Kolesterolisynteesin säätely

00:00:08.12Nimeni on Russell DeBose-Boyd,
00:00:10.03ja olen molekyyligenetiikan laitokselta
00:00:12.01Texasin yliopiston Southwestern Medical Centerissä Dallasissa, Texasissa.
00:00:00:15.17Tässä esityksessä,
00:00:00:17.19puhun HMG CoA -reduktaasin palautesäätelystä,
00:00:00:20.27joka on nopeutta rajoittava entsyymi kolesterolin synteesissä.
00:00:00:25.06Tässä diassa näkyy siis kolesterolin
00:00:27.06rakenne ja joitakin tämän tärkeän molekyylin ominaisuuksia.
00:00:00:31.01Kolesteroli on steroli,
00:00:33.10joka erottuu tästä nelirengasrakenteesta.
00:00:36.00Tämä nelirengasrakenne antaa tälle molekyylille jäykkyyden,
00:00:39.02joka tekee siitä ihanteellisen solukalvojen komponentin.
00:00:00:43.18Nyt, koska kolesterolilla on suuri määrä
00:00:46.07hiili-hiili- ja hiili-vetysidoksia,
00:00:49.02tämä molekyyli on käytännössä liukenematon veteen.
00:00:00:52.07Tästä syystä,
00:00:54.13solujen on pystyttävä pitämään kolesteroli kapealla alueella,
00:00:58.03niin, että kolesterolia tuotetaan riittävästi solujen tarpeisiin
00:01:02.13mutta vältetään kolesterolin myrkyllinen ylikertyminen.
00:01:06.16Kolesterolin ylikertyminen voi olla myrkyllistä solutasolla.
00:01:12.11Tässä diassa esitellään joitakin kolesterolin välttämättömiä tehtäviä.
00:01:15.10Kolesteroli on ehdottoman välttämätön elämälle.
00:01:17.26Kuten aiemmin mainitsin,
00:01:19.27yksi kolesterolin
00:01:22.26 tunnetuimmista tehtävistä on sen rooli solukalvoissa,
00:01:25.08jossa se ylläpitää optimaalista kalvojen juoksevuutta.
00:01:29.00Nyt kolesteroli osoittautuu tärkeäksi esiasteeksi
00:01:01:32.01erittäin tärkeille molekyyleille, kuten steroidihormoneille,
00:01:34.25jotka auttavat erottamaan tytöt ja pojat toisistaan;
00:01:38.19bilehappoja, jotka auttavat ruoansulatuksessa ja ravitsemuksessa liuottamalla ravintorasvoja ja rasvaliukoisia vitamiineja;
00:01:47.10ja sitten lopuksi kolesterolia on runsaasti aivoissa,
00:01:50.18jossa sitä on myeliinitupissa, joka ympäröi aksoneita
00:01:53.17ja auttaa synap… synaptisissa siirtymissä.
00:01:58.18Kehomme solut – nisäkkäiden… nisäkkäiden solut –
00:02:02.01hankkivat kolesterolia kahdesta lähteestä.
00:02:04.21Yksi lähteistä on havainnollistettu tässä diassa,
00:02:07.06ja se on kolesterolin synteesi
00:02:09.19esimerkkinä olevasta asetyyli-CoA:sta.
00:02:13.00Nyt, asetyyli-CoA:n muuntaminen kolesteroliksi
00:02:15.21tapahtuu yli 20 entsyymin vaikutuksesta.
00:02:20.22Nyt, kuten voitte kuvitella,
00:02:22.21kolesterolin synteesiin kuuluu useiden välituotteiden tuottaminen,
00:02:26.16ja nämä välituotteet itsessään
00:02:29.14voivat myös muuntua hyvin tärkeiksi lopputuotteiksi.
00:02:33.11Esimerkiksi tämä yhdiste, farnesyylipyrofosfaatti,
00:02:36.29on esiaste tärkeälle yhdisteelle nimeltä doliholi,
00:02:40.25joka on mukana N-sidoksisessa glykosylaatiossa.
00:02:43.26Se on myös esiaste hemille ja ubikinoneille,
00:02:46.10jotka ovat mukana soluhengityksessä;
00:02:49.26vitamiini K, joka osallistuu veren hyytymiseen;
00:02:53.12ja sitten lopuksi tämä farnesyylipyrofosfaatti ja geranyyligeranylipyrofosfaatti
00:02:58.06kiinnittyvät moniin signalointiproteiineihin,
00:03:01.16pieniin GTP-proteiineihin,
00:03:03.22suuntaamalla ne kalvoille,
00:03:06.12ja tämä modifikaatio on ehdottoman välttämätöntä solun normaalille toiminnalle.
