Ubikitiini-proteasomireitti:

Käsityksemme solunsisäisestä proteiinien hajoamisesta on muuttunut dramaattisesti viime vuosikymmenen aikana. Haaskaavasta, sääntelemättömästä ja epäspesifisestä ”loppupisteen” prosessista on tullut selväksi, että soluproteiinien proteolyysi on erittäin monimutkainen, ajallisesti kontrolloitu ja tiukasti säädelty prosessi, jolla on merkittävä rooli monissa perustavanlaatuisissa reiteissä solun elämän ja kuoleman aikana. On kuvattu kaksi suurta proteolyyttistä kaskadia. Kaspaasit osallistuvat ohjelmoituun solukuolemaan (apoptoosiin), kun taas useimpien lyhytikäisten solun säätelyproteiinien hajoaminen tapahtuu ubikitiini-proteasomiradan välityksellä. Näihin kuuluvat solusyklin ja jakautumisen säätelijät, kuten mitoottiset ja G1-sykliinit ja sykliini-riippuvaiset kinaasi-inhibiittorit, kasvun säätelijät, kuten c-Fos ja c-Jun, kasvainsuppressorit, kuten p53, pintareseptorit, kuten kasvuhormonireseptori, ja ionikanavat, esimerkiksi kystisen fibroosin transmembraanisen konduktanssin säätelijä (CFTR). Järjestelmä osallistuu myös epänormaalien/mutatoituneiden proteiinien selektiiviseen proteolyysiin ja suuren histokompatibiliteettikompleksin (MHC) luokan I rajoitettujen antigeenien prosessointiin. Kun havaittiin, että järjestelmä osallistuu esimerkiksi c-myc:n hajoamiseen ja NF-κB:n kaksivaiheiseen proteolyyttiseen aktivointiin, se merkitsi ubikitiinivälitteisen hajoamisen ”tuloa” transkription säätelyn alueelle. Lyhytikäisten ja keskeisten säätelijäproteiinien hajottamisen kautta järjestelmällä näyttää olevan tärkeä rooli monissa solun perusprosesseissa. Näihin kuuluvat solusyklin ja -jakautumisen säätely, osallistuminen solujen vasteeseen stressille ja solunulkoisille modulaattoreille, hermoverkkojen morfogeneesi, solupinnan reseptorien, ionikanavien ja eritysreitin modulointi, DNA:n korjaus, organellien biogeneesi sekä immuuni- ja tulehdusreaktioiden säätely. Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että järjestelmä osallistuu myös apoptoosiin. Koska substraattien ja prosessien kirjo on näin laaja, ei ole yllättävää, että prosessin poikkeavuudet on viime aikoina yhdistetty useiden sekä perinnöllisten että hankittujen sairauksien patogeneesiin. Näihin kuuluvat lihasten rappeutuminen, joka seuraa denervaatiota tai pitkäaikaista immobilisaatiota, tietyt Alzheimerin taudin muodot, miehen steriiliys ja Angelmanin oireyhtymä (viimeaikaiset katsaukset ubikitiinijärjestelmästä, ks. viitteet 1-4).

Proteiinin hajoaminen ubikitiinireitin kautta etenee kahdessa erillisessä ja peräkkäisessä vaiheessa: (i) useiden ubikitiinimolekyylien kovalenttinen kiinnittyminen proteiinisubstraattiin ja (ii) kohteena olevan proteiinin hajoaminen 26S-proteasomikompleksissa vapaan ja uudelleenkäytettävän ubikitiinin vapautuessa. Jotta voidaan varmistaa tietyn proteiinin tehokas ja spesifinen poistaminen tiettynä ajankohtana, sekä ubikitiinikonjugaatiota että merkittyjen substraattien hajoamista on säädeltävä tiukasti. Proceedings-lehden tässä numerossa julkaistussa tutkimuksessa (5) Zhang ja kollegat raportoivat proteasomin aktivaattorin PA28:n (REG) α-alayksikön aktivointialueen