Plasmidivälitteiset AmpC β-laktamaasi CITM- ja DHAM-geenit gramnegatiivisten kliinisten isolaattien joukossa

Tausta

Resistenssi joidenkin gramnegatiivisten bakteerien (Enterobacterales-, Acinetobacter baumannii- ja Pseudomonas aeruginosa -bakteerien) joukossa on ilmaantunut, ja se on levinnyt maailmanlaajuisesti. Enterobacterales-perheestä Escherichia coli ja Klebsiella spp. ovat usein eristettyjä organismeja, joilla on huomattavia lääkeresistenssiominaisuuksia. β-laktaamit ovat yleisesti määrättyjä lääkkeitä näitä vastustuskykyisiä kantoja vastaan, ja niiden osuus viimeaikaisista kliinisistä lääkemääräyksistä on noin kaksi kolmasosaa.1 Tähän ryhmään kuuluu neljä kemiallista pääluokkaa: penisilliinit, kefalosporiinit, karbapeneemit ja monobaktaamit. Karbapeneemejä käytetään viimeisenä lääkkeenä patogeenisten grampositiivisten, gramnegatiivisten ja anaerobisten bakteerien patogeenisten kantojen empiirisessä hoidossa.2

Resistenssi β-laktameille johtuu β-laktamaasien tuotannosta, eli niistä hydrolyyttisistä entsyymeistä, jotka kykenevät inaktivoimaan antibiootit ennen kuin ne pääsevät sytoplasmakalvolla sijaitseviin penisilliiniä sitoviin proteiineihin (penisilliini binding proteins, PBPs).3 Tärkeimpiä β-laktamaasiperheitä ovat plasmidivälitteiset pidennetyn spektrin β-laktamaasit (Extended Spectrum β-lactamases, ESBL:t), AmpC:t, kefalosporinaasit ja karbapenemasaasi. Kaikkia luokkia on havaittu maailmanlaajuisesti, ja muutamat niistä ovat keskittyneet tiettyihin maihin.1

AmpC β-laktamaasia koodaavat geenit ovat levinneet laajalti, ja niitä havaitaan laajalti bakteerien plasmideissa. Ensimmäinen plasmidilla koodattu AmpC-variantti tunnistettiin ensimmäisen kerran vuonna 1989 Etelä-Koreasta eristetystä Klebsiella pneumoniae -bakteerista. Se nimettiin CMY-1:ksi sen kefamysiiniin liittyvän fenotyyppisen ominaisuuden vuoksi, ja se oli tunnetusti resistentti kefoksitiinille.4,5 Lyhyessä ajassa havaittiin useita plasmidivälitteisten AmpC-varianttien perheitä, pääasiassa K. pneumoniae- ja E. coli -isolaateista. Bakteerit, joilla oli plasmidivälitteisiä AmpC-genotyyppejä, luokiteltiin nukleiinihapposekvenssin homologisuuden perusteella, jolloin muodostui suurempi määrä bakteerisukuja, jotka toimivat näiden plasmidien ja useiden AmpC-perheiden lähteenä6 . Tähän mennessä on raportoitu maailmanlaajuisesti seuraavat AmpC-perheet: kaksi CMY- β-laktamaasiperhettä (CMY-1 ja CMY-2), jotka on eristetty Aeromonas hydrophilasta ja Citrobacter freundii:stä; FOX- ja MOX-tyyppiset entsyymit, jotka on eristetty Aeromonas spp.; ACC-perhe, joka on peräisin H. alvei -bakteerista; LAT-kefalosporinaasiperhe, joka on eristetty C. freundii -bakteerista; MIR- ja ACT-perheet, jotka ovat peräisin Enterobacter spp:stä; ja DHA-perhe, joka on eristetty Morganella morganii -bakteerista4,6,7. Suurin osa plasmidikoodatuista AmpC-geeneistä esiintyy E. coli- ja K. pneumoniae -isolaateissa sairaalainfektioissa, kun taas muiden gramnegatiivisten bakteerien, kuten E. cloacae-, C. freundii-, S. marcescens- ja M. morganii -bakteerien resistenssi perustuu kromosomivälitteisiin AmpC- β-laktaamaaseihin, mikä lisää resistenssiä laajavaikutteisia kefalosporiineja vastaan8 . ESBL:iä tuottavat organismit, joille on usein ominaista yhteisekspressio AmpC β-laktamaasien kanssa, muodostavat vakavan uhan taudinaiheuttajien diagnosoinnissa ja hoidossa.

Lisäksi AmpC β-laktamaasigeenit, erityisesti MOXM, CITM, DHAM, EBCM, FOXM ja ACCM, ovat vastuussa laajakirjoisen resistenssin kehittymisestä useimpia β-laktameja (muita kuin kefepiimiä ja karbapeneemejä) vastaan. Lisäksi näiden geenien hankkiminen bakteereihin voi lisätä resistenssiä entisestään, koska A-luokan entsyymien estäjät (mukaan lukien klavulaanihappo, sulbaktaami ja tatsobaktaami) ja p-kloorimerkuribentsoaatti eivät tehoa AmpC- β-laktamaaseihin, vaikka tatsobaktaami tai sulbaktaami voikin estää joitakin niistä6.