00:03:13.04Tässä diassa näkyy, että kolesterolin synteesi
00:03:16.02 tapahtuu eri kudoksissa eri tahtiin.
00:03:19.29Maksa ja lisämunuaiset
00:03:23.14syntetisoivat eniten kolesterolia kehossamme.
00:03:25.10Ja huomautan, että tämä tehtiin itse asiassa hiirillä,
00:03:28.06mutta samanlaisia vaikutuksia nähdään ihmisillä
00:03:31.07ja muilla kädellisillä.
00:03:33.19Maksa… maksa syntetisoi suuria määriä kolesterolia
00:03:36.24pääasiassa lipoproteiinien tuotantoon
00:03:39.14ja myös sappihappojen synteesiin.
00:03:42.10Munuaiset tuottavat kolesterolia
00:03:45.28ensisijaisesti steroidihormonien synteesiä varten,
00:03:48.13jolloin suolisto syntetisoi kolesterolia…
00:03:51.27solunjakautumista varten.
00:03:54.12Suolesta irtoaa päivittäin suuri määrä soluja
00:03:57.12ja ne on korvattava uusilla soluilla,
00:03:59.27joka vaatii huomattavan määrän kolesterolisynteesiä.
00:04:03.28Minun on myös huomautettava, että suolisto on myös lipoproteiinien tuotannon lähde.
00:04:09.21Siten nyt toinen kolesterolin lähde
00:04:12.12on itse asiassa lipoproteiineista
00:04:15.16joita tuotetaan maksassa ja suolistossa.
00:04:18.06Tässä on siis pienitiheyksisen lipoproteiinin malli.
00:04:23.02Se on tärkein kolesterolin kuljettaja ihmisen veriplasmassa.
00:04:28.02Se on siis pienitiheyksinen lipoproteiini eli LDL,
00:04:31.14 koostuu ytimestä, joka koostuu vapaasta kolesterolista.
00:04:36.19Hydrofobinen kolesteroli muodostaa siis LDL-hiukkasen ytimen.
00:04:41.19Nyt tämä hydrofobinen kolesteroli
00:04:44.01 ympäröi kuori, joka koostuu fosfolipidistä, jossa on erilaisia määriä esteröityä kolesterolia, joka on kolesterolia, johon on liitetty rasvahappo,
00:04:55.14joka on kiinnittynyt fosfolipidikuoreen.
00:04:59.03Nyt koko LDL-hiukkanen
00:05:02.18on ympäröity proteiinilla, jota kutsutaan apolipoproteiini B:ksi.
00:05:08.02Tämä dia kuvaa
00:05:10.17 kuinka solut hankkivat kolesterolia näistä kahdesta lähteestä:
00:05:13.13endogeenisestä synteesistä ja LDL:stä.
00:05:18.19LDL-reseptorit
00:05:21.09– ne ovat solujen pinnalla —
00:05:23.20sitoutuvat LDL:ään vuorovaikutuksessa tämän apolipoproteiini B -hiukkasen
00:05:29.12 kanssa, joka ympäröi lipoproteiinin kuorta.
00:05:32.25Kun LDL-hiukkanen sitoutuu LDL-reseptoriin,
00:05:35.27kokonainen kompleksi sisäistyy päällystettyihin kuoppiin.
00:05:40.06Ja nämä päällystetyt kuopat kohdistuvat sitten lysosomeihin,
00:05:43.07jossa LDL-hiukkanen hajoaa ja kolesteroli
00:05:47.15– vapaa kolesteroli —
00:05:49.25vapautuu ja annetaan solun käyttöön eri käyttötarkoituksiin.
00:05:54.18Niin, nämä kaksi solukolesterolin lähdettä
00:05:58.03– joko reseptorista… LDL-reseptorin välityksellä tapahtuvasta LDL:n endosytoosista,
00:06:03.07tai endogeenisen synteesin kautta —
00:06:06.02voidaan käyttää vaihdellen.
00:06:09.01Jos siis esimerkiksi LDL:stä tulee rajoittava,
00:06:12.00solu siirtyy kolesterolilähteittensä osalta endogeeniseen synteesiin.
