Ribosomitekniikka paljastaa 5S rRNA:n autonomian merkityksen ribosomien kokoamiselle

Plasmidien rakentaminen

Kaikki plasmidit rakennettiin Gibsonin assosiointimenetelmällä50 , jolloin plasmidien selkärangat valmistettiin käänteisellä PCR:llä tai restriktio- nukleaasien digestoinnilla, ja inserttiliitännäiset generoitiin PCR:llä tai syntetisoitiin kemiallista menetelmää käyttäen Integrated DNA Technologiesilla. RRNA:ta koodaavat plasmidit elektroporatoitiin aluksi E. coli POP2136 -soluihin (kaikkien tässä tutkimuksessa käytettyjen kantojen genotyypit on lueteltu lisätaulukossa 1), ja transformantit kerättiin talteen LB-levyille, joita täydennettiin asianmukaisilla antibiooteilla; levyjä inkuboitiin 30 °C:n lämpötilassa, jotta estettäisiin rRNA-geenien ilmentyminen, jota ohjataan lambda-PL-promoottorilla31. Kaikki muut plasmidit transformoitiin ja lisättiin E. coli JM109 -kannassa ja kasvatettiin 37 °C:ssa LB-mediassa, jota täydennettiin tarvittaessa 100 μg/ml ampisilliinilla (Amp), 50 μg/ml kanamysiinillä (Kan) tai 50 μg/ml spektinomysiinillä (Spc).

PtRNA100-plasmidin rakentaminen

Plasmidin selkäranka, mukaan lukien pA15-replikaatioalkio ja Spc-resistenssigeeni, monistettiin PCR:llä ptRNA67-plasmidista51 käyttäen alukkeita NA1 ja NA2 (kaikki alukkeet on lueteltu lisätaulukossa 4). Ptac-promoottorin ja T1-terminaattorin valvonnassa oleva tRNA-geeniklusteri (joka koodaa tRNAGlu-, tRNAAla-, tRNAIle-, tRNATrp- ja tRNAAsp-geenejä) syntetisoitiin gBlockina (Integrated DNA Technology). PTRNA100-plasmidi tuotettiin Gibsonin assosioinnilla. Plasmidin rakenne varmistettiin restriktiodigestillä, ja plasmidiin syntyneen tRNA-klusterin läsnäolo varmistettiin PCR-monistamalla käyttäen alukkeita NA3 ja NA4 ja sekvensoimalla.

Plasmidien pDH42, pDH39 ja pCH84 rakentaminen

Hybridi 23S-cp5S rRNA-geeniä kantavat konstruktiot luotiin E. coli rrnB rRNA-operonia sisältävän plasmidin pAM55229 pohjalta. 5S rRNA-geeni poistettiin käänteisellä PCR:llä käyttäen alukkeita NA17 ja NA18, joissa on Xho1-restriktiokohta, pilkkomalla PCR-tuote Xho1:llä ja DNA:n ligaatiolla. Ery-resistenssimutaatio A2058G lisättiin sitten 23S rRNA-geeniin paikkaohjatulla mutageneesillä käyttäen QuikChange Lightning Multi Site-directed mutagenesis kittiä (Agilent Technologies) ja aluketta NA7. Tuloksena saatua plasmidia, pAM552Δ5S, käytettiin cp5S rRNA -geenien tuomiseen linkkereillä kolmeen eri kohtaan 23S rRNA -geenin sisällä.

Cp5S rDNA-sekvenssin valmistaminen 23S rDNA:han integroitumista varten suoritettiin yhdessä PCR-reaktiossa, jossa cp5S rDNA-inserttiä sisältävän cp5S rDNA-sekvenssin sisältäviä alukepareja NA8/NA9 (DH39- ja DH42-konstruktioita varten) tai NA26 ja NA27 (CH84-konstruktiota varten) (100 nM kutakin), yhdistettiin alukepareihin (250 nM kumpikin), jotka lisäsivät satunnaisia sekvenssilinkkereitä, joiden koko vaihteli 0-3 nt:n välillä, ”vasempaan” ja ”oikeaan” 23S-cp5S-liitokseen seuraavasti: DH39:n osalta NA10-NA13 ja NA14-NA17; DH42:n osalta NA18-NA21 ja NA22-NA25; CH84:n osalta NA28-NA31 ja NA32-NA35.