Vaikka lääkkeille resistenttien patogeenien kasvua ja leviämistä pyritään hillitsemään, AmpC β-laktamaaseja koskevat tutkimukset resurssirajoitteisissa ympäristöissä ovat edelleen puutteellisia. Tärkein askel lisääntyvän mikrobilääkeresistenssin (AMR) torjumiseksi on patogeenisten (ja/tai resistenttien) kantojen tarkka havaitseminen diagnostisissa laboratorioissa. Rutiininomaiseen raportointiin käytettävät laboratorioprotokollat eivät kuitenkaan tarjoa tarkkoja tuloksia Nepalissa, koska AmpC β-laktamaaseja on vaikea tunnistaa pelkillä fenotyyppisillä testeillä, ja ne havaitaan usein virheellisesti ESBL:nä kliinisissä laboratorioissa. Enterobacterales-isolaatteja, jotka ovat positiivisia ESBL-fenotyypin seulontatestissä mutta negatiivisia varmistustestissä, pidetään yleensä potentiaalisina AmpC β-laktamaasien tuottajina joko kromosomaalisen masennuksen tai plasmidisiirron seurauksena.9

Jopa asiantuntevat kliiniset mikrobiologit eivät onnistu tunnistamaan plasmidivälitteisiä AmpC β-laktamaaseja, mikä viittaa siihen, että tarvitaan täsmällisempää ja spesifisempää menetelmää, jonka avulla voidaan havaita ampc β-laktaamaasit nopeasti. Jotkin näistä menetelmistä ovat kuitenkin resurssi-intensiivisiä ja vaativat usein reagensseja, joita ei ole helposti saatavilla.10 Näistä syistä AmpC β-laktamaaseja jää havaitsematta kliinisistä näytteistä. Näin ollen on kehitetty luotettavampi ja validimpi laboratorioprotokolla, joka koostuu multipleksisestä polymeraasiketjureaktiosta (PCR) ja joka helpottaa plasmidikoodattujen AmpC-geenien diagnosointia, sillä ne ovat vastuussa AmpC β-laktamaasi-ekspressiosta erilaisissa kliinisissä infektioissa.11

Vähemmistö tutkimuksista keskittyy ESBL-entsyymien esiintyvyyteen gramnegatiivisissa kliinisissä isolaateissa Nepalissa.12-16 Tutkimuksia, jotka käsittelevät AmppiC β-laktaamaasi-entsyymin esiintyvyyttä gramnegatiivisissa bakteereissa Nepalissa, tehdään rajoitetusti. Eräässä Kathmandun laaksossa tehdyssä tutkimuksessa raportoitiin, että 27,8 prosenttia Enterobacterales-isolaateista oli AmpC β-laktamaasien tuottajia fenotyyppistä menetelmää käyttäen.17 Tietojemme mukaan gramnegatiivisten bakteerien AmpC β-laktamaasientsyymien havaitsemiseen ja karakterisointiin liittyviä tutkimuksia, joissa käytettiin sekä fenotyyppisiä että genotyyppisiä menetelmiä, on Nepalissa vain vähän. On tärkeää ottaa käyttöön vakiomuotoiset fenotyyppiset ja genotyyppiset menetelmät antibioottiherkkyystestejä varten lääkkeille vastustuskykyisten patogeenien seulomiseksi sairaaloissa. Tässä tutkimuksessa pyrittiin eristämään ja tunnistamaan AmpC β-laktamaasigeenit (blaCITM ja blaDHAM) gramnegatiivisissa bakteeri-isolaateissa sekä fenotyyppisellä seulonnalla että varmistusmenetelmillä.

Menetelmät

Tutkimusasetelma

Tämä on sairaalapohjainen poikkileikkaustutkimus, joka toteutettiin kesäkuusta 2017 tammikuuhun 2018 Annapurnan neurologisessa instituutissa ja liitännäislääketieteellisessä tiedekunnassa (Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences, ANIAS). Yhteensä 1151 ei-duplikoitua kliinistä näytettä kerättiin ja käsiteltiin tutkimusjakson aikana. Näytteet sisälsivät virtsaa (n=412), verta (n=206), katetrin kärkeä (n=163), märkää (n=132), ulostetta (n=89), aivoselkäydinnestettä (n=53), haavasta otettua pyyhkäisynäytettä (n=58) ja emättimen pyyhkäisynäytettä (n=38). Näytteet otettiin steriiliin, hyvin merkittyyn ja tiiviiseen astiaan, ja ne käsiteltiin mahdollisimman pian.18 Tutkimukseen otettiin mukaan kaikki vierailevat potilaat, joilla epäiltiin olevan bakteeri-infektioita ja jotka antoivat suostumuksensa osallistua tutkimukseen. Tutkimukseen osallistujat, joilla ei ollut riittäviä demografisia tietoja, suljettiin pois.