00:06:18.02Ja jos endogeeninen synteesi estyy,
00:06:20.05silloin solut voivat nyt käyttää eksogeenista LDL:ää
00:06:23.01kolesterolilähteekseen.
00:06:27.00Olemmekin puhuneet kolesterolin välttämättömästä tehtävästä.
00:06:30.10Se on tärkeä solukalvoissa.
00:06:32.11Se on tärkeä steroidihormonien
00:06:34.28ja sappihappojen esiaste.
00:06:36.16Kolesterolilla on kuitenkin huono puolensa,
00:06:38.13ja sitä havainnollistetaan tässä diassa.
00:06:41.00Korostuneet veren LDL-kolesterolipitoisuudet
00:06:46.14ovat liittyneet sepelvaltimotaudin
00:06:49.19ja sydänkohtausten riskiin.
00:06:51.16Tässä kuvassa siis näkyy, että
00:06:54.27veren kolesterolitaso
00:06:57.26 kirjaimellisesti korreloi sepelvaltimotaudin riskin kanssa.
00:07:01.09Ja tämä johtuu siitä, että kohonnut kolesteroli
00:07:04.21voi itse asiassa laskeutua valtimoihin, jotka johtavat…. sydämeen.
00:07:08.12Ja ajan mittaan tämä kerrostuminen
00:07:11.15johtaa ateroskleroosiksi kutsuttuun sairauteen,
00:07:13.09jossa tämä kolesterolin kerrostuminen
00:07:15.04voi johtaa plakkien muodostumiseen
00:07:17.12jotka lopulta voivat estää verenkierron sydämeen,
00:07:19.18 jolloin syntyy sydänkohtaus.
00:07:23.06Nyt yksi yleisimmin määrätyistä lääkkeistä
00:07:28.16LDL-kolesterolin alentamiseksi
00:07:31.11on ryhmä lääkkeitä, joita kutsutaan statiineiksi.
00:07:33.03Tässä on esitetty statiinien tyypillinen ydinrakenne
00:07:37.26ja joitakin statiinien eri muotoja
00:07:41.29joita on hyödynnetty klinikassa.
00:07:44.22Statiineista
00:07:47.12on vuosien varrella tullut yksi… myydyimpiä lääkkeitä…
00:07:49.10lääkkeitä Yhdysvalloissa
00:07:51.20koska ne pystyvät alentamaan veren LDL-kolesterolia.
00:07:57.19Tässä kokeessa näkyy siis yhteenveto ainakin neljästä tutkimuksesta
00:08:02.23jotka osoittavat, että statiinit todellakin alentavat LDL-kolesterolia
00:08:06.06ja että alentaminen johtaa sepelvaltimotaudin vähentyneeseen esiintyvyyteen
00:08:10.04Sepelvaltimotaudin esiintyvyyteen.
00:08:12.11Näissä suljetuissa ympyröissä näkyvät siis kliiniset tutkimukset
00:08:15.11joissa potilaita hoidettiin joko statiinilla, joka näkyy… näkyy suljetuissa ympyröissä,
00:08:20.22tai lumelääkkeellä.
00:08:22.11Ja jokaisessa näistä tutkimuksista statiinihoito johti
00:08:25.17LDL-kolesterolipitoisuuden laskuun,
00:08:28.06ja tämä LDL-kolesterolipitoisuuden lasku
00:08:31.19johti sepelvaltimotautitapahtumien, eli sydänkohtausten, vähenemiseen.
00:08:35.13Kysymykseksi nousee siis, miten statiinit toimivat?
00:08:38.21Ja mitä statiinit tekevät?
00:08:40.28Vastasimme siis ensin, mitä statiinit tekevät?
00:08:43.16Statiinit estävät HMG CoA -reduktaasi -entsyymiä.
00:08:47.05HMG CoA -reduktaasi katalysoi
00:08:50.20kolesterolin synteesin nopeutta rajoittavaa vaihetta.
00:08:53.28Se on itse asiassa neljäs vaihe kolesterolin synteesireitillä.
00:08:58.06Statiinit estävät siis kilpailukykyisesti HMG CoA -reduktaasia
00:09:01.20jäljittelemällä reduktaasireaktion tuotetta,
00:09:05.13mevalonaattia.
00:09:07.20Tämä kilpailullinen reduktaasin esto
00:09:10.19perustaa statiinien kyvyn alentaa
00:09:14.18LDL-kolesterolin määrää veressä.