tunnistamisesta. Jotta tämä havainto voidaan liittää asianmukaiseen biokemialliseen ja fysiologiseen kontekstiin, tarkastelemme lyhyesti nykyistä käsitystämme ubikitiiniproteolyyttisestä reitistä. Järjestelmä (kuvattu kuvassa 1) koostuu useista komponenteista, jotka toimivat yhdessä. Yksi niistä, ubikitiini, evolutiivisesti konservoitunut 76 jäännöksen proteiini, aktivoituu C-terminaalisessa Gly:ssä korkea-energiseksi tioliesteriväliaineeksi, ja tätä reaktiota katalysoi ubikitiinia aktivoiva entsyymi E1. Aktivoinnin jälkeen jokin useista E2-entsyymeistä (ubikitiinikantajaproteiinit tai ubikitiinikonjugaatioentsyymit, UBC:t) siirtää aktivoidun ubikitiiniosan E1:ltä ubikitiiniproteiiniligaasiperheen jäsenelle E3:lle, johon substraattiproteiini on spesifisesti sitoutunut. E3 katalysoi konjugaatioprosessin viimeisen vaiheen, ubikitiinin kovalenttisen kiinnittymisen substraattiin. Ensimmäinen ubikitiiniryhmä siirtyy proteiinisubstraatin Lys-jäännöksen ɛ-NH2-ryhmään isopeptidisidoksen muodostamiseksi. Peräkkäisissä reaktioissa polyubikitiiniketju syntetisoidaan siirtämällä prosessinomaisesti lisää aktivoituja osia aiemmin konjugoidun ubikitiinimolekyylin Lys48:aan. Ketju toimii todennäköisesti proteasomin tunnistusmerkkinä (ks. jäljempänä). Ubikitiini K48R tai metyloitu ubikitiini (jossa kaikki vapaat aminoryhmät on muunnettu kemiallisesti) eivät pysty muodostamaan polyubikitiiniketjuja, ja ne toimivat ketjun lopettajina. Näin ollen ne estävät proteolyysiä, kun niitä yliekspressoidaan soluissa tai viedään soluttomiin järjestelmiin. Substraatin sitoutuminen E3:een on spesifistä, ja se viittaa siihen, että E3:lla on merkittävä rooli proteiinien tunnistamisessa ja valinnassa konjugoitumista ja sitä seuraavaa hajoamista varten. Järjestelmän rakenne näyttää olevan hierarkkinen: yksi E1 näyttää toteuttavan kaikkien modifikaatioiden edellyttämän ubikitiinin aktivoinnin. Nisäkässoluissa karakterisoitiin useita tärkeitä E2-entsyymilajeja. Näyttää siltä, että kukin E2 voi toimia yhden tai useamman E3-entsyymin kanssa. Vaikka tähän mennessä on kuvattu vain suhteellisen vähän E3-entsyymejä, näyttää siltä, että ubikitiiniligaasit kuuluvat suureen, yhä kasvavaan entsyymiperheeseen. Mitä tulee ligaasien tunnistustapaan, on epätodennäköistä, että muutamaa tapausta lukuun ottamatta kukin E3 kohdistuu vain yhteen substraattiin. Pikemminkin on mahdollista, että yksi ligaasi tunnistaa useita eri soluproteiineja samankaltaisen, mutta ei selvästikään identtisen, rakenteellisen motiivin avulla. Muutamat proteiinit voidaan tunnistaa niiden vapaan ja ”epävakauttavan” N-terminaalijäännöksen kautta (”N-pään sääntö”; viite 6). Valtaosa soluproteiineista on kuitenkin asetyloitu N-terminaaleistaan tai niillä on ”stabiloiva” aminoterminaali, ja niiden kohdentaminen tapahtuu erilaisten signaalien kautta. Jotkin tunnistetaan N-päätteisen jäännöksen alapuolella olevien primaarisekvenssien kautta. Toiset kohdentuvat sekundaaristen, posttranslationaalisten modifikaatioiden, kuten fosforylaation, kautta tai sen jälkeen, kun ne ovat assosioituneet liitännäisproteiinien, kuten onkoproteiinien tai molekulaaristen chaperonien, kanssa.