DH39-, DH42- ja CH84-plasmidikirjastojen tuottamiseksi pAM552Δ5S-plasmidi avattiin käänteisellä PCR:llä käyttäen alukepareja NA36/NA37, NA38/NA39 ja NA40/NA41. cp5S-rDNA-insertit lisättiin tuloksena saatuihin PCR:llä monistettuihin plasmidirunkoihin Gibsonin assembly-reaktioilla. Reaktiotuotteet transformoitiin E. coli POP2136 -soluihin elektroporaatiolla, ja transformantit kerättiin talteen LB/Amp-agar-levyillä, joita kasvatettiin 30 °C:ssa (olosuhteet, jotka estävät plasmidissa olevan rRNA:n ilmentymisen). Jokaisessa kirjastossa oli vähintään kolme kertaa enemmän klooneja kuin arvioitu teoreettinen 7225 muunnoksen monimuotoisuus. Pesäkkeet pestiin LB-levyiltä, plasmidikirjastot uutettiin ja varastoitiin.

PtRNA67:n korvaaminen ptRNA100:lla

E. coli SQ171-kantaa, josta puuttuvat kromosomaaliset rRNA-alleelit ja joka kantaa pCSacB-plasmidia rRNA-geenien lähteenä ja ptRNA67-plasmidia puuttuvien kromosomaalisten tRNA-geenien lähteenä32,52, käytettiin lähtö-isäntäkantana. Jotta ptRNA67-plasmidi voitiin korvata ptRNA100:lla, SQ171-solut transformoitiin ensin ptRNA-Amp:lla (jonka toimitti Michael O’Connor, Missourin yliopisto, Kansas City), joka muistuttaa ptRNA67:ää mutta antaa Amp-resistenssin ja sisältää pBR322-replikaatioperustan. Tämän jälkeen transformanteista poistettiin ptRNA67-plasmidi syöttämällä niitä LB-mediassa, jota oli täydennetty Ampilla ja Kanilla, ~100 sukupolven ajan. ptRNA67-plasmidin häviäminen varmistettiin kloonien herkkyydellä Spc:lle replikaatioiden yhteydessä. Tuloksena syntynyt kanta transformoitiin sitten ptRNA100:lla ja kasvatettiin LB-agarille, jota täydennettiin Spc:llä ja Kanilla. Transformantteja kasvatettiin ~100 sukupolven ajan LB-mediassa, jota täydennettiin Spc:llä ja Kanilla. ptRNA-Amp-plasmidin häviäminen todennettiin yksittäisten kloonien herkkyydellä Ampille, mikä ilmeni replikaatioiden avulla. ptRNA100:n läsnäolo ja ptRNA67:n puuttuminen todennettiin lisäksi PCR:llä ja restriktiodigestiolla tuloksena saadusta kloonista valmistetuista kokonaisplasmidista.

RecA-geenin inaktivointi SQ171/ptRNA100-soluissa

SQ171/ptRNA100-kannan recA-geeni inaktivoitiin P1-faagitransduktiolla. Luovuttajakanta BW25113 recA::cat valmistettiin ensin perinteisellä rekombinointimenetelmällä52 käyttäen pKD3-plasmidista52 peräisin olevaa kloramfenikoli (Chl)-resistenssikasettia. Kasetti monistettiin PCR:llä käyttäen alukkeita NA42 ja NA43. PCR-fragmentti transformoitiin BW25113-kantaan, jossa oli punaista rekombinaasia ilmentävä plasmidi pDK46. Kun kissakasetin integroituminen oli varmistettu ja pKD46 oli kovetettu, BW25113:n recA::cat-soluja käytettiin luovuttajina faagitransduktiossa. P1-faagien transduktio suoritettiin standardiprotokollan53 mukaisesti, paitsi että elpymisinkubaatiota pidennettiin 1 tunnista 3 tuntiin ennen transduktanttien levittämistä LB/agar-levyille, joita oli täydennetty Kanilla, Spc:llä ja 15 μg/ml Chl:llä. Kissakasetin poistamiseksi saatu kanta transformoitiin pZFLP-TetR-plasmidilla, joka koodaa flippaasientsyymiä, ja transformantit kasvatettiin LB/agar-levylle, jota täydennettiin Kanilla, Spc:llä ja 2,5 μg/ml tetrasykliinillä (Tet). Kat-geenin poistaminen varmistettiin PCR:llä ja kloonien Chl-herkkyydellä. Tämän jälkeen pZFLP-TetR-plasmidi parannettiin pois kuljettamalla soluja ~100 sukupolven ajan LB-mediassa, jota täydennettiin Kanilla, Spc:llä, ja tuloksena saadut kloonit testattiin Tet-herkkyyden suhteen. Tuloksena syntynyt kanta nimettiin SQA18-kannaksi (lisätaulukko 1).