00:09:18.07Miten statiinit siis toimivat?
00:09:20.17Tämä kilpailullinen esto taas estää HMG CoA -reduktaasia,
00:09:24.01Tämä johtaa mevalonaatin
00:09:27.09määrien vähenemiseen ja tietenkin kolesterolin vähenemiseen.
00:09:30.18Tämä kolesterolin väheneminen johtaa
00:09:33.12LDL-reseptoria koodaavan geenin
00:09:36.06 transkription lisääntymiseen.
00:09:37.25Ja sen seurauksena LDL-reseptoreiden määrä pinnalla…
00:09:41.14Etenkin maksasoluissa,
00:09:43.15ja tämä LDL-reseptoreiden lisääntyminen johtaa
00:09:48.01veren LDL:n lisääntyneeseen tai tehostuneeseen ottoon.
00:09:52.25Ja tämä veren LDL:n väheneminen
00:09:55.26on vastuussa sepelvaltimotaudin vähenemisestä
00:09:58.20statiineilla hoidetuilla potilailla.
00:10:02.12Mutta statiinien
00:10:05.26kliiniset vaikutukset
00:10:05.26on itse asiassa vaimennettu
00:10:09.06HMG CoA -reduktaasin kompensatorinen lisääntyminen
00:10:11.10joka liittyy statiinihoitoon.
00:10:13.19Ja tätä havainnollistetaan tässä diassa.
00:10:15.13Tämä on HMG CoA -reduktaasiproteiinin immunoblot
00:10:19.03hiirten maksassa, joille on syötetty statiinia,
00:10:22.17tai jopa viljellyissä soluissa
00:10:25.00joita on käsitelty statiinilla in vitro.
00:10:26.24Ja kuten näette,
00:10:28.20statiinihoito aiheuttaa merkittävää kertymistä
00:10:31.09HMG CoA -reduktaasista.
00:10:33.10Ja tämä kertyminen, kuten aiemmin mainitsin,
00:10:35.24vaimentaa statiinien kliinisiä vaikutuksia.
00:10:38.12Ja seuraava kysymyksemme on, miksi statiinit aiheuttavat
00:10:41.27HMG CoA -reduktaasin kertymisen niin korkealle tasolle?
00:10:44.14Jonka on arvioitu olevan vähintään 200-kertainen.
00:10:47.0200:10:49.29Normaali HMG CoA -reduktaasi
00:10:51.25on siis valtavan palautesäätelyn alainen.
00:10:55.02Ja tätä palautesäätelyä välittävät osittain
00:10:57.29sterolit.
00:11:00.02Nyt statiinihoito, kuten aiemmin mainitsin,
00:11:02.05blokkaa HMG CoA -reduktaasin aktiivisuuden,
00:11:04.12ja se estää näiden sterolimolekyylien synteesin.
00:11:07.29Ja tietenkin tämä sterolisynteesin estäminen
00:11:10.26on itse asiassa vastuussa LDL-reseptoreiden ylössäätelystä
00:11:14.17ja sitä seuraavasta LDL-kolesterolin vähenemisestä.
00:11:18.09Mutta koska statiinit
00:11:21.03sulkevat sterolien synteesin,
00:11:22.18se häiritsee reduktaasin takaisinkytkentäsäätelyä.
00:11:25.14Ja sen seurauksena tapahtuu kolme tapahtumaa.
00:11:27.28Ensiksi, koska tämä kolesterolin väheneminen
00:11:31.09ja muita kolesterolin synteettisen polun tuotteita,
00:11:35.08reduktaasigeenin transkriptio tehostuu,
00:11:39.07reduktaasin mRNA:n translaatio tehostuu,
00:11:41.28reduktaasin mRNA:n translaatio,
00:11:43.17ja lopuksi on lisääntynyt reduktaasiproteiinin
00:11:45.24stabiliteetti.
00:11:47.13Nämä kolme tapahtumaa ovat siis vastuussa
00:11:49.19reduktaasiproteiinin huomattavasta lisääntymisestä
00:11:52.03näytin teille edellisessä diassa.
00:11:55.18Vuosien varrella
00:11:57.06laboratorioni on ollut kiinnostunut yrittämään ymmärtää
00:11:59.27molekulaarisia mekanismeja, jotka ovat
00:12:02.22tämän proteiinin lisääntyneen stabiilisuuden taustalla,
00:12:04.09ja se on tämän esityksen loppuosan aiheena.