Konjugaation jälkeen proteasomikompleksi hajottaa adduktin proteiiniosan ja vapaa ja uudelleenkäytettävissä oleva ubikitiini vapautuu (viimeaikaiset katsaukset proteasomeihin, ks. refs. 7-10). Vaikka nykyinen yksimielisyys on, että 26S-proteasomi toimii ubikitiinijärjestelmän pääasiallisena proteolyyttisenä haarana, entsyymin substraattispektri voi olla laajempi ja sisältää myös muita kuin ubikitinyloidut proteiinit. Yksi hyvin tutkittu tapaus on ornitiinidekarboksylaasi (ODC). ODC hajoaa sen jälkeen, kun se on muodostanut ei-kovalenttisen assosiaation antientsyymin kanssa, joka saattaa toimia tunnistamisprosessissa substraattispesifisenä ubikitiinin kaltaisena chaperonina. Proteasomi voi hajottaa myös muita substraatteja, lähinnä endoplasmisen retikulumin (ER) proteiineja, ilman edeltävää ubikitinylaatiota, vaikka tätä ei olekaan varmuudella osoitettu. Tällaisia voivat olla esimerkiksi vääristyneet MHC:n raskaan ketjun molekyylit (HC), nisäkkäiden 3-hydroksi-3-metyyliglutaryyli CoA (HMG-R) ja α-1-antitrypsiinin Z-variantti (α1-ATZ) (ks. viite 11). Nyt on myös selvää, että kaikki ubikitinyloidut proteiinit eivät ole proteasomin hajotuskohteita. Tämä koskee lähinnä solupinnan kypsiä kalvoproteiineja, kuten kasvuhormonireseptoria. Näiden proteiinien kohdalla ubikitiinimodifikaatio tapahtuu ligandin sitoutumisen jälkeen, ja sitä tarvitaan niiden endosytoosiin ja kohdentumiseen lysosomiin (ks. viite 12). Kalvoankkuroituneiden proteiinien hajoaminen ubikitiinijärjestelmän avulla herättää tärkeitä, mutta vielä ratkaisemattomia mekanistisia ongelmia, jotka liittyvät lähinnä siihen, miten kaksi topologisesti erilaista tapahtumaa, kuten vääränlainen taittuminen ER:ssä ja hajoaminen sytosolissa tai ligandin sitoutuminen solunulkoisessa domeenissa ja ubikitinylaatio reseptorin sytosolisessa hännässä, yhdistyvät. Solupinnan kalvoproteiinien osalta ilmeinen ongelma liittyy ubikitiinimodifikaation rooliin: tarvitaanko sitä merkityn proteiinin endosytoosiin vai myöhemmässä vaiheessa sen spesifiseen kohdentamiseen ja ottamiseen lysosomiin. Sytosolisen proteasomin hajottamien ER-proteiinien osalta tärkeät kysymykset liittyvät mekanismeihin, joilla nämä proteiinit saadaan kalvon läpi takaisin sytosoliin. Kalvoon ankkuroituneiden proteiinien transmembraanidomeeni on hydrofobinen, ja sen poistuminen kalvolta edellyttää todennäköisesti erikoistunutta, energiasta riippuvaista, kanavapohjaista kuljetusta. Lumenaalisten ER-proteiinien osalta kysymys keskittyy siihen, miten ne kuljetetaan takaisin sytosoliin.

Uudet todisteet viittaavat siihen, että ubikitiinimodifikaation periaate ei rajoitu proteiinien kohdentamiseen hajotettavaksi. Näyttää siltä, että ubikitiini on suuremman perheen jäsen, ja myös useita ubikitiinin kaltaisia proteiineja on kuvattu. Yksi mielenkiintoinen tapaus liittyy kohdentamiseen monimutkaisiin rakenteisiin. Todettiin, että RanGAP1:n, Ran GTPaasia aktivoivan proteiinin RanGAP1:n lokalisaatio ydinhuokoskompleksin proteiiniin RanBP2:een on riippuvainen yhdestä ainoasta ja vakaasta kovalenttisesta modifikaatiosta, jonka on tehnyt 11,5 kda:n kokoinen, 101 jäännettä sisältävä ubikitiinin kaltainen proteiini, SUMO-1 (13). Aktivointireaktio on samanlainen kuin ubikitiinin, ja siihen osallistuvat E1 ja spesifinen E2, UBC9. Näin ollen ubikitiinin ja ubikitiinin kaltaisten molekyylien transtranslaation jälkeinen kovalenttinen modifikaatio palvelee monenlaisia toimintoja. Se osallistuu proteiinien kohdentamiseen proteasomin ja lysosomin hajotettavaksi, mutta sillä on myös muita kuin proteolyyttisiä tehtäviä.

