Kromatiinin saavutettavuus ja arkkitehtuuri

Kuva 3: Kromosomin konformaatiotekniikat. Eri vaiheet 3C-, 4C-, 5C-, ChIA-PET- ja Hi-C-menetelmissä.

Kromatiinin konformaation talteenotto (3C)

3C-menetelmässä käytetään formaldehydin ristisilloitusta kolmiulotteisen kromatiinirakenteen lukitsemiseksi paikalleen, minkä jälkeen suoritetaan restriktioentsyymin sulatus. Poistetut DNA-fragmentit analysoidaan sitten qPCR:llä ja sekvensoinnilla, jotta voidaan tunnistaa, missä etäiset DNA-alueet ovat yhteydessä toisiinsa. Tämä lähestymistapa 3D-kromatiinin rakenteen ja vuorovaikutusten analysoimiseksi in vivo kehitettiin ensimmäisen kerran vuonna 2002 (Dekker et al., 2002), ja siitä on sittemmin tullut perusta lukuisille vastaaville tekniikoille, joita on kehitetty suuremman mittakaavan, läpimenotehon tai spesifisyyden saavuttamiseksi.

Circularized chromosome conformation capture (4C)

4C:n avulla voidaan tunnistaa aiemmin tuntemattomia DNA-alueita, jotka ovat vuorovaikutuksessa kiinnostavan lokuksen kanssa, mikä tekee 4C:stä ihanteellisen menetelmän, jonka avulla voidaan havaita uudenlaisia vuorovaikutussuhteita tietyllä alueella (Dekker et al., 2006).

4C hyödyllisiä vinkkejä:

• Valitse oikeat restriktioentsyymit. Useammat leikkausentsyymit (eli neljän bp:n tunnistuskohdat) ovat parempia paikallisia vuorovaikutuksia varten kiinnostavan alueen ja läheisten sekvenssien välillä samassa kromosomissa (van der Werken et al., 2012).
• Optimoi ristisidonta. Alhaisemmat formaldehydipitoisuudet edistävät ei-toivottuja kiinnostuksen kohteena olevan alueen itseliimautumia, mutta estävät myös restriktioentsyymien leikkaamista haittaavia DNA-”hiuspalloja”. Korkeat formaldehydipitoisuudet vähentävät itseligoitumistapahtumia mutta lisäävät hiuspalloja. Optimaalinen formaldehydikonsentraatio olisi valittava kulloiseenkin koetilanteeseen näiden seikkojen tasapainottamiseksi. 1 %:n formaldehydikäsittely 10 minuutin ajan on hyvä lähtökohta useimmille kokeille (van der Werken et al., 2012).

Hiilikopiointikromosomien konformaatiokaappaus (5C)

5C tuottaa kirjaston kaikista ligointituotteista DNA-alueilta, jotka assosioituvat kohdelokuksiin, jotka sitten analysoidaan NGS:llä. 5C on ihanteellinen silloin, kun tarvitaan hyvin yksityiskohtaisia tietoja kaikista vuorovaikutuksista tietyllä alueella, esimerkiksi kaavioitaessa tietyn kromosomin yksityiskohtaista vuorovaikutusmatriisia. 5C ei kuitenkaan ole aidosti genominlaajuinen, koska jokainen 5C-alkuaine on suunniteltava erikseen, joten se soveltuu parhaiten tietyille alueille (Dotsie ja Dekker, 2007).

5C-avustavia vinkkejä:

• Valitse oikea restriktioentsyymi. On tärkeää valita entsyymi, joka toimii tehokkaasti tietyissä koeolosuhteissa. Esimerkiksi BamHI:tä ei suositella useimpiin kokeisiin tehottomuuden vuoksi 3C-olosuhteissa (Dotsie et al., 2007).
• Optimoi alukkeiden suunnittelu. 5C:ssä käytetään kahta aluketta: etummaista 5C-alkuria, joka sitoutuu ligointikohdan ylävirtaan, ja käänteistä aluketta, joka sitoutuu välittömästi alavirtaan. Alukkeiden pituus on säädettävä siten, että hehkutuslämpötila on noin 65 °C, jotta alukkeet hehkuvat täsmälleen restriktiofragmenttiensa kanssa. Varmista, että 5C-alukkeet syntetisoidaan siten, että 5′-päässä on fosfaatti ligointia varten.
• Käytä kontrollitemplaattia. Tämä kontrolloi alukkeiden tehokkuuden eroja. Kontrollikirjasto, joka on rakennettu koko tutkittavasta genomialueesta, on suositeltava. Jos tätä kirjastoa ei rakenneta, tutkijoiden on tiedostettava, että vuorovaikutustaajuudet eivät ole yhtä tarkkoja.

