Accessibilité et architecture de la chromatine

Figure 3 : Techniques de conformation des chromosomes. Diverses étapes de 3C, 4C, 5C, ChIA-PET et Hi-C.

Capture de la conformation de la chromatine (3C)

La 3C utilise la réticulation au formaldéhyde pour verrouiller la structure tridimensionnelle de la chromatine en place, suivie d’une digestion par enzymes de restriction. Les fragments d’ADN excisés sont ensuite analysés par qPCR et séquençage pour identifier où les régions d’ADN distantes sont connectées. Cette approche d’analyse de la structure et des interactions de la chromatine en 3D in vivo a été développée pour la première fois en 2002 (Dekker et al, 2002), et est depuis devenue le fondement d’une foule de techniques connexes qui ont été développées pour atteindre une plus grande échelle, un plus grand débit ou une plus grande spécificité.

Capture de conformation de chromosomes circulaires (4C)

La 4C permet d’identifier des régions d’ADN précédemment inconnues qui interagissent avec un locus d’intérêt, ce qui rend la 4C idéale pour découvrir de nouvelles interactions au sein d’une région spécifique (Dekker et al, 2006).

4C conseils utiles:

• Choisissez les bonnes enzymes de restriction. Des coupeurs plus fréquents (c’est-à-dire des sites de reconnaissance de quatre pb) sont meilleurs pour les interactions locales entre la région d’intérêt et les séquences voisines sur le même chromosome (van der Werken et al., 2012).
• Optimiser la réticulation. Des concentrations de formaldéhyde plus faibles favorisent les auto-liaisons indésirables de la région d’intérêt, mais empêchent également les  » boules de poils  » d’ADN qui entravent la coupe par les enzymes de restriction. Des concentrations élevées de formaldéhyde réduisent les événements d’auto-ligation mais augmentent les boules de poils. Une concentration optimale de formaldéhyde doit être choisie pour la situation expérimentale spécifique afin d’équilibrer ces considérations. Un traitement au formaldéhyde à 1% pendant 10 min est un bon point de départ pour la plupart des expériences (van der Werken et al., 2012).

Capture de la conformation des chromosomes par copie carbone (5C)

La 5C génère une bibliothèque de tous les produits de ligature des régions d’ADN qui s’associent aux loci cibles, qui sont ensuite analysés par NGS. Le 5C est idéal lorsqu’on a besoin d’un grand détail sur toutes les interactions dans une région donnée, par exemple lorsqu’il s’agit de schématiser une matrice d’interaction détaillée d’un chromosome particulier. Cependant, le 5C n’est pas vraiment à l’échelle du génome, puisque chaque amorce 5C doit être conçue individuellement, il est donc mieux adapté à une région spécifique (Dotsie et Dekker, 2007).

Conseils utiles pour le 5C :

• Sélectionnez la bonne enzyme de restriction. Il est essentiel de choisir une enzyme qui fonctionne efficacement dans vos conditions expérimentales spécifiques. Par exemple, BamHI n’est pas recommandé pour la plupart des expériences en raison de son inefficacité dans les conditions 3C (Dotsie et al., 2007).
• Optimiser la conception des amorces. Le 5C utilise deux amorces : une amorce 5C avant qui se lie en amont du site de ligature, et une amorce inverse qui se lie immédiatement en aval. La longueur des amorces doit être ajustée de manière à ce que la température de recuit soit d’environ 65°C pour permettre aux amorces de se recoupler exactement avec leurs fragments de restriction. Assurez-vous que les amorces 5C sont synthétisées avec un phosphate à l’extrémité 5′ pour la ligature.
• Utilisez un modèle de contrôle. Cela permettra de contrôler les différences d’efficacité des amorces. Une bibliothèque de contrôle construite à partir de toute la région génomique étudiée est recommandée. Si cette bibliothèque n’est pas construite, alors les chercheurs doivent être conscients que les fréquences d’interaction seraient moins précises.

Analyse d’interaction chromatinienne par séquençage de tags en paires (ChIA-PET)

ChIA-PET prend des aspects de ChIP et de 3C pour analyser l’interaction de régions d’ADN distantes à travers une protéine particulière.

ChIA-PET est mieux utilisé pour les expériences de découverte impliquant une protéine d’intérêt et des cibles de liaison à l’ADN inconnues. Les sites de liaison des facteurs de transcription, par exemple, sont mieux étudiés avec ChIA-PET puisque cette technique nécessite que l’ADN soit lié par le facteur de transcription in vivo pour que l’interaction soit appelée (Fullwood et al., 2009).

ChIA-PET conseils utiles:

• Chevauchez les balises PET pour réduire le bruit de fond. Comme pour la plupart des technologies 3C, le bruit de fond est un défi technique. Dans ChIA-PET en particulier, le bruit peut rendre difficile la recherche d’interactions à longue portée avec le locus d’intérêt. Une astuce utile pour surmonter cela est d’exiger que les TEP se chevauchent aux deux extrémités de la région pour qu’il s’agisse d’une interaction à longue portée.