Parhaiten tutkittu proteasomikompleksi, joka osallistuu ubikitiinimerkittyjen proteiinien hajottamiseen, on 26S-proteasomikompleksi. Se on symmetrinen rakenne, joka koostuu katalyyttisestä ydinyksiköstä, tynnyrinmuotoisesta 20S-proteasomikompleksista, jota reunustavat molemmin puolin 19S-proteasomikompleksit (19S-20S-19S). Eukaryoottisen (hiivan) 20S-proteasomin kiderakenne on ratkaistu 2,4 Å:n tarkkuudella (14). Tutkimus on vahvistanut aiemmat ennusteet kompleksin rakenteesta, mutta paljastanut myös joitakin odottamattomia piirteitä. Hiivakompleksi on järjestäytynyt neljän renkaan pinoksi, joista kukin sisältää seitsemän erillistä alayksikköä, α1-7β1-7β1-7β1-7α1-7. Eri α- ja β-alayksiköiden molekyylimassat ovat välillä 25-30 kDa. Aktiiviset alueet sijaitsevat kolmessa β-alayksikössä, β1, β2 ja β5, mutta eivät α-alayksiköissä. Eri alayksiköiden sijainnin topologinen analyysi on paljastanut, että kolmen erilaisen proteolyyttisen aktiivisuuden, trypsiinin kaltaisen, kymotrypsiinin kaltaisen ja postglutamyylipeptidyylihydrolyyttisen aktiivisuuden, aktiiviset kohdat muodostuvat vierekkäisistä pareista identtisiä β-tyypin alayksiköitä, jotka sijaitsevat eri β-renkaissa. Aktiivisen alueen jäännösten analyysi paljastaa uudenlaisen proteolyyttisen mekanismin. Kolme β-alayksikköä käyvät läpi autokatalyysin pro-peptidin viimeisen Gly-jäännöksen ja kypsän alayksikön Thr1:n välillä, joka osallistuu autokatalyyttiseen prosessiin ja josta tulee olennainen osa katalyyttistä kohdetta. Kiderakenteen resoluutio mahdollisti myös eri proteasomi-inhibiittorien vaikutustapojen paremman ymmärtämisen. Thr1 β1:ssä, β2:ssa ja β5:ssä sitoo vähemmän spesifistä kalpaiini I:n estäjää asetyyli-Leu-Leu-Norleukinaalia (ALLN). Lactacystin, spesifisempi inhibiittori, voi sitoutua kovalenttisesti β5:een, jossa se voi lisäksi luoda lukuisia vetysidoksia muiden ympäröivien sivuketjujen kanssa. Mutaatioanalyysi on paljastanut, että muut β-alayksiköt, erityisesti β4 ja β7, jotka sijaitsevat β5:n ja β1:n vieressä, vaikuttavat näiden alayksiköiden aktiivisuuteen. Myös β6 ja β7 syntyvät pro-proteiineista spesifisen prosessoinnin kautta. β3 ja β4 eivät prosessoidu. Koska propeptideillä on mahdollinen rooli alayksiköiden välisten kontaktien luomisessa ja kompleksirakenteen vakauttamisessa, vaikuttaa siltä, että propeptidit ovat välttämättömiä proteasomaalisen rakenteen biogeneesille ja vakauttamiselle, ja prosessointi tapahtuu vasta kokoamisen jälkeen. Kiderakenne on myös osoittanut, että vaikka α-ketjut ovat katalyyttisesti inaktiivisia, niillä on olennainen rooli β-ketjujen kahden renkaan rakenteen vakauttamisessa. Niillä on oltava merkitystä myös 19S-cap-kompleksien sitoutumisessa, mutta kontaktien rakenne ja sitoutumismekanismit selviävät vasta, kun 26S-kompleksin kiderakenne saadaan ratkaistua. Kiderakenne on myös paljastanut 28 Å:n etäisyyden vierekkäisten aktiivisten β-alayksiköiden Thr1-jäännösten välillä. Tämä etäisyys määrittää todennäköisesti proteolyyttisen prosessin aikana syntyvien peptidien pituuden (≈8-aa jäännökset) ja selittää proteasomin roolin luokan I MHC-molekyyleissä esitettyjen antigeenisten peptidien synnyssä. Pituudeltaan vaihtelevien välituotteiden olemassaolo viittaa kuitenkin siihen, että Thr1:n alapuolella on toinen hydrolyyttinen kohta (ks. jäljempänä).

