VIRAL PLAQUE ASSAY

Materiaalit:

30ml eksponentiaalista SF9-soluviljelmää 5×105 solua/ml

6 kuoppalevyä (2 kappaletta kumpaakin)

1pullo 4 %:n agaroosigeeliä

1 pullo SF-900 (1.3X) medium

1 steriili pullo

0.5ml bakulovirus supernatantti

100ml SFM

1. Annostellaan 2 ml solususpensiota kuoppaa kohti steriileissä olosuhteissa.

2. Annetaan solujen laskeutua levyn pohjalle ja inkuboidaan peitettynä RT:ssä 1h.

3. Asetetaan agaroosigeelipullo 70oC:n vesihauteeseen. Aseta tyhjä pullo ja SF-900 (1.3X) 40oC:n kylpyyn.

4. Kun levyjä on inkuboitu 1h RT:ssä, tarkkaile monokerroksia käänteismikroskoopilla solujen kiinnittymisen ja 50 %:n konfluenssin varmistamiseksi.

5. Valmistetaan kahdeksan login sarjalaimennos kerätystä viruksen supernatantista laimentamalla peräkkäin 0,5 ml edellistä laimennosta 4,5 ml:aan SFM-mediumia 12 ml:n kertakäyttöastioissa. Lopulta pitäisi olla 8 putkea, joissa kussakin on 10-1-10-8 laimennos alkuperäisestä viruskannasta.

7. Poistetaan supernatantti peräkkäin jokaisesta kuopasta, hävitetään ja korvataan välittömästi 1 ml:lla vastaavaa viruslaimennosta kuhunkin kaksoiskuoppaan. Inkuboidaan 1h RT:ssä.

8. Siirrä pullot vesialtaista steriiliin huppuun, kun agaroosi on nesteytynyt (20-30 min).Annostele nopeasti 30 ml SF-900 (1.3X) -mediumia ja 10 ml 4 %:n agaroosigeeliä tyhjään pulloon ja sekoita varovasti. Palauta plakkien peittopullo 40oC:n vesihauteeseen käyttöön asti.

9. Tämän toisen 1 tunnin inkubaation jälkeen palauta laimennettua agaroosia sisältävä pullo ja 6-kuoppalevyt huppuun.

10. Poista virus kuopista peräkkäin (korkeasta laimennoksesta matalaan laimennokseen) ja vaihda tilalle 2 ml laimennettua agaroosia. Työskentele nopeasti, jotta vältät monokerroksen kuivumisen.Tyhjiöpumppuun kytketty Pasteur-pipetti poistaa helposti inokulaation jäljet.

11.Anna geelin kovettua 10-20 minuuttia ennen siirtämistä.

12.Inkuboi 27oC:ssa kostutetussa inkubaattorissa 4-10 päivää.

13.Rekombinantti-virus tuottaa maitomaisia/harmaita, hieman kontrastisia plakkeja, jotka näkyvät ilman värjäystä tai muita havaitsemismenetelmiä.

14.Seuraa plakkeja päivittäin, kunnes laskettujen plakkien määrä ei muutu kahtena peräkkäisenä päivänä.

15.Optimaalinen laskentaväli käytetyn inokulumin titterin määrittämiseksi on 3-20 plakkia kuoppaa kohti kuutiota kohti 6 kuoppalevyllä. Titeri (pfu/ml) voidaan laskea seuraavalla kaavalla:

16. Agaroosin peittäminen Natural Red -väriaineella:

Valmistetaan 0,5-prosenttinen agaroosiliuos SFM:ään

Lisätään Natural Red -liuosta lopulliseen pitoisuuteen 50 mg/ml (laimennetaan 3,33 mg/ml:n varastoliuosta 1:66,6).

Lisätään 1 ml väriaineliuosta kuhunkin kuoppaan (kuuden kuopan levyllä).

Lisätään 1 ml väriaineliuosta kuhunkin kuoppaan.