23S-cp5S-kirjastojen istuttaminen SQA18-soluihin

POP2136-soluista uutetut plasmidikirjastot transformoitiin SQA18-soluihin elektroporaatiolla. Kun transformantit oli palautettu 2 tuntia 37 °C:ssa, ne istutettiin LB/Amp-agarlevyille, joita inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa. Pesäkkeet pestiin agarilevyiltä ja 0,01 A600 (~106 solua) sijoitettiin 2 ml:n tilavuuteen LB-väliaineeseen, jota täydennettiin 150 μg/ml Eryllä ja 0,25 % sakkaroosilla. Kun soluja oli kasvatettu 16 tuntia, ne istutettiin agarilevyille, jotka sisälsivät Ampia, 1 mg/ml Eryä ja 5 % sakkaroosia. Levyjä inkuboitiin 48 tuntia 37 °C:ssa. Elinkelpoisia pesäkkeitä esiintyi DH42- ja CH84-kirjastoilla, mutta ei DH39-kirjastolla. Useat levyille ilmestyneistä pesäkkeistä testattiin pesäkkeiden PCR:llä 23S-cp5S rDNA:n esiintymisen varalta käyttäen alukepareja NA44/NA45 DH42-konstruktiolle ja alukkeita NA46/NA47 CH84-konstruktiolle. Wt 5S rRNA -geenin puuttuminen varmistettiin pesäke-PCR:llä käyttäen alukkeita NA48 ja NA49.

Edullisimpien 23S-cp5S rRNA -linkkereiden valinta

POP2136-soluista eristetty DH42-plasmidikirjasto transformoitiin SQA18-soluihin ja kasvatettiin LB/Amp-levyille edellä kuvatulla tavalla. Pesäkkeet (~50 000) pestiin pois levyltä ja kokonaisplasmidi uutettiin ~109 solusta ja sitä käytettiin esivalintakirjastona.

Tällöin noin 109 solulle tehtiin plasmidinvaihtomenetelmä. Tarkemmin sanottuna ne sijoitettiin 20 ml:n tilavuuteen LB-väliaineeseen, jota oli täydennetty 150 μg/ml Eryllä ja 0,25 % sakkaroosilla. Kun soluja oli kasvatettu 4 tuntia, ne istutettiin agarilevyille, jotka sisälsivät Ampia, 1 mg/ml Eryä ja 5 % sakkaroosia. Levyjä inkuboitiin 48 tuntia 37 °C:ssa. Pesäkkeet (~50 000) pestiin pois levyltä. Näistä soluista uutettu kokonaisplasmidi edusti valinnan jälkeistä kirjastoa.

Cp5S rDNA, jota reunustavat 23S rDNA-sekvenssit ja linkkerit, monistettiin PCR:llä esivalinta- ja valinnan jälkeisen kirjaston plasmidivalmisteista käyttäen alukkeita NA50 ja NA51. PCR-kirjastot sekvensoitiin seuraavan sukupolven sekvensoinnilla.

Kunkin linkkeriyhdistelmän kertainen rikastumiskerroin laskettiin seuraavalla menetelmällä. Adapterin trimmauksen jälkeen poistettiin koko cp5S rRNA:n sekvenssi, lukuun ottamatta kummassakin päässä olevia viimeisiä 4 nukleotidia, jotta vähennettäisiin väärien sekvenssivarianttien määrää, joita esiintyi 5S-koodaavan sekvenssisekvenssin sisällä tapahtuneiden sekvensointivirheiden vuoksi. Tuloksena syntyneet sekvenssimotiivit laskettiin esi- ja jälkivalintakirjastoissa ja laskettiin kunkin linkerivariantin fraktion frekvenssi.

Solujen kokonais-RNA:n valmistus

E. coli POP2136- tai SQA18-kantojen yön yli kasvatetut viljelmät kasvatettiin 30 °C:n tai 37 °C:n lämpötilassa LB/Amp-mediassa. Viljelmät laimennettiin 1:100 2 ml:aan tuoretta elatusainetta ja kasvatettiin 37 °C:ssa A600 ~ 0,5:een. Solut kerättiin sentrifugoimalla (5000 × g, 1 min) ja resuspendoitiin 100 μl:aan lyysipuskuria. Sen jälkeen kun oli lisätty 400 μl uuttopuskuria (50 mM Bis-Tris pH 6,5, 400 mM NaCl, 5 mM EDTA) ja inkuboitu 5 minuutin ajan huoneenlämmössä, RNA:n kokonaismäärä uutettiin fenoli/kloroformiuutolla. RNA saostettiin etanolilla, RNA-pelletti pestiin 1 ml:lla 70-prosenttista etanolia, liuotettiin RNaasivapaaseen veteen, pikapakastettiin ja säilytettiin -80 °C:ssa.