Tärkeä, mutta vielä ratkaisematon ongelma liittyy proteiinisubstraattien tuloon ja proteolyyttisten tuotteiden poistumiseen proteasomista. Arkeobakteerien (Thermoplasma acidophilum) proteasomissa on kaksi ≈13 Å:n suuruista sisääntulohuokosta sylinterin molemmissa päissä, joita ympäröivät seitsemän α-ketjun määritellyt segmentit. Silmiinpistävänä ja melko yllättävänä vastakohtana näitä sisääntuloportteja ei ole eukaryoottisessa 20S-proteasomissa, eikä pääsy β-renkaiden väliseen katalyyttiseen kammioon ole mahdollista kompleksin päistä. α1:n, α2:n, α3:n, α6:n ja α7:n N-terminaaliset domeenit työntyvät toisiaan kohti ja täyttävät tilan useilla kerroksilla tiukasti vuorovaikutuksessa olevia sivuketjuja. Näin ollen pääsy päädyistä on mahdollista vasta huomattavan uudelleenjärjestelyn jälkeen, joka voi mahdollisesti tapahtua 19S-kompleksiin liittymisen jälkeen. Tällainen uudelleenjärjestely voi myös vaatia metabolista energiaa, jota useiden 19S-kompleksin alayksiköiden ATPaasiaktiivisuus voi tuottaa. Hiivakompleksissa on joitakin kapeita sivuaukkoja, erityisesti α- ja β-renkaan rajapinnassa. Nämä aukot johtavat suoraan Thr1-aktiivisiin alueisiin. Ne on päällystetty polaarisilla jäännöksillä, jotka voivat mahdollisesti järjestäytyä uudelleen muodostaen ≈10 Å:n aukkoja, joiden kautta taitamattomat ja pidennetyt proteiinisubstraatit voivat päästä sisään.

20S-proteasomin aktiivisuuden säätely tapahtuu useilla tasoilla. Antigeeniä esittelevien solujen stimuloinnin jälkeen interferoni γ:llä kolme konstitutiivista β-alayksikköä, 1, 2 ja 5, korvataan uusilla ja erillisillä β-alayksiköillä, β1i (LMP2), β2i (MECL1) ja β5i (LMP7). Uudet alayksiköt tuottavat suhteellisesti tehokkaammin antigeenisiä peptidejä, jotka MHC-luokan I molekyylit ja asianmukaiset sytotoksiset T-solut tunnistavat T-solureseptorien kautta. Toisenlaiseen säätelyyn liittyy kompleksinmuodostus säätelykompleksien kanssa. 26S-proteasomi syntyy 20S-kompleksin ja kahden 19S-kompleksin ATP-riippuvaisen assosioitumisen jälkeen. 19S-kompleksit koostuvat ainakin 18 eri proteiinista, joiden molekyylimassat ovat 25-110 kDa. Tämä kompleksi toimii katalyyttisen ytimen porttina ja tarjoaa erilaisia säätelytoimintoja, jotka ovat välttämättömiä ubikitiini-merkittyjen substraattien selektiivisen hajottamisen varmistamiseksi. Näitä ovat esimerkiksi ubikitiiniketjujen sitoutumiskohta, ubikitiinin kierrätysaktiivisuus ja useat ATP:t sekä kyky stimuloida 20S-kompleksin erilaisia peptidaasiaktiivisuuksia. Tällaisia toimintoja suorittavia alayksiköitä onkin tunnistettu. Erityisen kiinnostava on ubikitiiniketjuja sitova alayksikkö, joka on kuvattu sekä nisäkkäillä (S5a) että kasveilla (MBP1). Nämä alayksiköt sitovat ubikitiinimonomeerejä, mutta polyubikitiiniketjut ja erityisesti ne, jotka sisältävät enemmän kuin neljä osaa, sitoutuvat niihin suuremmalla affiniteetilla. Hiljattain on kloonattu hiivan geeni, joka koodaa homologista ketjua, Mcb1:tä. Yllättäen Δmcb1-deletiomutaantit eivät osoita kasvuvirhettä ja hajottavat normaalisti ubikitinyloidut proteiinit, lukuun ottamatta lineaarista fuusiomalliproteiinia ubikitiini-Pro-β-Gal. Ne osoittavat kuitenkin lievää herkkyyttä stressille, kuten altistumiselle aminohappoanalogeille (15). Mahdollinen selitys näille odottamattomille tuloksille on se, että ubikitinyloidut