Fosfatase Fosfatase Alcalina Isoenzima

Estrutura genómica, química proteica e enzimologia da fosfatase alcalina

ALP (ortofosfo-monoéster fosfo-hidrolase, óptimo alcalino, EC 3.1.3.1) é encontrado em toda a natureza em plantas e animais (McComb et al., 1979). Em humanos, quatro isoenzimas ALP são codificadas por quatro genes separados (Millán, 1988, 2006; Harris, 1990; Moss, 1992). Três das isoenzimas têm expressão essencialmente tecidual específica e são designadas por ALP intestinal, placentária e células germinativas (semelhantes à placentária). A quarta isoenzima ALP é expressa ubíquamente e, portanto, é designada TNSALP (Stigbrand and Fishman, 1984; Harris, 1990; Moss, 1992). O tecido esquelético, hepático e renal são especialmente ricos em TNSALP. As propriedades físico-químicas distintas (estabilidade térmica, mobilidade eletroforética, etc.) entre os ALPs purificados a partir do osso, fígado e rim humanos são perdidas com a exposição às glicosidases (Moss e Whitaker, 1985), e TNSALP é, portanto, uma família de isoenzimas “secundárias” (vou chamá-las de “isoformas”). Elas são codificadas pelo mesmo gene, têm a mesma seqüência de polipeptídeos, e diferem apenas por modificações pós-tradução envolvendo carboidratos (Harris, 1980).

O símbolo de mapeamento gênico para TNSALP é ALPL (“ALP-liver”), embora a função da isoforma hepática da TNSALP não seja conhecida (ver mais adiante). A ALPL está localizada perto da ponta do braço curto do cromossomo 1 (1p36.1-p34), enquanto os genes para as ALPs intestinal, placentária e de células germinativas estão na ponta do braço longo do cromossomo 2 (2q34-q37) (Harris, 1990; Millán, 2006). A ALPL parece representar o gene ancestral, enquanto as ALPs teciduais específicas foram provavelmente formadas pela duplicação gênica (Harris, 1990). A ALPL é um pouco maior que 50 kb e contém 12 exons, 11 dos quais são traduzidos para formar a enzima madura composta de 507 resíduos de aminoácidos (Weiss et al., 1988b). As sequências TATA e Sp1 podem ser elementos reguladores, mas a expressão basal parece reflectir efeitos promotores “domésticos”, enquanto a expressão diferencial em vários tecidos pode ser mediada por um mecanismo pós-transcricional (Kiledjian e Kadesch, 1990). ALPL tem dois promotores e dois exons correspondentes 5′-não-codificadores, 1a e 1b. Sua expressão resulta em dois mRNAs diferentes com diferentes regiões não traduzidas em 5′ (Nosjean et al., 1997). A transcrição ocorre preferencialmente do promotor a montante (1a) nos osteoblastos e do promotor a jusante (1b) no fígado e nos rins (Millán, 2006).

Os genes de ALP específicos dos tecidos são menores que a ALPL, principalmente devido a introns mais curtos. Seqüências de aminoácidos deduzidas de seus cDNAs sugerem 87% de identidade posicional entre a ALP placentária e intestinal, mas apenas 50%-60% de identidade entre a ALP tecido-específica e a TNSALP (Harris, 1990).

A seqüência de resíduos de aminoácidos da TNSALP indica cinco potenciais locais de glicosilação ligados ao N (Weiss et al., 1988). A glicosilação com N é necessária para a atividade catalítica. A glicosilação O caracteriza o osso, mas não o fígado, isoforma (Nosjean et al., 1997).

Em 2000, a estrutura cristalina da ALP placentária humana foi delineada com resolução de 1,8-Å (Le Due et al., 2000). O local ativo do TNSALP derivaria de uma seqüência nucleotídica conservada em ALPs através da natureza (Henthorn e Whyte, 1992), reflete seis exons, e compreende 15 resíduos de aminoácidos (Zurutuza et al., 1999).