Sukroosigradienttianalyysi ribosomeista ja polysomeista

Yön yli olevat E. coli -viljelmät laimennettiin 50 ml:aan LB/Amp-mediumia, ja ne kasvatettiin tasolle A600 ~ 0,5. Chl lisättiin lopulliseen pitoisuuteen 125 μg/ml, ja 5 minuutin inkubaation jälkeen solut kerättiin sentrifugoimalla (5000 × g, 10 min, 4 °C). Solupelletit resuspendoitiin jääkylmään lyysipuskuriin (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml lysotsyymiä, 0,25 % natriumdeoksikolaattia ja 2U RQ1 RNaasivapaata DNaasi I:tä). Solut lysoitiin kolmella jäädytys-sulatussyklillä. Lysaatit selkeytettiin sentrifugoimalla (20 000 × g, 15 min, 4 °C) ja 20 A260 yksikköä lysaattia ladattiin 12 ml:aan 10-40 %:n lineaarista sakkaroosigradienttia puskurissa 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 2 mM β-merkaptoetanolia. Gradientit sentrifugoitiin (3 h, 4 °C) 39 000 rpm:ssä SW41-roottorissa (Beckman). Gradientit fraktioitiin fraktiointilaitteella (BioComp) ja absorbanssi kirjattiin 254 nm:ssä. 50S-alayksiköitä, 70S-ribosomeja ja polysomeja vastaavat fraktiot yhdistettiin. RNA eristettiin fenoli/kloroformiuutolla ja etanolisakkauksella.

70S-ribosomien ja ribosomaalisten alayksiköiden eristäminen

Tiiviiden ribosomien eristämiseksi54 laimennettiin yön yli kestävät E. coli -viljelmät 1 litraan LB/Amp-mediumia ja kasvatettiin A600:een ~ 0,5. Solut kerättiin sentrifugoimalla (5 000 g, 15 min, 4 °C), resuspendoitiin puskuriin A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0, 6 mM β-merkaptoetanoli, 10 U/ml RNaasivapaata DNaasi I:tä, 10 U/ml, RQ1 RNaasivapaa DNaasi I:tä, 10 000 psi:n paineella ranskalaisella puristimella. Lysaatit selkeytettiin sentrifugoimalla JA25-50-roottorissa (Beckman) 13 000 rpm:n kierrosluvulla 30 minuutin ajan 4 °C:ssa, ja supernatantit ladattiin 10 ml:aan 1,1 M sakkaroosityynyä, joka oli valmistettu puskurissa, joka sisälsi 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA:ta, pH 8,0, ja 6 mM β-merkaptoetanolia, 35 ml:n Quick-Seal- sentrifugiputkiin (Beckman). Ribosomit pelletoitiin sentrifugoimalla 16 tuntia 36 000 rpm (4 °C) Ti70-roottorissa (Beckman). Ribosomipelletti resuspendoitiin puskuriin B (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 6 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl ja 6 mM β-merkaptoetanoli) ja 100 A260-yksikköä ladattiin 10-40-prosenttiseen sakkaroosigradienttiin, joka oli valmistettu puskurissa B SW27-roottorin (Beckman) putkissa. Gradientteja sentrifugoitiin 21 tuntia 20 000 rpm (4 °C) SW27-roottorissa, fraktioitiin gradienttifraktiointilaitteella (BioComp) ja 70S-ribosomeja ja 50S-ribosomaalisia alayksiköitä sisältävät fraktiot yhdistettiin erikseen. Materiaali konsentroitiin 2 ml:n Vivaspin-konsentraattorilla (Sartorius), jossa oli selluloosatriasetaattikalvo, ja se talteenotettiin ribosomien säilytyspuskurissa (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-merkaptoetanoli). Ribosomien ja ribosomaalisten alayksiköiden aliquotit pakastettiin ja säilytettiin -80 °C:ssa. Tarvittaessa rRNA eristettiin fenoli/kloroformiuutolla ja etanolisakkauksella.