ChIP-loop

ChIP-loop est un mélange de ChIP et de 3C qui emploie des anticorps ciblés sur des protéines suspectées de se lier à une région d’ADN d’intérêt. Le ChIP-loop est idéal pour découvrir si deux régions d’ADN connues interagissent via une protéine d’intérêt. La ChIP-boucle est également bien adaptée à la confirmation des interactions suspectées, mais pas à la découverte de nouvelles interactions (Horike et al., 2005).

Conseils utiles pour la ChIP-boucle :

• Éviter les boucles non natives. Le plus grand problème rencontré avec ChIP-loop est la formation de boucles non natives se formant lors de la concentration de l’ADN avant la ligature. Une façon simple d’éviter cela est de choisir un protocole qui effectue la précipitation après l’étape de ligature (Simons et al., 2007).
• Valider les interactions ChIP-boucle. Un autre défi dans ChIP-boucle peut être la quantification précise des produits de ligature. Les technologies 3C, en particulier la ChIP-boucle, capturent souvent des interactions aléatoires. Pour lutter contre ce problème, envisagez de réaliser une expérience ChIP en parallèle et de l’utiliser pour valider les interactions ChIP-boucle. Si une interaction ADN-protéine-ADN identifiée par ChIP-loop est effectivement réelle, alors les deux interactions ADN-protéine devraient également apparaître dans les données ChIP (Simons et al., 2007).

Hi-C

Hi-C amplifie les produits de ligature à partir du génome entier et évalue leurs fréquences par séquençage à haut débit. Hi-C est un excellent choix lorsqu’une large couverture de l’ensemble du génome est nécessaire, et que la résolution n’est pas une grande préoccupation, cartographiant les changements à l’échelle du génome de la structure des chromosomes dans les cellules tumorales (Lieberman-Aiden et al., 2009), par exemple.

Hi-C conseils utiles:

• Optimiser l’amplification de la bibliothèque. L’amplification de la bibliothèque Hi-C doit générer suffisamment de produit pour l’analyse, tout en évitant les artefacts de PCR. Pour ce faire, le nombre de cycles de PCR doit être optimisé (dans une fourchette de 9 à 15 cycles). S’il est impossible de produire suffisamment de produit (50 ng d’ADN), il convient de regrouper plusieurs réactions PCR plutôt que d’augmenter le nombre de cycles, cinq réactions étant généralement suffisantes (Belton et al., 2012).
• Équilibrer les longueurs de lecture. Comme pour toute expérience de séquence, des lectures de haute qualité sont primordiales. La longueur de lecture doit être optimale pour équilibrer le besoin de longues lectures pour cartographier les interactions, mais pas trop longues au point de passer par la jonction de ligature dans le fragment partenaire. Par conséquent, des lectures de 50 pb sont optimales dans la plupart des cas (Belton et al., 2012).
• Choisissez une taille de bin appropriée. Ceci est essentiel pour l’analyse des données. La taille des bin doit être inversement proportionnelle au nombre d’interactions attendues dans une région. Utilisez des bacs plus petits pour les interactions intra-chromosomiques plus fréquentes et des bacs plus grands pour les interactions inter-chromosomiques moins fréquentes (Belton et al., 2012).

Capture-C

Capture-C utilise une combinaison de 3C et de technologie de capture d’oligonucléotides (OCT), ainsi que le séquençage à haut débit pour étudier des centaines de loci à la fois. Capture-C est idéal lorsque la haute résolution et l’échelle génomique sont requises. Par exemple, l’analyse de l’effet fonctionnel de chaque SNP associé à une maladie dans le génome sur la structure chromatinienne locale (Hughes et al., 2014).

Capture-C conseils utiles:

• Choisissez soigneusement les positions des sondes. Il est préférable de positionner les sondes à proximité des sites d’enzymes de restriction, voire de les faire se chevaucher lorsque cela est possible (Hughes et al., 2014).
• Gardez les bibliothèques complexes. Maintenir la complexité des bibliothèques est la priorité absolue. Une bibliothèque complexe signifie plus d’interactions de haute qualité dans la sortie. Pour cette raison, tout ce qui pourrait diminuer la complexité de la bibliothèque doit être évité, comme une capture de biotine Hi-C (Hughes et al., 2014).
• Surveiller les fausses interactions dans les régions dupliquées. Le processus de cartographie peut stimuler de fortes interactions entre ces régions (comme les pseudogènes) qui sont en fait des artefacts (Hughes et al., 2014)

Belton JM, McCord RP, Gibcus JH, Naumova N, Zhan Y et Dekker J (2012). Hi-C : une technique complète pour capturer la conformation des génomes. Methods, 58, 268-76.

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Dostie J et Dekker J (2007). Cartographie des réseaux d’interactions physiques entre les éléments génomiques en utilisant la technologie 5C. Nat Protoc, 2, 988-1002.

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Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF et Kohwi-Shigematsu T (2005). Perte de bouclage de la chromatine silencieuse et altération de l’empreinte de DLX5 dans le syndrome de Rett. Nat Genet, 37, 31-40.

Fullwood MJ, et al. (2009). Un interactome chromatinien humain lié au récepteur d’œstrogène-alpha. Nature, 462, 58-64.

Lieberman-Aiden E, et al. (2009). La cartographie complète des interactions à longue portée révèle les principes de pliage du génome humain. Science, 326, 289-293.

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