ALPs são Zn++-metalloenzymes (McComb et al., 1979). A atividade catalítica requer uma configuração multimérica de subunidades idênticas com cada monômero tendo um local ativo e dois átomos Zn++ que estabilizam a estrutura terciária (Kim e Wycoff, 1991).

ALPs são geralmente considerados homodiméricos na circulação (McComb et al., 1979). TNSALP, na sua forma dimérica simétrica, tem αβ topologia para cada subunidade incluindo uma folha de dez cordas β no seu centro (Hoylaerts e Millán, 1991). Entretanto, nos tecidos, as ALPs são amarradas (ver mais adiante) às superfícies celulares, talvez como homotetramers (Fedde et al., 1988).

In vitro, as ALPs têm amplas especificidades de substrato e pH óptimo que dependem do tipo e concentração de fosfocomposto submetido a catálise (McComb et al., 1979). A atividade catalítica requer Mg++ como co-fator (McComb et al., 1979). Os PPi, bem como os fosfóesteres, podem ser hidrolisados (Xu et al., 1991). A reação envolve fosforilação-desfosforilação de um resíduo serino. A dissociação do Pi covalentemente ligado parece ser a etapa limitadora da taxa. Na verdade, Pi é um potente inibidor competitivo da ALP (McComb et al., 1979; Kim e Wyckoff, 1991; Coburn et al., 1998). Entretanto, também pode ser que Pi estabilize a enzima (Farley, 1991).

Perda incerteza sobre a biossíntese da ALP em organismos superiores. As sequências genéticas das isoenzimas da ALP humana indicam que os polipéptidos nascentes têm uma sequência de sinal curto de 17-21 resíduos de aminoácidos (Harris, 1990) e um domínio hidrofóbico no seu terminal carboxílico (Weiss et al., 1988b). A degradação intracelular dos ALPs pode envolver proteasomas (Cai et al., 1998). No entanto, estes ALPs ligam-se à superfície externa das membranas plasmáticas amarradas ao grupo da cabeça polar de uma moiety fosfatidilinositol-glycan (Whyte et al., 1988; Whyte, 1994) e podem ser libertados por fosfolipase fosfatidilinositol específica (Fedde et al., 1988). Entretanto, sua interação precisa com o fosfatidilinositol pode diferir entre isoenzimas ALP (Seetharam et al., 1987).

Lipid-free ALP é a fracção normalmente encontrada na circulação. No entanto, os mecanismos de libertação de ALP a partir das superfícies celulares não são conhecidos. O processo pode envolver uma fosfatidase do tipo C ou D, ação detergente, proteólise, fracionamento de membrana ou lipólise (Alpers et al., 1990).

Em homens e mulheres saudáveis, quase toda a atividade da ALP em soro ou plasma deriva de quantidades aproximadamente iguais de isoformas ósseas e hepáticas de TNSALP (Millán et al., 1980). Lactentes e crianças, particularmente recém-nascidos e adolescentes, têm níveis mais elevados de isoforma óssea (McComb et al., 1979). Alguns indivíduos com tipos de sangue B e O que são “secretos” aumentam a pequena quantidade de ALP intestinal na sua circulação após ingerirem uma refeição gordurosa (Langman et al., 1966; McComb et al., 1979). Tipicamente, no entanto, a ALP intestinal contribui com apenas alguns por cento para a actividade sérica total da ALP (máximo 20%) (McComb et al., 1979; Mulivor et al., 1985). A ALP placentária é normalmente expressa e circula apenas durante o último trimestre da gravidez (Birkett et al., 1966). Vários cancros, no entanto, libertam a placenta ou célula germinal (“placental-like”) ALP (Millán, 1988) para a corrente sanguínea. A liberação de ALP circulante, como para muitas outras glicoproteínas, provavelmente envolve a absorção e degradação pelo fígado (Young et al., 1984).