Näytteiden viljely ja isolaattien tunnistaminen

Näytteet kerättiin virtsan, ulosteen, märkärakkulan, veren, aivoselkäydinnesteen ja katetrin kärjen keräämistä koskevien vakiomikrobiologisten ohjeiden mukaisesti. Kelvolliset näytteet inokuloitiin edelleen veriagarille (BA), suklaa-agarille (CA) ja MacConkey-agarille (MA). Lisäksi virtsanäytteet inokuloitiin kromogeeniselle UTI-agarille. Isolaatit tunnistettiin käyttämällä tavanomaisia mikrobiologisia parametreja, kuten pesäkkeiden morfologista ulkonäköä, värjäysreaktioita ja biokemiallisia ominaisuuksia.19,20

Antibioottiherkkyyden testaaminen

Kaikille tunnistetuille gramnegatiivisille isolaateille tehtiin lisäksi mikrobilääkeherkkyyskoe in vitro käyttäen modifioitua Kirby-Bauer-levyke- diffuusiomenetelmää.21 Ensin tehtiin inokulaatioita siirtämällä bakteeripesäkkeitä ravintoagarilta steriiliin normaaliin suolaliuokseen. Inokulumin sameus määritettiin vastaamaan 0,5 McFarlandin standardia CLSI:n ohjeiden mukaisesti. Testinokulaatioiden mattoviljelmä valmistettiin myös Muller-Hinton-agarille (MHA). Antibioottikiekot (HiMedia India Pvt. Ltd, Bengaluru, Intia) käytettiin seuraavissa suhteissa: amoksisilliini (10 μg), atsitromysiini (10 μg), amikasiini (30 μg), atsreonaami (30 μg), kefoksitiini (30 μg), keftatsidiimi (30 μg), siprofloksasiini (5 μg), imipeneemi (10 μg), piperasilliini/tatsobaktaami (100/10 μg), ertapenemi (10 μg), meropeneemi (10 μg), kotrimoksatsoli (25 μg) ja kefepiimi (30 μg). Inokuloitua levyä inkuboitiin aerobisesti 37 °C:ssa 18 tunnin ajan. Riittävän inkuboinnin jälkeen mitattiin levyjen ympärillä olevat inhibitiovyöhykkeet (ZOI), ja tulos luokiteltiin herkäksi, keskivaikeaksi tai resistentiksi.21 Isolaatit, jotka osoittivat resistenssiä kolmelle tai useammalle eri luokkiin kuuluvalle antibiootille, tulkittiin moniresistenteiksi22 .

AmpC β-laktamaasien seulonta

Isolaatit seulottiin ensin mahdollisen AmpC β-laktamaasien tuotannon varalta CLSI:n vuoden 2019 ohjeiden mukaisesti.23 Seulontaa varten keftatsidiimia tai kefotaksiimia tai kefoksitiinia tai keftriaksonia, kukin 30 µg, käytettiin AST-testissä, ja organismeja, jotka olivat resistenttejä näille antibiooteille (joiden halkaisijan estovyöhyke oli ≤ 18 mm), seulottiin mahdollisiksi AmpC-tuottajiksi, ja niille tehtiin lisää varmistavia testejä.

AmpC β-laktamaasien varmistus

Screening-positiiviset AmpC β-laktamaasien tuottajat varmistettiin AmpC-kiekkotestillä ja inhibiittoriin perustuvalla varmistustestillä (boorihappotesti).

Boorihappotestissä testattavan organismin mattoviljely tehtiin MHA-levylle, johon otettiin 0,5 McFarlandin liuokset. Kaksi kefoksitiinikiekkoa (30 µg), joista toiseen oli lisätty fenyyliboorihappoa (400 µg), asetettiin mattoviljelmän päälle MHA-levylle ja inkuboitiin ja tulokset tulkittiin. Jos inhibitiovyöhyke kasvoi ≥ 5 mm, kun haluttua antibioottikiekkoa (keftatsidiimi tai kefotaksiimi) arvioitiin yhdessä fenyyliboorihapon kanssa, verrattuna määritykseen ilman yhdistelmää (pelkkä antibioottikiekko), isolaatti merkittiin positiiviseksi varmistustestiksi.

Kiekon approksimointikokeessa kiekot asetettiin E. coli ATCC 25922:n mattoviljelmän päälle. Levyn keskelle asetettiin 30μg keftatsidiimikiekko ja sen jälkeen 10μg imipeneemi-, 30μg kefoksitiini- ja 20/10μg amoksisilliini/klavulanaattikiekot, jotka asetettiin 20 mm:n etäisyydelle keftatsidiimikiekosta. Testattavan organismin pesäkkeet lisättiin levylle, jonka jälkeen levy käännettiin ja inkuboitiin 24 tuntia 37 °C:ssa aerobisesti. ZOI:n painautuminen tai litistyminen osoitti, että isolaatit tuottivat AmpC β-laktamaasia.20,24

AmpC β-laktamaasipositiivisten isolaattien säilytys

Säilytykseen käytettiin glyserolivaraston valmistusmenetelmää. Organismit säilöttiin Tryptic Soy Broth (TSB) -liemessä, joka sisälsi 40 % glyserolia, ja säilytettiin -20 ºC:ssa.25

Plasmidi-DNA:n raakaplasmidiuutto

Testiorganismin eristetty pesäke inokuloitiin Luria Bertani (LB) -liemeen. Inokulaatiota inkuboitiin aerobisesti vesihauteessa 37 °C:ssa 18-24 tuntia. Näin saatu puhdas viljelmä uutettiin plasmidi-DNA:n saamiseksi emäksisellä liuotusmenetelmällä. Tämän jälkeen uutettu plasmidi-DNA suspendoitiin TE-puskuriin ja säilytettiin -20 °C:ssa jatkotutkimuksiin asti.26