00:12:09.16Tämä dia siis havainnollistaa, että sterolit
00:12:13.08vauhdittavat HMG CoA -reduktaasin
00:12:15.26hajoamista.
00:12:17.14Tässä kokeessa,
00:12:19.11käytimme klassista pulse-chase-analyysia
00:12:20.29seurataksemme reduktaasin stabiilisuutta soluissa
00:12:23.16joita on käsitelty ilman steroleja tai niiden läsnäollessa.
00:12:26.00Tämässä tutkimuksessa leimaamme tyypillisesti soluja radioaktiivisuudella,
00:12:29.27pientä osajoukkoa HMG CoA -reduktaasin molekyylejä.
00:12:33.25Sitten otamme radioaktiivisuuden pois,
00:12:35.25ja seuraamme sitten pres…
00:12:37.25reduktaasiproteiinin stabiilisuutta
00:12:39.26sterolien puuttuessa tai läsnä ollessa.
00:12:44.10Ja kuten tässä näkyy,
00:12:46.08jos soluja ajetaan mediassa,
00:12:49.07jossa ei ole radioaktiivisuutta,
00:12:51.01sterolien puuttuessa,
00:12:52.28reduktaasiproteiini pysyy melko stabiilina ajan kuluessa.
00:12:55.16Mutta, kuten näette,
00:12:57.21sterolien lisääminen ajoväliaineeseen
00:12:59.26aiheuttaa reduktaasitasojen huomattavan vähenemisen.
00:13:02.20Tämä taas viittaa sterolien kiihdyttämään hajoamiseen
00:13:06.04 HMG CoA -reduktaasin osalta.
00:13:09.16Nyt, jotta ymmärtäisimme molekyylimekanismeja
00:13:11.22tämän sterolin aiheuttaman reduktaasin hajoamisen
00:13:14.15Meidän on ymmärrettävä HMG CoA -reduktaasiproteiinin rakenne.
00:13:18.05Ja reduktaasin domainirakenne
00:13:20.14on itse asiassa havainnollistettu tässä diassa.
00:13:22.18HMG CoA -reduktaasi
00:13:24.16kokoontuu siis kahdesta eri domeenista.
00:13:26.28Se on N-terminaalinen domeeni
00:13:29.06joka ankkuroi proteiinin endoplasmisen retikulumin,
00:13:32.14tai ER:n kalvoihin.
00:13:35.00Nyt tämä N-terminaalinen domeeni,
00:13:36.29jota kutsumme kalvodomeeniksi,
00:13:39.04sisältää kahdeksan membraanin ylittävää aluetta.
00:13:42.05Ja sitä seuraa HMG CoA -reduktaasin toinen domeeni,
00:13:45.07jota kutsumme katalyyttiseksi domeeniksi.
00:13:47.24Katalyyttinen domeeni työntyy siis solujen sytosoliin
00:13:51.24ja sisältää kaiken HMG CoA -reduktaasin entsymaattisen aktiivisuuden.
00:13:56.03Reduktaasin typistetty versio
00:13:59.29joka sisältää vain katalyyttisen domeenin
00:14:02.13voi täysin pelastaa mevalonaatin synteesin
00:14:06.28soluissa, joista puuttuu HMG CoA -reduktaasi.
00:14:10.13Katalyyttinen domeeni on siis sekä välttämätön että riittävä
00:14:13.01mevalonaatin synteesin kannalta.
00:14:15.29Jolloin herää kysymys,
00:14:17.28miksi tämä proteiini on kalvoon sidottu?
00:14:19.26Ja käy ilmi, että reduktaasi
00:14:22.02on itse asiassa kalvoon sidottu proteiini jo hiivassa.
00:14:25.18Reduktaasin kalvodomeenin tehtävä
00:14:28.26 havainnollistettiin tässä varhaisessa kokeessa, jossa verrattiin katalyyttisen domeenin
00:14:35.08 – joka, muistakaa, sisältää kaiken entsymaattisen aktiivisuuden –
00:14:37.26 stabiilisuutta koko entsyymin pituuteen.
00:14:40.20Ja jälleen kerran yksinkertaista pulssi-chase-analyysiä
00:14:42.21 käytettiin näiden kahden proteiinin stabiilisuuden seuraamiseen.
