de ses types triangulant les méthodes phénotypiques et moléculaires, cette étude sera une référence précieuse pour les études futures sur les β-lactamases AmpC et la prévalence des gènes blaCITM et blaDHAM dans d’autres milieux/hôpitaux du Népal.

Conclusion

Nos résultats montrent que la sensibilité réduite à la céfoxitine dans les isolats Gram-négatifs est liée à la présence de gènes AmpC à médiation plasmidique. Comme il n’existe pas de méthode unique et définitive, il est suggéré d’utiliser simultanément plusieurs méthodes de détection phénotypique pour la détection précise des bactéries productrices de β-lactamase AmpC. Dans cette étude, la PCR a détecté près de 90% des gènes de β-lactamase AmpC (blaCITM et blaDHAM) parmi les isolats confirmés phénotypiquement. La prévalence élevée de gènes résistants et de MDR parmi les isolats Gram-négatifs est un signe alarmant, qui appelle des mesures d’intervention urgentes pour freiner la croissance et la propagation de ces isolats.