AmpC β-laktamaasigeenien (blaCITM ja blaDHAM) monistaminen PCR:llä

AmpC β-laktamaasigeenit (blaCITM ja blaDHAM) monistettiin PCR:llä käyttäen templaattina plasmidi-DNA-valmistetta. BlaCITM-geenin alukkeina käytettiin CLR5-F (5ʹ TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA -3ʹ) ja CLR5-R (5ʹ- TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC -3ʹ), kun taas blaDHAM-geenin alukkeina käytettiin DHAM for (5ʹ AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG -3ʹ) ja DHAM_rev (3ʹ CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC -5ʹ).11 Reaktiotilavuudeksi asetettiin 25µL lisäämällä 12,5µL 1X master mixiä (5× HOT FIREPol Blend Master Mix Ready to Load, Solis BioDyne, Viro), 0,5µL kumpaakin eteen- ja taaksepäin suuntautuvaa aluketta ja 4µL DNA-templaattia ja ddH2O 7,5µL. Molempien geenien optimoitu PCR-monistus oli 94 ºC 3 minuutin ajan alku denaturointia varten; 35 sykliä denaturointia 94 ºC:ssa 30 sekunnin ajan; 25 sykliä hehkutusta 62 ºC:ssa 30 sekunnin ajan; 35 sykliä pidennystä 72 ºC:ssa 1 minuutin ajan ja viimeinen pidennys 72 ºC:ssa 7 minuutin ajan.11,27

DNA:n puhdistus

Plasmidi-DNA puhdistettiin etanolisakan saostamismenetelmällä. Tässä menetelmässä DNA-pelletti huuhdeltiin jääkylmällä 70-prosenttisella etanolilla ja jätettiin kuivumaan 10 minuutiksi, mikä helpottaa alkoholin haihtumista. DNA-pelletti suspendoitiin puskuriliuokseen, joka sisälsi Tristä, EDTA:ta ja RNaaseja jäljellä olevien epäpuhtauksien poistamiseksi.

PCR-tuotteiden osoittaminen geelielektroforeesilla

Monistetut tuotteet visualisoitiin geelielektroforeesilla 1,5-prosenttisella agaroosigeelillä, joka oli värjätty 0,1 µl:lla etidiumbromidia. Geelin valmistuksen jälkeen ensimmäiseen kuoppaan lisättiin 2µL 100bp:n DNA-tikapuita merkkiaineeksi, toiseen kuoppaan lisättiin 2µL negatiivista kontrollia, toiseen kuoppaan lisättiin 2µL positiivista kontrollia ja lopuihin kuoppiin lisättiin 2µL PCR-tuotteita. Lopuksi geeli visualisoitiin UV-transvalaisimessa.28

laadunvalvonta

Tässä tutkimuksessa käytettiin vakioaseptista menettelyä. Kaikki kasvatusalustojen ja kemiallisten reagenssien erät käsiteltiin aseptisella tekniikalla CLSI:n ohjeiden mukaisesti. AST:ssä laadunvalvontaa ylläpidettiin käyttämällä E. coli ATCC 25922:n kontrollikantoja. PCR:n aikana laadunvalvonta varmistettiin käyttämällä Klebsiella-isolaatteja, jotka kantavat molempia kyseisiä geenejä, kun taas nollakontrollit tai negatiiviset kontrollit valmistettiin ilman nukleiinihappojen käyttöä. Kaikkia näitä kontrolleja käytettiin jokaisessa PCR-määrityksen erässä.

Statistinen analyysi

Tiedot syötettiin ja analysoitiin SPSS-ohjelmiston version 24.0 avulla. Assosiaatioita tutkittiin käyttämällä khiin neliö -testejä 95 %:n luottamusvälillä (CI) demografisten muuttujien, kuten sukupuolen ja koehenkilöiden iän, välillä.

Tulokset

Tutkimukseen osallistuneiden potilaiden demografinen ja kliininen luonne

Tutkimukseen osallistuneista 1151:stä potilaasta 54,2 % (624/1151) oli uroksia ja 45,8 % (527/1151) naisia. 253 bakteerikasvusta 47,8 % (121/253) oli peräisin miehiltä ja 52,2 % (132/253) naisilta. Kaikista (253) bakteerikasvusta 26,1 % (66/253) oli peräisin virtsanäytteistä, ja seuraavina olivat katetrin kärjet (17,4 %; 44/253), veri (16,2 %; 41/253), mätä (11,9 %; 30/253) ja haavapyyhkeet (10,7 %; 27/253). Potilaiden ikäjakauman perusteella bakteeripatogeenien kasvu oli suurinta ikäryhmässä 16-45 vuotta (39,5 %; 100/253), jota seurasivat ikäryhmät 46-60 vuotta (30,1 %; 76/253), >60 vuotta (24,1 %; 61/253) ja 0-15 vuotta (6,3 %; 16/253) (taulukko 1).

Taulukko 1 Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences -instituutissa käyvien potilaiden demografinen ja kliininen luonne

Kliinisissä näytteissä olevien bakteeri-isolaattien jakauma

Kliinisistä näytteistä otettiin yhteensä 1151 näytettä, 22 %:ssa (253/1151) havaittiin kasvua viljelmillä. 253 bakteeri-isolaatista suurin osa (89,3 %; 226/253) oli gramnegatiivisia bakteereja. Bakteerikasvustossa E. coli (28,5 %; 72/253) oli hallitseva organismi, jota seurasivat Pseudomonas aeruginosa (16,2 %; 41/253), Acinetobacter baumannii (15,8 %; 40/253), grampositiiviset bakteerit (10,7 %; 27/253), Klebsiella pneumoniae (9,9 %; 25/253) ja Klebsiella oxytoca (4 %; 25/253).7 %; 12/253) (Kuva 1)

Kuva 1 Bakteerisukujen jakautuminen viljelypositiivisissa kliinisissä näytteissä (n=253).