00:14:47.13Vasemmanpuoleisessa paneelissa näkyy,
00:14:49.03katkaistu katalyyttinen domeeni tuottaa
00:14:53.14erittäin stabiilin proteiinin,
00:14:53.14joka… mikä tärkeää,
00:14:57.08 sen hajoamiseen eivät vaikuta sterolit.
00:14:59.20 Sen sijaan täyspitkä proteiini – joka taas sisältää membraanidomeenin –
00:15:03.07on vähemmän vakaa, jopa ilman steroleja.
00:15:06.13Ja näet, että sterolit kiihdyttävät huomattavasti HMG CoA -reduktaasin hajoamista,
00:15:12.09 mikä osoittaa, että kalvodomeeni…
00:15:15.15.12kalvodomeenin tehtävä
00:15:17.25on tämä sterolien kiihdyttämä tai sterolien indusoima hajoaminen.
00:15:22.08Mitä aiemmat tutkimukset siis osoittivat
00:15:25.12on, että reduktaasin kalvodomeeni
00:15:28.03on välttämätön ja riittävä sterolien kiihdyttämälle hajoamiselle,
00:15:30.25ja ne viittasivat siihen, että kalvodomeeni,
00:15:33.16suorasti tai epäsuorasti,
00:15:35.16voi aistia solunsisäiset sterolitasot.
00:15:38.00Ja aistiminen johtaa kenties,
00:15:41.02on konformaatiomuutos reduktaasin kalvodomeenissa
00:15:43.29joka saa proteiinin alttiiksi nopealle hajoamiselle.
00:15:48.14Ja tietysti, koska statiinit estävät kolesterolin synteesin,
00:15:52.01statiinit todellakin estävät tämän
00:15:54.22jota kutsumme ER-assosioituneeksi hajoamiseksi – tai ERAD:ksi –
00:15:57.08 HMG CoA -reduktaasin hajoamiseksi.
00:16:02.23Tärkeä läpimurto ymmärryksessämme
00:16:04.23 HMG CoA -reduktaasin ERAD:sta
00:16:06.15 tapahtui, kun löydettiin pari proteiinia
00:16:08.28– ER-kalvoproteiinit —
00:16:10.23nimeltään Insig-1 ja Insig-2.
00:16:14.15Nämä Insig-proteiinit ovat tässä puheenvuorossa
00:16:16.27erittäin redundantteja.
00:16:18.14Ne suorittavat redundantteja tehtäviä HMG CoA -reduktaasin hajoamisessa eli ERAD:ssa,
00:16:22.06 HMG CoA -reduktaasin hajoamisessa.
00:16:24.00Ne ovat identtisiä… ne ovat noin 85-prosenttisesti identtisiä,
00:16:26.23ja ne ovat erittäin hydrofobisia proteiineja.
00:16:29.24Nyt, Insigien rooli HMG CoA -reduktaasin ERAD:ssa
00:16:34.28selvitettiin ensimmäisen kerran tässä kokeessa.
00:16:37.19Tässä käytimme siis jälleen kerran pulssi-chase-analyysiä
00:16:40.15mittaamaan sterolien kiihdyttämää hajoamista
00:16:43.29reduktaasin soluissa
00:16:47.02jotka oli joko transfektoitu kontrollimolekyyleillä,
00:16:51.06nimeltään siRNA:t,
00:16:53.05tai soluja, jotka transfektoitiin siRNA:illa,
00:16:55.26jotka johtaisivat sekä Insig-1:n että Insig-2:n ilmentymisen tyrmäämiseen.
00:16:58.13
00:17:02.07Ja kuten näet vasemmanpuoleisessa paneelissa,
00:17:04.13kontrollisiRNA:lla transfektoiduissa soluissa,
00:17:08.04sterolit kiihdyttävät merkitsevästi HMG CoA -reduktaasin hajoamista
00:17:12.07.
00:17:14.13Avoimet ympyrät ovat siis kokeita, jotka on tehty ilman,
00:17:17.09ja suljetut ympyrät ovat kokeita, jotka on tehty
00:17:20.15sterolien läsnä ollessa.
00:17:22.12Ja voitte helposti nähdä, että Insig-1:n ja Insig-2:n knockdown
00:17:26.23katkaisee kokonaan sterolien kiihdyttämän hajoamisen,
00:17:30.02mikä osoittaa, että nämä proteiinit
00:17:32.28ovat avainasemassa prosessissa.