50S-alayksiköiden eristämiseksi 70S-ribosomeista käytettiin 130 pmol ribosomeja, jotka valmistettiin edellä kuvatulla tavalla, mutta väkevöitiin pelletöimällä ja säilytettiin ribosomien säilytyspuskurissa (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-merkaptoetanoli) laimennettiin puskurissa D (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 0,5 mM EDTA, 6 mM β-merkaptoetanoli) siten, että saavutettiin 1,5 mM:n lopullinen MgCl2-pitoisuus. Ribosomaaliset alayksiköt erotettiin sentrifugoimalla 10-40-prosenttisiin sakkaroosigradientteihin, jotka oli valmistettu puskurissa D, joka sisälsi 1,5 mM MgCl2. Gradientteja sentrifugoitiin 16 tuntia 27 000 rpm (4 °C) SW27-roottorissa (Beckman), fraktioitiin, konsentroitiin ja talteenotettiin ribosomien säilytyspuskurissa edellä kuvatulla tavalla. Aliquotit pikapakastettiin ja säilytettiin -80 °C:ssa.

LC-MS/MS-analyysi ribosomiproteiineista

Proteiinikoostumus edellä kuvatulla tavalla valmistetuista wt- ja mutantti-tiiviiden 70S-ribosomien ja 50S-ribosomaalisten alayksiköiden proteiinikoostumuksesta määritettiin kvantitatiivista massaspektrometriaa käyttäen55. Ribosomipreparaatit sekoitettiin 1:1-moolisuhteessa SILAC-merkittyihin wt-ribosomeihin, jotka sisälsivät massamerkittyjä arginiinia (Arg6: 6HN4O2) ja lysiiniä (Lys4: C6H104N2O2) (Silantes GmbH, Saksa). Ribosomiproteiinit sulatettiin trypsiinillä (Sigma) tai Lys-C-proteaasilla (Wako, Yhdysvallat). Saadut peptidit fraktioitiin ja analysoitiin LC-MS/MS:llä LTQ-Orbitrap XL:llä (Thermo Scientific). Proteiinien tunnistaminen ja kvantifiointianalyysi suoritettiin käyttäen Maxquant v1.5.6.056 ja Perseus v1.6.2.357. Maxquantin haku tehtiin käyttäen E. coli MG1655 -proteiinisekvenssitietokantaa UniProtKB:stä (24.04.2019). Proteiinien runsaus normalisoitiin erikseen suuren ja pienen alayksikön proteiineille siirtämällä keskimääräinen L/M-suhde arvoon 1.

RRNA:n rakenteen kemiallinen luotaus

rRNA:n rakennetta luotatettiin wt- tai mutanttisoluista eristetyissä 70S-ribosomeissa. Ribosomit (10 pmol) sijoitettiin 50 μl:aan modifiointipuskuria ja aktivoitiin inkuboimalla 5 min 42 °C:ssa. Modifiointireaktio käynnistettiin lisäämällä 2 μl dimetyylisulfaattia (Sigma), joka oli laimennettu 1:10 etanoliin. Näytteitä inkuboitiin 10 min 37 °C:ssa. Muokkausreaktiot pysäytettiin lisäämällä 50 μl tuoretta stop-liuosta (600 mM NaOAc, 1 M β-merkaptoetanoli) ja 300 μl etanolia. Näytteet saostettiin, resuspendoitiin puskuriin (300 mM natriumasetaatti, 5 mM EDTA, pH 8,0, pH 7,0, 0,5 % SDS) ja RNA eristettiin fenoli/kloroformiuutolla ja etanolisakkauksella. Alukkeiden pidennykset tehtiin käyttämällä alukkeita NA56-NA57.