Isoloiduista gramnegatiivisista bakteereista eristettyjen antibioottiherkkyyksien kuvio

Joista 226 gramnegatiivisesta bakteeri-isolaatista 66.8 % (151/226) osoittautui resistentiksi kefoksitiinille, ja seuraavina olivat keftatsidiimi (58,4 %; 132/226), siprofloksasiini (53,5 %; 121/226) ja kefepiimi (51.8 %; 117/226), kun taas isolaatit olivat herkimpiä meropeneemille (69 %; 156/226), ertapenemille (68,6 %; 155/226), imipeneemille (66,8 %; 151/226), amikasiinille (61,1 %; 138/226), piperasilliini/tazobaktaamille (56,6 %; 128/226) ja atsitromysiinille (53.1 %; 120/226) (taulukko 2).

Taulukko 2 Gramnegatiivisten bakteeri-isolaattien antibioottiherkkyysmalli (n=226)

Isolaattien moniresistenssikuvio (MDR-kuvio, Multidrug Resistance)

Kuinka 226:sta isolaatista, 46.9 % (106/226) isolaateista oli MDR-resistenttejä. Eniten MDR:ää oli E. colilla (31,1 %; 33/106) ja seuraavaksi eniten P. aeruginosalla (20,8 %; 22/106), A. baumannii:lla (18,9 %; 20/106), K. pneumoniae:lla (9,4 %; 10/106) ja K. oxytoca:lla (4,7 %; 5/106) (kuva 2). Yksittäisistä lajeista eniten moniresistenssiä havaittiin C. freundii -bakteerilla (100 %; 8/8) ja seuraavaksi eniten P. aeruginosa -bakteerilla (53,6 %; 22/41), C. koseri -bakteerilla (50 %; 2/4), A. baumannii -bakteerilla (50 %; 20/40) ja E. coli -bakteerilla (45,8 %; 33/72) (kuva 2).

Kuvio 2 MDR-bakteerien jakautuminen ja yleinen MDR-% ja MDR kunkin lajin sisällä.

AmpC:n osoittaminen eri testeillä

226:sta gramnegatiivisesta isolaatista 50 %:lla (113/226:lla) todettiin resistenssi kefoksitiinia vastaan. AmpC β-laktamaasia tuottavat isolaatit varmistettiin kahdella eri varmistustestillä, levytesteillä ja booronihappotesteillä. Yhdeksästäkymmenestä yhdestäkymmenestä yhdestä isolaatista 91,2 prosenttia (83/91) osoitti positiivista tulosta molemmissa testeissä ja 8,8 prosenttia (8/91) isolaateista osoitti positiivista tulosta vain boorihappotestissä, joka oli vahvistettu vähintään yhdellä testillä, ja niitä pidettiin AmpC β-laktamaasin tuottajina.

BlaCITM- ja blaDHAM-geenien esiintyvyys AmpC β-laktamaasia tuottavissa gramnegatiivisissa isolaateissa

PCR-määrityksessä 90,1 % (82/91) ja 87,91 % (80/91) isolaateista testattiin positiivisiksi blaCITM- ja blaDHAM-geeneille. Vastaavasti havaittiin monistetut blaCITM- ja blaDHAM-geenit, joiden amplikonin koko oli 465bp ja 405bp (kuvat 3 ja 4).

Kuva 3 Agaroosigeelielektroforeesi (1,5 %:n pitoisuus), jota käytettiin PCR-tuotteiden erottamiseen. Kaista 2, positiivinen kontrolli; kaistat 3, 5 ja 7 ovat CITM-positiivisia; kaistat 4 ja 6 CITM-negatiivisia; ja kaista 8. negatiivinen kontrolli.

Kuvio 4 Agaroosigeelielektroforeesi (1,5 %:n elektroforeesi), jota käytettiin PCR-tuotteiden erotteluun. Kaista 2, positiivinen kontrolli; kaistat 3, 4, 6 ja 7 ovat Dham-positiivisia; kaista 5, Dham-negatiivinen; ja kaista 8, negatiivinen kontrolli.

AmpC β-laktamaasi-, blaCITM- ja blaDHAM-geenien jakautuminen gramnegatiivisten isolaattien joukossa ja niiden suhde sukupuoleen, ikään, kliinisiin näytteisiin ja kliinisiin isolaatteihin

Yksitoista 91:stä AmpC-tuottajista 50,6 % (46/91) isolaateista oli naispuolisilta potilailta peräisin olevia isolaatteja, kun taas miespuolisilta potilailta saaduista isolaateista oli saatu 50,6 % (46/91). Vastaavasti blaCITM-geenejä saatiin yhtä paljon (50 %; 41/82) molempien sukupuolten näytteistä, kun taas blaDHAM-geenejä havaittiin 51,3 %:ssa (41/80) mies- ja 48,7 %:ssa (39/80) mies- ja 48,7 %:ssa (39/80) naispuolisilta potilailta saaduista näytteistä. Potilaan sukupuolella ei ollut merkittävää yhteyttä AmpC-entsyymien ja AmpC-geenien tuotantoon (taulukko 3).