00:17:35.27Jatkokysymyksemme on siis,
00:17:38.02millä mekanismilla
00:17:39.26insigit kiihdyttävät HMG CoA -reduktaasin ERADia?
00:17:47.09Tässä kokeessa…
00:17:48.21Tämä dia osoittaa, että proteasomin, 26S-proteasomin,
00:17:53.21inhibiittorit estävät HMG CoA -reduktaasin sterolien aiheuttaman hajoamisen.
00:17:57.15Kuten näet tässä kokeessa…
00:18:00.18kahdella ensimmäisellä kaistalla, sterolit aiheuttivat reduktaasin huomattavan hajoamisen,
00:18:04.17ja tämä hajoaminen estyy täysin
00:18:06.19jos näitä soluja hoidetaan proteasomi-inhibiittorilla.
00:18:12.03Siten… tämän avulla voimme luoda toisen mallin
00:18:15.27jossa taas reduktaasin kalvodomeeni
00:18:18.25joko suoraan tai epäsuorasti
00:18:21.22havaitsee solunsisäiset sterolitasot,
00:18:24.15. Tämä saa reduktaasin sitoutumaan Insigiin,
00:18:28.12ja että Insigin sitoutuminen johtaa reaktioihin, jotka saavat aikaan sen, että reduktaasi
00:18:32.06joutuu nyt 26S-proteasomin hajotettavaksi.
00:18:37.22Nyt tiedetään, että useimmat proteasomien substraatit
00:18:41.00edellyttävät niiden edeltävää ubikitinaatiota.
00:18:44.05Ubikitinaatio on prosessi, jossa
00:18:46.23pieni proteiini ubikitiini kiinnittyy kovalenttisesti
00:18:50.16substraattimolekyyleihin.
00:18:52.08Ja kun ubikitiiniketju
00:18:54.16on kiinnittynyt substraatteihin,
00:18:56.08se tulee proteasomien tunnistettavaksi hajotettavaksi.
00:19:00.25Nyt, tätä kutsutaan polyubikitinaatioksi,
00:19:02.25ja proteiinien polyubikitinaatio
00:19:05.14vaatii vähintään kolmen erityyppisen entsyymin toimintaa.
00:19:07.29Tämä on havainnollistettu tässä diassa.
00:19:11.09Ensimmäisessä vaiheessa,
00:19:13.15ubikitiini aktivoituu
00:19:15.20 ATP:stä riippuvaisella tavalla entsyymin nimeltä E1,
00:19:19.11 eli ubikitiinia aktivoiva proteiini.
00:19:22.15Seuraavassa vaiheessa ubikitiini siirtyy E1:stä…
00:19:27.13 toiseen entsyymiin, jota kutsutaan E2:ksi eli ubikitiinikonjugaatioentsyymiksi.
00:19:32.16Viimeisessä vaiheessa E2 yhdistyy E3:een,
00:19:36.24 eli ubikitiiniligaasiin,
00:19:39.08joka puolestaan liittyy substraattiin,
00:19:42.09kuva tässä vihreällä.
00:19:44.11E3 helpottaa ubikitiinin siirtymistä
00:19:47.27ubikitiinikonjugoivasta entsyymistä
00:19:50.00substraattiproteiinin lysiinijäämään,
00:19:53.08luodessaan ubikitinoidun substraatin.
00:19:57.28Nyt tämä prosessi tapahtuu monta kertaa,
00:20:00.02kunnes substraattiproteiinin päälle on muodostunut ubikitiiniketju.
00:20:06.02Tämän proteasomit voivat nyt tunnistaa proteasomien hajotettavaksi.
00:20:10.18Niin, ottaen huomioon, että nämä Insig-proteiinit
00:20:12.26ovat välttämättömiä reduktaasin hajoamiseen,
00:20:15.08ja että proteasomit itse asiassa hajottavat reduktaasin,
00:20:19.02 seuraava kysymyksemme on, onko reduktaasi ubikitinoitunut?
00:20:23.20Kysymykseen vastattiin tässä kokeessa, joka näkyy tässä diassa.
00:20:26.11Tässä diassa.
00:20:28.21Tässä kokeessa olemme siis käsitelleet soluja
00:20:31.15sterolien
00:20:33.20ja proteasomi-inhibiittorin puuttuessa ja läsnä ollessa.