Mutantin rRNA-pitoisuuden analysointi

Teknisesti muunnellun 23S-cp5S-rRNA:n läsnäolon analysoimiseksi RNA:n kokonaismäärä eristettiin sakkaroosigradienttifraktioista edellä kuvatulla tavalla. Mutanttisen 23S-cp5S-rRNA:n pitoisuus arvioitiin alukkeen pidennyksellä käyttäen joko NA58- tai NA59-alukkeita. Tarkemmin sanottuna 5′-merkitty alukke (0,5 pmol) liitettiin 1 μg:aan kokonais-RNA:ta hybridisaatiopuskurissa (50 mM K-HEPES, pH 7,0, 100 mM KCl) inkuboimalla 90 °C:ssa 1 minuutin ajan ja jäähdyttämällä sitten 15 minuutin ajan 42 °C:een, ja pidennettiin 2 U:lla AMV:n käänteistä transkriptaasia (Roche) 20 minuutin ajan 42 °C:ssa lopullisessa reaktiotilavuudessa, joka oli 8 µl. NA58-aluketta varten reaktio sisälsi 0,25 mM ddATP:tä ja 0,2 mM dCTP:tä, dGTP:tä ja dTTP:tä. NA59-aluketta varten reaktio sisälsi 0,25 mM ddCTP:tä ja 0,2 mM dATP:tä, dGTP:tä ja dTTP:tä. Reaktiot lopetettiin lisäämällä 120 μl stop-puskuria (84 mM NaOAc, 0,8 mM EDTA, pH 8,0, 70 % EtOH), jäähdyttämällä -80 °C:ssa 15 minuutin ajan ja pelletöimällä nukleiinihapot sentrifugoimalla 15 000 × g:n voimakkuudella 1 tunnin ajan 4 °C:ssa. Supernatantit poistettiin, pelletit kuivattiin ja liuotettiin formamidin lastausväriin. cDNA-tuotteet erotettiin 12 % denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä ja visualisoitiin fosforikuvauksella.

In vitro-translaatio

In vitro-translaatioreaktiot suoritettiin Δribosome PURExpress -soluvapaassa translaatiojärjestelmässä (New England Biolabs). T7 RNA-polymeraasin promoottorin, ribosomin sitoutumiskohdan ja proteiinia koodaavan sekvenssin sisältävät DNA-patsaat valmistettiin PCR:llä. ErmBL-templaatti valmistettiin käyttämällä alukkeita NA52-NA55. GFP-templaatti tuotettiin plasmidin pY71-sfGFP58 sf-gfp-geenistä käyttäen alukkeita NA31 ja NA32. Dihydrofolaattireduktaasi (DHFR) ekspressoitiin PURExpress kitin mukana toimitetusta plasmidimallista.

Translaatioreaktio GFP:n ekspressiota varten koottiin 10 μl:n kokonaistilavuuteen ja se sisälsi 2 μl PURExpress kitin liuosta A, 1.2 μl faktoriseosta, 1 μl aminohapposeosta (3 mM kukin), 1 μl tRNA:ta (20 μg/ml), 16 U RiboLock RNase-inhibiittoria (ThermoFisher), 10 ng GFP-templaattia ja 12 pmol wt- tai mutanttiribosomeja. Näytteet sijoitettiin 384-kuoppaisen mustaseinäisen/selkeän litteäpohjaisen kudosviljelylevyn (BD Biosciences) kuoppiin ja peitettiin kannella. Reaktioita inkuboitiin 37 °C:ssa mikrolevylukulaitteessa (Tecan), ja GFP:n fluoresenssi rekisteröitiin 10 minuutin välein λexc = 488 nm:ssä ja λem = 520 nm:ssä 4 tunnin ajan.

DHFR:n ekspressiota seurasi -L-metioniinin sisällyttäminen täysikokoiseen proteiiniin. Translaatio suoritettiin 10 μl:n reaktioissa, jotka koottiin edellä kuvatulla tavalla, mutta joita täydennettiin 5 μCi -L-metioniinilla (1175 Ci/mmol), käyttäen 50 ng DNA-templaattia ja 6 pmol wt- tai mutanttiribosomeja. Reaktioita inkuboitiin 37 °C:ssa. 12 minuutin välein otettiin 1 μl:n alivuotoja, sekoitettiin 3 μl:aan SDS:ää sisältävää geelilatausväriä ja säilytettiin jäässä, kunnes reaktiojakso oli päättynyt. Proteiinituotteet analysoitiin SDS-geelielektroforeesilla 16,5 % Bis-Tris-geeleillä (Biorad) käyttäen NuPAGE MES/SDS -juoksupuskuria (Invitrogen). Geelit värjättiin, kuivattiin ja altistettiin fosforimager-seulalle yön yli. Radioaktiiviset kaistat visualisoitiin fosforimaging-menetelmällä.