proteiinit tunnistaa toinen, vielä määrittelemätön proteasomaalinen alayksikkö. Yksi tällainen ehdokas on deubikvitinyloiva entsyymi Doa4, jonka tehtävänä on poistaa ubikitiiniryhmiä proteolyyttisistä substraateista. Kaukaisena mahdollisuutena on, että proteasomi ei tunnista ubikitiiniryhmiä, mutta molekulaaristen chaperonien tapaan se assosioituu proteiinisubstraatin huonosti määriteltyihin vääristyneisiin motiiveihin. Nämä motiivit syntyvät sen jälkeen, kun proteiini on ”denaturoitu” ubikitiinimerkinnän avulla. Proteasomin tunnistamisen spesifisyyden ja ubikitiinin roolin selvittäminen tässä prosessissa ovat olennaisen tärkeitä proteaasin ja yleensä ubikitiinijärjestelmän toimintamekanismien ymmärtämiseksi. Toinen 19S-proteasomin säätelytehtävä liittyy polyubikitiiniketjujen muokkaamiseen. Kompleksi sisältää 37 kDa:n isopeptidaasia, joka poistaa yksittäisiä ubikitiiniryhmiä lyhyiden polyubikitiiniketjujen distaalisesta päästä (16). Oletetaan, että tämä isopeptidaasi osallistuu huonosti ubikitinyloidun tai hitaasti hajoavan proteiinin muokkaamiseen ja pelastamiseen hajoamiselta. Se eroaa tässä suhteessa Doa4:stä ja ATP-riippuvaisesta isopeptidaasista, joka liittyy proteasomiin. Nämä kaksi entsyymiä osallistuvat ubikitiinin kierrätykseen ja vapaan ubikitiinin tason ylläpitämiseen solussa.

Toinen kompleksi, joka assosioituu 20S-proteasomiin ja lisää dramaattisesti sen aktiivisuutta, on PA28 (REG tai 11S-regulaattori; viitteet 17 ja 18). Toisin kuin assosiaatio 19S:n kanssa, kompleksin muodostuminen PA28:n kanssa on ATP:stä riippumatonta. Yhdistymisen jälkeen PA28 lisää 20S-kompleksin Vmax-arvoa ja pienentää Km-arvoa koko joukon eri peptidejä kohtaan. PA28-20S-PA28-kompleksi on kuitenkin inaktiivinen ehjiä natiiveja tai ubikitiinikonjugoituja proteiineja kohtaan. Puhdas aktivaattori on kahden ≈28 kDa:n alayksikön, PA28α:n ja PA28β:n, muodostama kompleksi, jotka ovat ≈50 % identtisiä. Immunoprecipitointi alayksikköspesifisillä vasta-aineilla ja kemialliset ristisilloituskokeet paljastivat, että PA28 on rengasmainen heksameeri, joka koostuu vuorotellen α- ja β-alayksiköistä, joiden stoikiometria on (αβ)3 (19). Mielenkiintoista on, että nämä alayksiköt ovat myös 30-40-prosenttisesti identtisiä toistaiseksi tuntemattoman funktionaalisen ydinproteiinin, Kiantigeenin, kanssa, joka reagoi autoimmuunisairautta systeemistä lupus erythematosusta sairastavien potilaiden seerumien kanssa. Heksameerisellä kompleksilla on rengasmainen rakenne (kuva 1), ja se peittää 20S-proteasomikompleksin joko toisella tai molemmilla päätylevyillä. Korkkirakenteen läpi kulkee keskuskanava, jonka ääripäässä on 20 Å:n aukko ja proteasomia sitovalla pinnalla 30 Å:n aukko (20, 21). Aukot ja kanava toimivat todennäköisesti osana peptidisubstraattien translokaatiokoneistoa matkalla 20S-kompleksin katalyyttiseen kammioon. PA28α voi muodostaa heksa- tai hepta-homomultimeerejä, jotka assosioituvat 20S-kompleksiin ja aktivoivat sitä, joskin vähemmän tehokkaasti kuin (αβ)3-heteromultimeeri. Sitä vastoin PA28β ei assosioidu 20S-kompleksiin eikä sillä ole stimuloivaa aktiivisuutta. β-alayksiköiden tehtävänä on todennäköisesti moduloida PA28:n aktiivisuutta vaikuttamalla epäsuorasti α-alayksiköiden aktiivisuuteen tai muuttamalla PA28-partikkelin affiniteettia 20S-proteasomiin.