Taulukko 3 AmpC β-laktamaasi-, CITM- ja DHAM-geenien jakauma gramnegatiivisten bakteeri-isolaattien joukossa ja niiden suhde sukupuoleen, ikään ja kliinisiin näytteisiin

Suurin määrä AmpC β-laktamaasituottajia (40.7 %; 37/91) ja blaCITM- (40,2 %; 33/82) ja blaDHAM- (41,2 %; 33/80) isolaatteja tuottavien isolaattien esiintyvyys (41,2 %; 33/80) saatiin ikäryhmästä (46-60) vuotta, jota seurasivat ikäryhmät (16-45) vuotta (30,8 %; 28/91), (29,3 %;24/82) ja (31,3 %; 25/80). AmpC β-laktamaasientsyymin tuotannon ja ikäryhmän välillä oli merkitsevä yhteys (p=0,01), kun taas muilla tekijöillä, mukaan lukien blaCITM- ja blaDHAM-geenien hankinta, ei ollut merkittävää yhteyttä potilaan ikään (taulukko 3).

Kliinisistä näytteistä eniten AmpC β-laktamaasia tuottavia isolaatteja (20,9 %; 19/91) havaittiin verestä ja katetrin kärjistä, ja seuraavina olivat virtsa (18,7 %; 17/91), mätä (13,3 %; 12/91) ja haavapyyhkäisynäytteet (9,9 %; 9/91). Vastaavasti eniten blaCITM- ja blaDHAM-eritteitä tuottavia isolaatteja havaittiin katetrin kärjistä (21,9 %; 18/82); (22,5 %; 18/80) ja seuraavaksi eniten verestä (19,5 %; 16/82); (21,3 %; 17/80), virtsasta (17,0 %; 14/82); (17,5 %; 14/80) ja mädästä (13,4 %; 11/82); (8,8 %; 7/80). Kliinisten näytteiden, AmpC β-laktamaasituotannon ja geenien blaCITM ja blaDHAM välillä ei ollut merkittävää yhteyttä (taulukko 3).

AmpC β-laktamaasien jakautuminen ja blaCITM- ja blaDHAM-geenien hankkiminen erilaisissa gramnegatiivisissa bakteereissa

AmpC β-laktamaasientsyymien suurin esiintyvyys todettiin E. coli (28,6 %; 26/91), seuraavina P. aeruginosa (26,4 %; 24/91), A. baumannii (13,2 %; 12/91) ja K. pneumoniae (10,9 %; 10/91). BlaCITM- ja blaDHAM-geenien suurin esiintyvyys havaittiin E. coli -bakteerissa (30,6 %; 25/82) (31,3 %; 25/80) ja seuraavina olivat P. aeruginosa (25,7 %; 21/82), (22,5 %; 18/80), A. baumannii (12,2 %; 10/82), (12,4 %; 10/80) ja K. pneumoniae (10,9 %; 9/82), (12,4 %; 10/80), ja seuraavina olivat A. baumannii (12,2 %; 10/82), (12,4 %; 10/80) ja K. pneumoniae (10,9 %; 9/82), (12,4 %; 10/80) (taulukko 3).

Keskustelu

Mikrobilääkeresistenssin yleistyminen on edelleen yksi merkittävimmistä kansanterveysongelmista kehitysmaissa, kuten Nepalissa29 , mikä on johtanut sairaalassaoloajan pidentymiseen, lisääntyneisiin hoitokustannuksiin, hoitovaihtoehtojen rajoittumiseen sekä lisääntyneeseen sairastuvuuteen ja kuolleisuuteen29,30 . β-laktamaasien tuotanto on tärkein puolustusmekanismi β-laktamiantibiootteja vastaan. Tässä tutkimuksessa tutkittiin Amber-luokan C β-laktamaasien (AmpC) esiintymistä gramnegatiivisissa organismeissa, jotka olivat peräisin ANIAS:n (Kathmandu, Nepal) kliinisistä näytteistä. Lisäksi tässä tutkimuksessa arvioitiin AmpC β-laktamaasigeenien (blaCITM ja blaDHAM) esiintyvyyttä PCR-määrityksellä. Näiden entsyymien ja geenien esiintyvyys oli suuri, vaikka niiden esiintyvyys vaihteli maantieteellisesti, maiden sisällä ja niiden välillä.

1151 kliinisestä näytteestä vain 253:ssa (21,9 %) havaittiin merkittävää organismien kasvua. Kaikista (253) bakteerikasvusta yli yhdeksänkymmentä prosenttia oli gramnegatiivisia bakteereja, joista E. coli oli hallitsevin isolaatti. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia aiempien tutkimusten kanssa, jotka on raportoitu Everest Hospitalista, Baneshworista,14 Alka Hospitalista, Jawlakhelista,31 National Public Health Laboratorysta, Tekusta,32 Universal College of Medical Sciencesista, Bhairahawasta,33 B.P Koirala Institute of Health Sciencesista, Dharanista,34 Nobel Medical Collegesta, Biratnagarista,35 New Delhistä, Intiasta,36 Al-Najafin kaupungista, Irakista,37 Shashemene Referral Hospitalista, Etiopiasta,38 ja Meksikosta38 ja Mexico Citystä,39 . Naispotilailla havaittiin hieman enemmän gramnegatiivisia bakteeri-infektioita, mikä saattaa johtua virtsatieinfektioiden suuremmasta esiintyvyydestä naisilla. Tämä vastaa aiempia tutkimuksia, jotka on tehty Model Hospitalissa, Kathmandussa17 ja Andra-Pradeshissa, Intiassa.40 Samoin kuin tässä tutkimuksessa, eräässä Uttar Pradeshin osavaltiossa Intiassa tehdyssä tutkimuksessa raportoitiin, että postoperatiivisten infektioiden mätäinfektioiden osuus oli suurempi naisilla (63,33 %) kuin miehillä (43,75 %).41