Cryo-EM-analyysi 70S-ribosomeista ja 50S-alayksiköistä

Cryo-EM-gridit valmistettiin seuraavasti. Pitsihiilellä ja 2 nm:n ohuella hiilikerroksella (Ted Pella Inc.) päällystettyjä 400 M:n kupariverkkoja hehkupurkautettiin 20 mA:n virralla negatiivisella polariteetilla 60S:n ajan PELCO easiGlow -hehkupurkauslaitteessa. Vitrobot Mark IV (ThermoFisher) esitasapainotettiin 4 °C:seen ja 95 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Alikvootti aiemmin pikajäädytettyjä ribosomeja sulatettiin, ja kun havaittiin opalesenssiä, liuos puhdistettiin mikrosentrifugissa (10 minuuttia 16 000 × g:ssa 4 °C:ssa). Puhdistetun supernatantin konsentraatio saatiin A260:sta, joka mitattiin Nanodropilla (ThermoFisher), ja ribosomit laimennettiin 200 nM:iin LPP-puskurissa. Kolme µl 200 nM:n ribosomiliuosta levitettiin ritilälle; 10S:n viiveen jälkeen ritilä blotattiin 4S:n ajaksi ja upotettiin sitten nestemäisellä typellä jäähdytettyyn nestemäiseen etaaniin.

Tiedot kerättiin Talos-elektronimikroskoopilla (ThermoFisher), joka toimi 200 KV:n jännitteellä ja joka oli varustettu K3-suoralla elektronidetektorilla (K3 direct electron detector) (Gatan Inc.), joka tähtää 0,5-1,8 μm:n alitarkkuuteen. Tiedonkeruu automatisoitiin SerialEM59-ohjelmalla, jossa käytettiin säteen kallistusta useiden elokuvien keräämiseksi (esim. yksi otos keskipisteessä, 6 otosta siirrolla) kussakin pöydän asennossa60. Superresoluutioelokuvissa oli yhteensä 19 kuvaa, joissa oli 1,5 e/Å2 kuvaa kohti, eli näytteen kokonaisannos oli 30 e/Å2. Elokuvia kerättiin yhteensä 5222 kappaletta 22 tunnin aikana. Elokuvat linjattiin lennossa tiedonkeruun aikana IMOD61:n avulla, jotta ruudut saatiin purettua, vahvistusreferenssiä käytettiin, superresoluutiotieto binoitiin näytteen 0,87 Å:n fyysiseen pikseleihin ja korjattiin kuvan ajautuminen.

Varhaiset vaiheet 3D-kartan luomisesta CTF:n määrittämisestä, referenssivapaasta hiukkasten poimimisesta (489 732 hiukkasta) ja pinon luomisesta tehtiin cisTEM:ssä. Hiukkasten kohdistaminen ja tarkentaminen suoritettiin Frealign 9.11:ssä ja cisTEMissä62,63. Käsittelyn nopeuttamiseksi valmistettiin 2×-, 4×- ja 8×-binoidut kuvapinot käyttämällä resample.exe-ohjelmaa, joka on osa FREALIGN-jakelua64. Alkuperäinen malli 70S-karttojen hiukkaskohdistusta varten oli EMD-100365, jonka näytteistystä pienennettiin EMAN266:n avulla vastaamaan 8×-niputettua kuvapinoa. Kaksi moodi 3 -hakukierrosta, joissa korkearesoluutioinen rajaus oli 30 Å ja sitten 20 Å, suoritettiin käyttäen 8× binnattua pinoa. Seuraavaksi ajettiin 7 moodi 1 -puhdistuskierrosta 4 ×:lla, lopulta nelinumeroimattomalla pinolla, kun resoluutiokuoria lisättiin vähitellen (5 Å:n raja) ja resoluutio saavutti 2,94 Å:n. Säteensiirto-puhdistusta käytettiin kokonaisresoluution parantamiseksi 2,87 Å:iin.

Kaksikymmentä kierrosta 3D-maksimi-likelihood-luokittelua ilman maskeerausta ja 14 Å:n resoluutioon käytettiin erottamaan nopeasti 8x binoidut hiukkaset 12:een eri koostumukseltaan erilaiseen luokkaan, jotka paljastivat 50S-alayksiköt, 70S-ribosomit ilman tRNA:ta tai 70S-ribosomit, joissa on tRNA:ta ja 30S:n joko kiertyneessä tai kiertymättömässä konformaatiossa (lisäyskuva 3a). 50S-partikkelin (133 490), tyhjän 70S-partikkelin (120 428) tai tRNA:han sidotun, pyörimättömässä tilassa olevan 70S-partikkelin (55 677) alipinot luotiin käyttäen 1x binnattua pinoa käyttäen Frealign-pakettiin kuuluvaa merge_classes.exe-ohjelmaa, joka edellytti, että partikkelien pistemäärät ovat 0 ja että niiden miehitysaste on vähintään 50 %. Tämän jälkeen alipinot binnattiin uudelleen 4x:ksi käyttäen resample.exe-ohjelmaa luokittelun jatkovaiheiden nopeuttamiseksi.