00:20:37.05Tämän käsittelyn jälkeen,
00:20:39.11immunoprecipitoimme reduktaasin
00:20:41.21ja sitten koettelemme näitä immunoprecipitaatteja joko kokonaisreduktaasin,
00:20:43.20näytetään alimmassa paneelissa,
00:20:45.18tai ubikitoituneen reduktaasin osalta.
00:20:49.07Kuten näet ensimmäisellä kaistalla,
00:20:51.01vaikkakin reduktaasi vedetään alas näissä kokeissa,
00:20:55.11ei näy reaktiivisuutta ubikitinaation kanssa.
00:20:58.14Mutta sterolit saavat reduktaasin ubikitoitumaan.
00:21:03.09Ja tämä ubikitoituminen lisääntyy huomattavasti
00:21:07.22jos otamme mukaan myös proteasomin estäjiä.
00:21:09.27Tämä siis osoittaa meille, että sterolit
00:21:12.16vaikuttavat siihen, että reduktaasi muuttuu ubikitinoituneeksi,
00:21:14.20ja tämä ubikitinoitunut proteiini hajoaa nyt proteasomeissa,
00:21:17.18 kuten osoittaa ubikititoituneen reduktaasin
00:21:21.21vakaus näillä proteasomi-inhibiittoreilla.
00:21:24.27Jatkokysymyksemme on,
00:21:27.07Tarvitaanko Insigejä tähän sterolin indusoimaan reduktaasin ubikitinaatioon?
00:21:21:32.16Ja taas käännymme siRNA:iden puoleen.
00:21:35.08Solut transfektoitiin joko kontrolli-siRNA:lla
00:21:38.18tai siRNA:illa Insig-1:tä ja -2:ta vastaan.
00:21:41.03Käsittelemme sitten näitä soluja sterolien puuttuessa tai läsnä ollessa,
00:21:43.20ja koettelemme sitten ubikitoitunutta reduktaasia.
00:21:47.16Ja kuten näette kahdella ensimmäisellä kaistalla,
00:21:49.10reduktaasi on hienosti ubikitinoitunut sterolien läsnäollessa,
00:21:52.08ja Insig-1:n ja Insig-2:n knockdown
00:21:56.02katkaisee tämän ubikitinaation kokonaan.
00:22:01.01Siten voimme nyt täyttää lisää aukkoja mallissamme
00:22:04.07 HMG CoA -reduktaasin Insig-välitteisestä ERADista.
00:22:09.14Nyt käy ilmi, että osa Insig-molekyyleistä
00:22:12.00 tosiasiassa assosioituu E3/E2-ubikitiiniligaasikompleksin kanssa.
00:22:16.27Sterolien läsnä ollessa,
00:22:20.15reduktaasin
00:22:23.03kalvodomeeni aistii sterolin,
00:22:24.25ja tämä aistiminen saa reduktaasin sitoutumaan Insigiin,
00:22:27.28ja tietysti nämä Insigit
00:22:31.13silloittavat sitten reduktaasin E3/E2-ubikitiiniligaasikompleksiin.
00:22:36.26Tämä silloitus johtaa sitten reduktaasin
00:22:40.00ubikitinaatioon kahdessa lysiinijäämässä kalvodomeenissa.
00:22:43.17Ja tämä ubikitinaatio saa sitten aikaan sen, että reduktaasi
00:22:46.17poistuu ER-kalvosta
00:22:50.09ja sen jälkeen hajoaa proteasomien toimesta,
00:22:52.22prosessin kautta, jota emme täysin…
00:22:55.07prosessin kautta, jota emme täysin ymmärrä.
00:23:00.20Yhteenvetona, olen siis kertonut teille tänään
00:23:03.16että HMG CoA -reduktaasi on nopeutta rajoittava entsyymi
00:23:06.07kolesterolin synteesireitillä,
00:23:08.01ja se on näiden kolesterolia alentavien statiinilääkkeiden kohteena.
00:23:11.26Reduktaasia ohjaa hyvin monimutkainen
00:23:15.16palautesäätelyjärjestelmä
00:23:18.01joka välittyy kolesterolin ja muiden sterolityyppien välityksellä.
00:23:20.18 Ja että statiinit häiritsevät tätä palautesäätelyjärjestelmää,
00:23:24.03 osittain estämällä tämän Insig-välitteisen ubikitinaation
00:23:27.10ja HMG CoA -reduktaasin ERAD:in.