Tässä tutkimuksessa gramnegatiiviset bakteeri-isolaatit osoittivat suurempaa resistenssiä seuraaville antibiooteille: kefoksitiini, keftatsidiimi, siprofloksasiini ja kefepiimi, ja seuraavaksi eniten resistenssiä osoitti kotrimoksatsoli, kun taas meropeneemi, imipeneemi, piperasilliinitatsobaktaami ja atsitromysiini ilmoitettiin herkimmiksi antibiooteiksi. Vastaava kuvio havaittiin joissakin aiemmissa Chitwan Medical Collegessa, Chitwanissa,42 Padma Hospitalissa, Pokharassa.43 Kefoksitiini ja keftatsidiimi, joiden herkkyysasteet olivat alhaiset, ovat ensilinjan lääkkeitä, jotka bakteerien entsyymit hydrolysoivat helposti, ja ne ovat vähemmän käyttökelpoisia gramnegatiivisten patogeenien aiheuttamien infektioiden hoidossa. Samoin kuin tutkimuksessamme, imipeneemi/meropeneemi todettiin herkimmiksi lääkkeiksi aikaisemmissa tutkimuksissa, jotka tehtiin Model Hospitalissa Kathmandussa17 , Madridissa Espanjassa44 ja Wisconsinissa Yhdysvalloissa.45

Mikrobilääkeresistenssi (AMR), johon liittyy mikrobilääkeresistenssin (MDR) lisääntyvä leviäminen, on maailmanlaajuinen huolenaihe, ja sen vaikutukset ovat suuremmat alhaisen ja keskitason tulotason maissa, joissa infektiotautien aiheuttama taakka on suuri.30 MDR-mikrobien hoito on kallista ja vaikeaa, ja sitä pahentaa vielä sairaalainfektioiden suuri esiintyvyys.46 Tässä tutkimuksessa lähes puolet eristetyistä gramnegatiivisista isolaateista (46,9 %; 106/226) todettiin MDR:ksi. MDR-bakteerien suurempaa esiintyvyyttä on raportoitu joissakin muissa Kathmandussa46-49 ja muissa Nepalin piirikunnissa tehdyissä tutkimuksissa.15,50,51 ESBL:n, metallo β-laktamaasin (MBL) tai AmpC β-laktamaasin tuotanto voi olla syynä heikentyneeseen herkkyyteen uudemman sukupolven antibiooteille.52 Lisäksi monilääkeresistenssi johtuu erilaisten geenien aggregoitumisesta ja ilmentymisestä resistentteihin (R) plasmideihin tai geeneihin, jotka koodaavat monilääkeaineiden effluksipumppuja.53 Lisäksi β-laktamaasientsyymien ilmentymisestä vastaavat geenit liittyvät jatkuvasti muihin kuin β-laktamiantibiootteihin, kuten aminoglykosideihin ja fluorokinoloneihin.

Tässä tutkimuksessa AmpC:n tuotantoa havaittiin olevan enemmän miespotilailla (41,67 %) kuin naisilla (38,98 %). Tämän tutkimuksen tulokset ovat yhdenmukaisia joidenkin muiden Kanossa, Luoteis-Nigeriassa, tehtyjen tutkimusten kanssa.54 Tuloksemme poikkesivat kuitenkin Beninistä, Nigeriasta, raportoiduista tutkimuksista.55 Monissa tutkimuksissa on raportoitu moniresistentin virtsatietulehduksen korkeammasta esiintyvyydestä naisilla, mikä voi johtua AmpC:tä tuottavien patogeenien korkeammasta esiintyvyydestä naisilla, koska he ovat alttiimpia virtsatietulehdukselle kuin miehet.

Tsefoksitiiniresistenssin käyttäminen diagnostiikkalaboratorioissa toimii luotettavana seulonta-aineena/merkkipaaluna AmpC:n tuotannon havaitsemiseksi. Lisäksi tällä merkkiaineella on hyvä negatiivinen ennustearvo.