50S-hiukkasten alipino erotettiin kuuteen luokkaan 55 Å:n säteellä 55 Å:n fokusmaskilla 23S-cp5S-hybridi-rRNA:n 5S-rRNA-osan ympärillä. Luokat, joissa uL16 ja/tai bL33 oli heikko tai puuttui, ja 5S rRNA:n sijainnin suhteen eroavat luokat erotettiin toisistaan. Luokat rekonstruoitiin alkuperäisillä kohdistus- ja säteen kallistusparametreilla 1x binningillä, ja yhtä näistä luokista käytettiin rakennemallinnukseen, kuten seuraavassa jaksossa tarkemmin selostetaan.

Myös 70S-hiukkasia tutkittiin. Tyhjä (ei tRNA:ta) 70S-hiukkasten osapaketti erotettiin 12 luokkaan käyttäen samaa 55 Å:n fokusmaskia. Luokissa oli eroja uL16- ja/tai bL33- miehityksessä ja 5S rRNA:n sijainnissa, samoin kuin edellä kuvatuissa 50S-luokissa. Toisin kuin 50S-hiukkasissa, 3 tyhjää 70S-luokkaa 12:sta paljasti kuitenkin normaalisti taitetun PTC:n.

Klassisen tilan tRNA:han sidotun 70S-hiukkasen subackin luokittelu 12 luokkaan samalla maskilla paljasti lähes stoikiometrisen 16 uL:n miehityksen, ja kaikilla hiukkasilla oli normaalisti taitettu PTC ja voimakas P-tRNA-tiheys. Sen sijaan A-kohdan tRNA-varaus oli heikko joissakin luokissa, joissa L33-tiheys oli heikompi. 70S-partikkelien, joissa oli kiertynyt 30S ja hybriditilassa oleva P/E-tRNA, luokittelu 12 luokkaan paljasti myös vaihtelevan uL16:n ja bL33:n miehityksen, ja seitsemässä luokassa PTC oli poikkeava.

Rakenteen hienosäätöjen lähtömallina käytettiin A- ja P-tRNA:n kanssa sidotun 70S-ribosomin 3,2Å:n kryo-EM-rakennetta67 . Ribosomin komponentit/domainit sovitettiin kartoiksi Chimeran68 avulla. Tässä sovitettiin 50S, L1-varsi, L11-varsi, 30S-runko ja -pää sekä tRNA:t toisistaan riippumatta. 5S rRNA:n mallintaminen sekä PTC:n ja dekoodauskeskuksen mukauttaminen tehtiin PyMOL69 -ohjelmalla. Rakennemallit tarkennettiin käyttämällä reaalitilan simuloitua annealing-jalostusta RS Ref 70,71 -ohjelmalla vastaavia karttoja vastaan. Jalostusparametrit, kuten stereokemiallisten rajoitusten ja kokeellisen energiatermin suhteellinen painotus, optimoitiin, jotta saatiin aikaan optimaalinen rakenteen stereokemia, reaalitilan korrelaatiokerroin ja R-kerroin, joka kertoo mallin sopivuudesta karttaan72. Sekundäärirakenteen rajoituksia, jotka koostuvat ribosomiproteiinien vetysidoksia koskevista rajoituksista ja RNA-molekyylien emäspareja koskevista rajoituksista, käytettiin kuvatulla tavalla73. Seuraavaksi rakenteita tarkennettiin käyttämällä phenix.real_space_refine-ohjelmaa74 , minkä jälkeen niitä tarkennettiin RSRef-ohjelmalla käyttäen harmonisia rajoituksia proteiinigeometrian säilyttämiseksi70,71. Phenixiä käytettiin mallien B-kertoimien tarkentamiseen niitä vastaaviin karttoihin nähden ilman B-kertoimen suodatusta74. Tuloksena saaduilla rakennemalleilla on hyvät stereokemialliset parametrit, joille on ominaista vähäinen poikkeama ihanteellisista sidospituuksista ja -kulmista, ja ne ovat läheisessä sopusoinnussa vastaavien karttojen kanssa, kuten korkeat korrelaatiokertoimet ja alhaiset reaalitilan R-kertoimet osoittavat (lisätaulukko 2). Kuviot on laadittu PyMOL69-ohjelmalla.

Raportointiyhteenveto

Lisätietoa tutkimussuunnitelmasta on saatavilla tähän artikkeliin linkitetyssä Nature Research Reporting Summary -julkaisussa.