Mistä tiedän, että vasta-aine reagoi ristiin?

Ristireaktiivisuus syntyy, kun yhtä tiettyä antigeenia vastaan kasvatettu vasta-aine tunnistaa kaksi antigeenia, joilla on samankaltaisia rakennealueita.

Mitä on ristireaktiivisuus?

Vasta-aineella on tietty aminohapposekvenssi (Fab-alue), joka määrää sen affiniteetin tiettyä antigeenia kohtaan. Antigeenien välistä ristireaktiivisuutta esiintyy, kun yhtä spesifistä antigeenia vastaan kasvatetulla vasta-aineella on kilpaileva korkea affiniteetti toista antigeenia kohtaan. Näin on usein silloin, kun kahdella antigeenillä on samanlaisia rakenteellisia alueita, jotka vasta-aine tunnistaa.

Ristireaktiivisuus voi mitätöidä kokeen tulokset ja vaikuttaa siten tieteelliseen toistettavuuteen. Näin ollen vasta-aineen testaaminen ristireaktiivisuuden varalta läheisesti sukua olevien proteiinien kanssa on kriittinen validointikoe.

Miten tarkistan ristireaktiivisuuden?

Ristireaktiivisuus ei aina ole negatiivinen ominaisuus. Se voi joskus parantaa vasta-aineen käyttökelpoisuutta. Esimerkiksi vasta-aineen ristireaktiivisuus kohdelajille eri lajeissa mahdollistaa saman vasta-aineen käytön useissa malliorganismeissa.

Ristireaktiivisuutta eri lajeissa esiintyy usein ihmisen antigeenistä peräisin olevissa vasta-aineissa. Monilla Proteintechin luettelossa olevilla ihmisen vasta-aineilla on merkittävää ristireaktiivisuutta homologisten proteiinien kanssa muissa kuin ihmismalleissa, kuten hiiressä, rotassa, apinassa tai seeprakalassa.

Proteiinisekvenssin homologisuuden ja vasta-aineitamme muissa kuin ihmisorganismeissa käyttävien julkaisujen perusteella monia Proteintechin vasta-aineita voidaan käyttää ihmisnäytteiden lisäksi myös erilaisissa organismeissa. Homologia voidaan määrittää käyttämällä immunogeenin ja kohdeantigeenin pareittaista sekvenssikohdistusta NCBI-BLASTweb-sivuston kautta, ja lisätietoa voidaan tarkistaa universaalista proteiiniresurssisivustosta UniProt.

Mikä on homologian ”oikea luku” ristireaktiivisuuden ennustamiseksi?

Kokemuksemme perusteella, jos immunogeenillä ja mahdollisen ristireagoivan proteiinin sekvenssillä on 75 prosentin sekvenssihomologia, sen ennustetaan reagoivan ristiin. Jos näytteesi on ei-inhimillinen, suositellaan polyklonaalista, koska tunnistettavien epitooppien sekoitus on olemassa.

Ristireagoiko vasta-aineeni muiden lajien kanssa?

Se riippuu immunogeenin ja mahdollisen ristireagoivan proteiinisekvenssin proteiinien sekvenssin samankaltaisuuden asteesta.

Miten vältetään ristireaktiivisuus western blotissa

Mahdollisuuksien mukaan on suositeltavaa käyttää sekundääristä vasta-ainetta, joka on spesifinen ensimmäiselle käytetylle vasta-aineelle; esimerkiksi jos primaarinen vasta-aine on hiiri, sekundäärisen vasta-aineen tulisi olla antihiiri IgG-HRP. Jos toissijainen vasta-aine on polyklonaalinen ja tuotettu koko IgG-molekyyliä vastaan, hiiren primaarisen Ab:n tunnistava kani-vasta-aine ei ehkä ole paras valinta, koska se tunnistaa yhteisen Kappa-kevytketjun alueen.

Miten vältetään ristireaktiivisuus immunovärjäyskokeissa

Ristireaktiivisuutta saattaa esiintyä immunovärjäyskokeissa, joissa käytetään kudosperäisiä näytteitä; siksi on tavallista käyttää primaari-immunoglobuliineina pikemminkin fragmentteja kuin kokonaisia IgG:itä (esimerkiksi työskenneltäessä hiiren vasta-aineilla hiiren kudoksilla). Lisäksi, kun tehdään useita värjäyksiä, pyritään ristireaktioiden välttämiseksi käyttämään erilaisia sekundäärivasta-aineita, esimerkiksi 568 kanin anti-vuohen ja 488 kanin anti hiiren vasta-aineita, jotka ovat melko yleisiä ja helposti löydettävissä.

Mitä on sekundäärivasta-aineen ristiinadsorptio ja ristireaktiivisuus?

Ristiinadsorboituneet sekundäärivasta-aineet ovat sellaisia polyklonaalisia vasta-aineita, jotka valmistetaan ylimääräisen puhdistusvaiheen avulla, jotta voidaan suodattaa immunoglobuliinin (IgG) kohdelajin ulkopuolisiin lajeihin sitoutuvat jäsenet. Tämä prosessi voi vähentää lajien ristireaktiivisuutta ja lisätä spesifisyyttä. Koeasetelmasta riippuen on olemassa ristiinadsorboituneita ja erittäin ristiinadsorboituneita sekundäärivasta-aineita.

1. Polyklonaaliset vs. monoklonaaliset vasta-aineet

2. Sekundäärivasta-aineen valinta

3. Proteiini- vai peptidiantigeeni? Edut ja haitat