PA28α sisältää keskiosassaan ainutlaatuisen sekvenssin, KEKE-motiivin, joka on hydrofiilinen domeeni, joka muodostuu vuorottelevista positiivisesti varautuneista Lys-jäännöksistä ja negatiivisesti varautuneista Glu-jäännöksistä. On esitetty, että tämä motiivi, jota ei ole PA28β:ssä, edistää PA28-hiukkasen α-alayksiköiden ja 20S-proteasomin α-alayksiköiden välistä proteiini-proteiini-interaktiota (22). Mutaatioanalyysi osoitti kuitenkin, että ΔKEKE PA28α säilyttää stimuloivan aktiivisuutensa (23). Sitoutuminen 20S-proteasomiin edellyttää kuitenkin PA28α:n ehjää C-terminaalia, ja siihen saattaa liittyä 20S-proteasomin C2 α-alayksikkö (8). On ehdotettu, että fosforylaatio aktivoi PA28α:n stimuloivan aktiivisuuden, mutta tätä säätelytapaa ei ole vahvistettu.

Zhangin ja työtovereiden (5) tekemä PA28α:n mutaatioanalyysi paljasti useita inaktivoivia mutaatioita molekyylin tyvessä sijaitsevassa määritellyssä silmukassa. Osa mutaatioproteiineista sitoutuu tiukasti 20S-kompleksiin, mutta ei pysty aktivoimaan sitä (5). Siten sitoutuminen proteasomiin voidaan selvästi erottaa PA28:n stimuloivasta aktiivisuudesta. Mielenkiintoista on, että aminohappojäännökset 51-122 kattavien inaktivoivien mutaatioiden jakautumisessa on suuri ero. Tämä mutaatiovapaa vyöhyke edustaa aluetta, joka on ainutlaatuinen jokaiselle PA28-kompleksin alayksikölle. Se ei todennäköisesti osallistu PA28:n vuorovaikutukseen 20S-kompleksin kanssa tai sen proteolyyttisen aktiivisuuden stimulointiin. Pikemminkin sillä saattaa olla merkitystä hiukkasen toiminnassa ehjässä solussa, kuten sen solunsisäisessä lokalisaatiossa tai assosiaatiossa muiden komponenttien kanssa, jotka määrittävät sen spesifisen aktiivisuuden ja vuorovaikutukset.

Tärkeä ongelma liittyy PA28:n fysiologisiin tehtäviin. Molemmat alayksiköt indusoituvat selvästi interferoni γ:n vaikutuksesta, mikä viittaa hiukkasen rooliin proteasomin antigeeniprosessointitoiminnossa. PA28α:n yliekspressio hiiren fibroblastilinjassa, joka ilmentää sytomegaloviruksen pp89-proteiinia, johtaa pp89-spesifisten sytotoksisten T-solujen tunnistuksen huomattavaan tehostumiseen. Vastaavasti myös influenssan nukleoproteiinin esittely tehostui (24). Soluvapaassa järjestelmässä tehdyt tutkimukset osoittivat, että PA28-20S-PA28-kompleksi voi koordinoidun kaksinkertaisen pilkkomismekanismin avulla leikata tehokkaasti suuret peptidit (joilla on rinnakkaisia sekvenssejä sekä N- että C-terminaaleissa) täsmällisiin antigeenisiin epitooppeihin, jotka MHC-kompleksi ja sopiva sytotoksinen T-solu tunnistaa (25). Näyttää siis siltä, että PA28:lla on tärkeä rooli antigeenien prosessoinnissa, jotta ne voidaan esittää luokan I MHC-molekyyleissä. Koska PA28-20S-PA28-proteasomi ei voi pilkkoa ehjiä natiiveja tai ubikitinyloidut proteiineja, sen on toimittava alavirtaan 19S-20S-19S-proteasomin jälkeen, joka pilkkoo ubikitiinimerkittyjä proteiineja tai suuria peptidejä. On myös mahdollista, vaikkakaan sitä ei ole osoitettu, että on olemassa yksi ainoa epäsymmetrinen 19S-20S-PA28-proteasomi, joka pystyy suorittamaan tämän kaksivaiheisen proteolyyttisen prosessin, alkuproteolyysin suuriksi peptideiksi ja lopullisen trimmauksen. Symmetriset tai oletetut epäsymmetriset PA28:a sisältävät proteasomit voivat myös osallistua peptidien terminaaliseen hajottamiseen vapaiksi aminohapoiksi, toimintaa, jota 19S-20S-19S-proteasomi ei voi katalysoida (kuva 1). Näyttää siis siltä, että PA28-kompleksin solutason tehtävien selvittäminen jää odottamaan lisäkokeita.

.