Laaja-alaisuudestaan huolimatta joissakin tutkimuksissa on korostettu kefoksitiinin käyttöä huonona AmpC-tuotannon seulonta-aineena. Tämä saattaa johtua muiden vaihtoehtoisten mekanismien kuin AmpC:n olemassaolosta (yksi niistä on poriinikanavan mutaatio), mikä voi johtaa väärään positiiviseen tulkintaan (kefoksitiiniresistenssinä).52 Tutkimuksessamme kävi ilmi, että kolmasosa gramnegatiivisista isolaateista (>40 %) oli vastuussa AmpC-tuotannosta. Tämän tutkimuksen tulokset olivat ristiriidassa Kathmandun Model Hospitalissa tehdyn tutkimuksen kanssa.17 Ero voi johtua tässä tutkimuksessa käytetystä fenotyyppisestä osoitusmenetelmästä, jossa käytettiin kefoksitiiniresistenssitestiä ja AmpC-kiekkotestimenetelmää, jossa käytettiin kefoksitiinia (30 µg). Vahvistustestinä käytettiin fenyyliboorihappotestiä, jossa käytettiin kefoksitiinia 30µg/400µg fenyyliboorihappoa. Boorihappojohdannaiset osoittautuivat AmpC β-laktamaasientsyymien reversiibeleiksi inhibiittoreiksi.56

Tässä tutkimuksessa AmpC-tuotantoa havaittiin 91:ssä (80,53 %) isolaatissa 113:sta. AmpC-tuotantoprosentti tutkimuksessamme on hieman korkeampi kuin muissa tutkimuksissa, jotka on raportoitu Model Hospitalista, Kathmandusta,17 Chitwan Medical Collegesta,57 Bharatpurista, Chitwanista,58 ja Intiasta.59

Jommastakummasta menetelmästä johtuvien rajoitusten kompensoimiseksi molempien tekniikoiden yhdistäminen rutiinidiagnostiikkaan voi lisätä testien herkkyyttä ja spesifisyyttä kliinisessä ympäristössä.

Kokonaisuutena 73:ssa gramnegatiivisessa isolaatissa osoitettiin molempien, sekä blaCITM:n että blaDHAM:n, geenien esiintyminen. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia Iranin Ilamista raportoidun aiemman tutkimuksen kanssa.27 Intiasta raportoidussa samantyyppisessä tutkimuksessa osoitettiin, että blaCITM-geenit olivat yleisempiä E. coli -bakteereissa.60 Tutkimuksessamme AmpC:hen assosioituneiden geenien (blaCITM- ja blaDHAM-geenit) esiintyvyyttä tutkittiin fenotyyppisin ja genotyyppisin menetelmin. Tämä tutkimus tarjoaa laajan analyysin gramnegatiivisista bakteereista, joihin liittyy AmpC β-laktamaasituotantoa, ja niiden antibioottiherkkyysmalleista kliinisissä isolaateissa. Tämän tutkimuksen havainnot ovat tärkeitä, kun selvitetään eri organismien resistenssimalleja kefalosporiineja kohtaan. β-laktamaasiresistenssin, mukaan lukien ESBL-, MBL- ja AmpC-tuotanto, monilääkeresistenssin seuranta on tarpeen rutiininomaisessa kliinisessä käytännössä hoidon optimoimiseksi ja β-laktaamiantibioottien resistenssin lisääntymisen estämiseksi.13,61,62.

Vahvuudet ja rajoitukset

Tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa tutkitaan AmpC β-laktamaasigeenejä (blaCITM ja blaDHAM) sekä fenotyyppisellä että molekyylitestillä Nepalin tertiäärisessä terveyskeskuksessa käyvien potilaiden keskuudessa. Tämän tutkimuksen tulokset voivat antaa tietoa tertiäärisen terveydenhuollon keskusten mikrobilääkepolitiikasta, mukaan lukien sairaalainfektioiden hoidon, hoitoprotokollan ja diagnoosimenettelyn valmistelu. Tässä tutkimuksessa on muutamia rajoituksia, joihin kuuluvat rajoitettujen AmpC β-laktamaasien tutkiminen, tutkimuksen lyhyt kesto ja se, että se on tehty yhdessä ainoassa tertiäärisessä hoitokeskuksessa. Tulevissa tutkimuksissa voidaan sen pohjalta tehdä pitkittäistutkimus useissa korkea-asteen hoitokeskuksissa ja tutkia kaikkia β-laktamaaseja, kuten ESBL:ää, MBL:ää ja KPC:tä, sekä tärkeimpiä resistenssiä aiheuttavia geenejä. Tästä huolimatta tämä tutkimus, joka on ensimmäinen fenotyyppisiä ja molekulaarisia menetelmiä kolmiulotteisesti yhdistävä tutkimus, on arvokas referenssi tuleville tutkimuksille, jotka koskevat AmpC β-laktamaaseja ja blaCITM- ja blaDHAM-geenien esiintyvyyttä muissa Nepalin ympäristöissä/sairaaloissa.

Johtopäätökset

Löydöksemme osoittavat, että heikentynyt herkkyys kefoksitiinille gramnegatiivisissa isolaateissa liittyy plasmidivälitteisten AmpC-geenien esiintymiseen. Koska yhtä ainoaa lopullista menetelmää ei ole, ehdotetaan useiden fenotyyppisten osoitusmenetelmien samanaikaista käyttöä AmpC β-laktamaasia tuottavien bakteerien tarkkaa osoittamista varten. Tässä tutkimuksessa PCR:llä havaittiin lähes 90 prosenttia AmpC β-laktamaasigeeneistä (blaCITM ja blaDHAM) fenotyyppisesti vahvistetuista isolaateista. Resistenttien geenien ja MDR:n suuri esiintyvyys gramnegatiivisten isolaattien keskuudessa on hälyttävä merkki, joka edellyttää kiireellisiä interventiotoimenpiteitä näiden isolaattien kasvun ja leviämisen hillitsemiseksi.