Chromatin interaction analysis by paired-end tag sequencing (ChIA-PET)

ChIA-PET:ssä otetaan huomioon ChIP:n ja 3C:n näkökohtia, jotta voidaan analysoida kaukana sijaitsevien DNA-alueitten vuorovaikutussuhteita tietyn proteiinin välityksellä.

ChIA-PET:aa voidaan käyttää parhaiten löytökokeisiin, joissa on mukana kiinnostava proteiini ja tuntemattomia DNA:n sitoutumiskohteita. Esimerkiksi transkriptiotekijöiden sitoutumiskohteita tutkitaan parhaiten ChIA-PET:llä, koska tämä tekniikka edellyttää, että transkriptiotekijä sitoo DNA:ta in vivo, jotta vuorovaikutus voidaan kutsua (Fullwood et al., 2009).

ChIA-PET:n hyödyllisiä vinkkejä:

• Päällekkäiset PET-tunnisteet vähentävät taustaa. Kuten useimmissa 3C-tekniikoissa, taustamelu on tekninen haaste. Erityisesti ChIA-PET:ssä kohina voi vaikeuttaa pitkien vuorovaikutusten löytämistä kiinnostavan lokuksen kanssa. Hyödyllinen vinkki tämän ongelman voittamiseksi on vaatia PET-tunnisteiden päällekkäisyyttä alueen molemmissa päissä, jotta kyseessä olisi pitkän kantaman vuorovaikutus.

ChIP-loop

ChIP-loop on ChIP:n ja 3C:n sekoitus, jossa käytetään vasta-aineita, jotka on kohdistettu proteiineihin, joiden epäillään sitovan kiinnostuksen kohteena olevaa DNA-aluetta. ChIP-loop sopii erinomaisesti sen selvittämiseen, ovatko kaksi tunnettua DNA-aluetta vuorovaikutuksessa kiinnostavan proteiinin välityksellä. ChIP-loop soveltuu hyvin myös epäiltyjen vuorovaikutusten vahvistamiseen, mutta ei uusien vuorovaikutusten löytämiseen (Horike ym., 2005).

ChIP-loopin hyödyllisiä vinkkejä:

• Vältä ei-natiivisia silmukoita. Suurin ChIP-silmukan kanssa kohdattu ongelma on ei-natiivisten silmukoiden muodostuminen, jotka muodostuvat DNA:n konsentroinnin aikana ennen ligointia. Yksinkertainen tapa välttää tämä on valita protokolla, jossa saostus suoritetaan ligaatiovaiheen jälkeen (Simons et al., 2007).
• Validoi ChIP-silmukoiden vuorovaikutukset. Toinen ChIP-silmukan haaste voi olla ligointituotteiden tarkka kvantitointi. 3C-tekniikat, erityisesti ChIP-loop, kaappaavat usein satunnaisia vuorovaikutuksia. Tämän torjumiseksi kannattaa harkita ChIP-kokeen suorittamista rinnakkain ja käyttää sitä ChIP-loop-vuorovaikutusten validointiin. Jos ChIP-loopilla tunnistettu DNA-proteiini-DNA-vuorovaikutus on todella todellinen, molempien DNA-proteiini-vuorovaikutusten pitäisi näkyä myös ChIP-datassa (Simons ym., 2007).

Hi-C

Hi-C monistaa ligointituotteita koko genomista ja arvioi niiden frekvenssejä korkean läpimenon sekvensoinnilla. Hi-C on hyvä valinta, kun tarvitaan laaja kattavuus koko genomista eikä resoluutiosta ole suurta huolta, esimerkiksi kartoitettaessa koko genomin laajuisia muutoksia kromosomirakenteessa kasvainsoluissa (Lieberman-Aiden ym., 2009).

Hi-C:n hyödyllisiä vinkkejä:

• Optimoi kirjaston monistus. Hi-C-kirjaston monistamisen on tuotettava riittävästi tuotetta analyysiä varten ja samalla vältettävä PCR-artefakteja. Tätä varten PCR-syklien määrä on optimoitava (9-15 syklin välillä). Jos riittävää tuotetta ei pystytä tuottamaan (50 ng DNA:ta), useita PCR-reaktioita olisi yhdistettävä eikä syklien lukumäärää olisi lisättävä, viisi reaktiota riittää yleensä (Belton et al., 2012).
• Tasapainota lukupituudet. Kuten kaikissa sekvenssikokeissa, laadukkaat lukemat ovat ensiarvoisen tärkeitä. Lukupituuden on oltava optimaalinen, jotta voidaan tasapainottaa pitkien lukujen tarve vuorovaikutusten kartoittamiseksi, mutta ei liian pitkä, jotta lukupituus ei kulkeutuisi ligointiliitoksen läpi partnerifragmenttiin. Siksi 50 bp:n lukemat ovat useimmissa tapauksissa optimaalisia (Belton et al., 2012).
• Valitse sopiva bin-koko. Tämä on ratkaisevan tärkeää tietojen analysoinnin kannalta. Bin-koon tulisi olla kääntäen verrannollinen odotettujen vuorovaikutusten määrään alueella. Käytä pienempiä binejä useammin esiintyville kromosomien sisäisille vuorovaikutuksille ja suurempia binejä harvemmin esiintyville kromosomien välisille vuorovaikutuksille (Belton ym., 2012).

Capture-C

Capture-C käyttää 3C- ja oligonukleotidikaappaustekniikan (OCT) yhdistelmää yhdessä korkean läpimenotehon sekvensoinnin kanssa satojen lokusten tutkimiseen kerralla. Capture-C on ihanteellinen, kun tarvitaan sekä korkeaa resoluutiota että genomin laajuista mittakaavaa. Esimerkiksi analysoitaessa genomin jokaisen sairauteen liittyvän SNP:n funktionaalista vaikutusta paikalliseen kromatiinirakenteeseen (Hughes ym., 2014).

Capture-C:n hyödyllisiä vinkkejä:

• Valitse koettimien paikat huolellisesti. Koettimet kannattaa sijoittaa lähelle restriktioentsyymipaikkoja, jopa päällekkäin, jos mahdollista (Hughes ym., 2014).
• Pidä kirjastot monimutkaisina. Kirjaston monimutkaisuuden säilyttäminen on ensisijainen prioriteetti. Monimutkainen kirjasto tarkoittaa enemmän laadukkaita vuorovaikutuksia tuotoksessa. Tästä syystä on vältettävä kaikkea, mikä voi vähentää kirjaston monimutkaisuutta, kuten Hi-C-biotiinikaappausta (Hughes ym., 2014).
• Varo vääriä vuorovaikutuksia päällekkäisillä alueilla. Kartoitusprosessi voi stimuloida voimakkaita vuorovaikutuksia näiden alueiden välillä (kuten pseudogeenit), jotka todellisuudessa ovat artefakteja (Hughes ym., 2014)

Belton JM, McCord RP, Gibcus JH, Naumova N, Zhan Y ja Dekker J (2012). Hi-C: kattava tekniikka genomien konformaation kuvaamiseen. Methods, 58, 268-76.

Dekker J, Rippe K, Dekker M ja Kleckner N (2002). Kromosomien konformaation vangitseminen. Science, 295, 1306-1311.

Dekker J. (2006). The three ’C’ s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nat Methods, 3, 17-21.

Dostie J ja Dekker J (2007). Genomielementtien välisten fyysisten vuorovaikutusten verkostojen kartoittaminen 5C-tekniikalla. Nat Protoc, 2, 988-1002.

Dostie J, Zhan Y ja Dekker J (2007). Kromosomin konformaation talteenoton hiilikopiotekniikka. Curr Protoc Mol Biol, Chapter 21, Unit 21.14.

Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF ja Kohwi-Shigematsu T (2005). DLX5:n silent-kromatiinisilmukan menetys ja heikentynyt imprinting Rettin oireyhtymässä. Nat Genet, 37, 31-40.

Fullwood MJ, et al. (2009). Estrogeenireseptori-alfa-sidonnainen ihmisen kromatiini-interaktomi. Nature, 462, 58-64.

Lieberman-Aiden E, et al. (2009). Pitkän kantaman vuorovaikutusten kattava kartoitus paljastaa ihmisen genomin taittoperiaatteet. Science, 326, 289-293.

Hughes JR (August 2014). Sähköpostihaastattelu.

Hughes JR, et al. (2014). Satojen cis-säätelymaisemien analyysi korkealla resoluutiolla yhdessä, korkean läpimenon kokeessa. Nat Genet, 46, 205-212.

Simonis M, Kooren J ja de Laat W (2007). An evaluation of 3C-based methods to capture DNA interactions. Nat Methods, 11, 895-901.

van de Werken H, de Vree PJ, Splinter E, Holwerda SJ, Klous P, de Wit E ja de Laat W (2012). 4C-tekniikka: protokollat ja tietojen analysointi. Methods Enzymol, 513, 89-112

.