ISH: in situ -hybridisaatioprotokolla

Näytteen säilytys

RNA:n säilytys
RNA:n säilymistä vaikeuttaa RNaasientsyymin läsnäolo. Tätä entsyymiä on lasitavaroissa, reagensseissa sekä käyttäjissä ja heidän vaatteissaan. RNaasi tuhoaa nopeasti kaiken solussa olevan RNA:n tai itse RNA-koettimen, joten käyttäjien on varmistettava, että he käyttävät steriilejä tekniikoita, käsineitä ja liuoksia estääkseen koettimen tai kudoksen RNA:n RNaasikontaminaation.

Yleistä näytteiden säilytystä käytettäessä pakastepoikkileikkauksia
Parhaiden tuloksien saamiseksi vanhemmilla objektiolevyillä ei saa säilyttää objektiolevyjä kuivana huoneenlämmössä. Säilytä sen sijaan 100-prosenttisessa etanolissa -20 °C:ssa tai saran-kelmulla peitetyssä muovilaatikossa -20 °C:ssa tai -80 °C:ssa. Tällainen säilytys säilyttää objektilasit useita vuosia.

Koettimen valinta

RNA-koettimien

RNA-koettimien tulisi olla 250-1 500 emäksen pituisia; noin 800 emäksen pituisten koettimien herkkyys ja spesifisyys on suurin. Transkriptiomallien olisi mahdollistettava sekä koettimen (antisense-juoste) että negatiivisen kontrollin (sense-juoste) RNA:n transkriptio. Kloonataan vektoriin, jossa on vastakkaisia promoottoreita, jotta tämä saavutetaan. Pyöreät templaatit on linearisoitava ennen koettimen valmistamista, vaikka PCR-templaatteja voidaan myös käyttää.

DNA-koettimet

DNA-koettimet tarjoavat korkean herkkyyden in situ -hybridisaatiossa. Ne eivät hybridisoidu yhtä voimakkaasti mRNA-kohdemolekyyleihin kuin RNA-koettimet, joten formaldehydiä ei pitäisi käyttää hybridisoinnin jälkeisissä pesuissa.

Koettimen spesifisyys on tärkeää. Jos solussa olevan mRNA:n tai DNA:n tarkka nukleotidisekvenssi tunnetaan, voidaan suunnitella tarkka komplementaarinen koetin. Jos >5 % emäspareista ei ole komplementaarisia, koetin hybridisoituu kohdesekvenssiin vain löyhästi. Tämä tarkoittaa, että koetin huuhtoutuu todennäköisemmin pois pesu- ja havaitsemisvaiheiden aikana, eikä sitä välttämättä havaita oikein.

Digoksigeniinillä (DIG) leimatun RNA-koettimen in situ -hybridisaatioprotokolla

Tässä protokollassa kuvataan DIG-merkittyjen yksisäikeisten RNA-koettimien käyttö kiinnostavan geenin ilmentymisen havaitsemiseksi parafiiniin sulautetuissa leikkeissä.

1) Deparaffinointi

Jäädytetyissä leikkeissä aloitetaan vaiheesta 2. Jos käytetään formaldehydillä fiksoituja parafiiniin upotettuja leikkeitä, jatketaan tästä vaiheesta.

Ennen jatkamista objektilasit on deparafinoitava ja rehydratoitava. Puutteellinen parafiinin poisto voi aiheuttaa leikkeen huonon värjäytymisen.

Aseta objektilasit telineeseen ja suorita seuraavat pesut:

• Xyleeni: 2×3 min
• Xyleeni 1:1 100-prosenttisella etanolilla: 3 min
• 100-prosenttinen etanoli: 2×3 min
• 95-prosenttinen etanoli: 3 min
• 70 % etanoli: 3 min
• 50 % etanoli: 3 min
• Huuhtele kylmällä vesijohtovedellä

Pidä objektilasit vesijohtovedessä antigeenin talteenottoon asti. Tästä lähtien objektilasit eivät saa kuivua, sillä se aiheuttaa epäspesifistä vasta-aineen sitoutumista ja suurta taustavärjäytymistä.

2) Antigeenin talteenotto

Luota 20 µg/mL proteinaasi K:lla esilämmitetyssä 50 mM:n Tris-liuoksessa 10-20 minuutin ajan 37 °C:ssa. Inkubaatioaika ja proteinaasi K:n pitoisuus saattavat vaatia optimointia.

Suosittelemme kokeilemaan proteinaasi K:n titrauskokeilua optimaalisten olosuhteiden määrittämiseksi. Riittämätön sulatus vähentää hybridisaatiosignaalia ja liiallinen sulatus johtaa huonoon kudosmorfologiaan, jolloin hybridisaatiosignaalin lokalisointi on hyvin vaikeaa. Optimaalinen proteinaasi K:n pitoisuus vaihtelee kudostyypin, fiksaation keston ja kudoksen koon mukaan.

3) Huuhtele objektilasit 5x tislatulla vedellä.
4) Upota objektilasit jääkylmään 20 %:n (v/v) etikkahappoon 20 sekunniksi. Tämä permeabilisoi solut, jotta koetin ja vasta-aine pääsevät käsiksi.
5) Kuivaa objektilasit pesemällä noin 1 min per pesu 70 %:n, 95 %:n ja 100 %:n etanolissa ja kuivaa sitten ilmakuivalla.
6) Lisää 100 µl hybridisaatioliuosta jokaiselle objektilasille.

Suolaliuos (20x)

• 4 M NaCl
• 100 mM EDTA
• 200 mM Tris-HCl pH 7.5
• 100 mM NaH2PO4.2H2O

Denhardtin liuos (100x)

• 10 g Ficoll
• 10 g PVP (polyvinyylipyrrolidiini)
• 10 g naudan seerumialbumiinia (BSA)
• 500 ml steriiliä dH2O

7) Inkuboidaan objektiolevyjä 1 h kostutetussa hybridisaatiokammiossa halutussa hybridisaatiolämpötilassa. Tyypilliset hybridisointilämpötilat ovat 55-62 °C.
8) Laimenna koettimet hybridisointiliuoksessa PCR-putkissa. Kuumenna 95 °C:ssa 2 minuutin ajan PCR-blokissa RNA- tai DNA-koettimen denaturoimiseksi. Jäähdytä välittömästi jäällä uudelleenliimautumisen estämiseksi.
9) Valuta hybridisaatioliuos pois. Lisää 50-100 μl laimennettua koetinta leikettä kohti siten, että se kattaa koko näytteen. Inkuboidaan kostutetussa hybridisaatiokammiossa 65 °C:ssa yön yli. Peitä näyte peitelevyllä haihtumisen estämiseksi.

Tässä vaiheessa RNA-koetin hybridisoituu vastaavaan mRNA:han tai DNA-koetin hybridisoituu vastaavaan solun DNA:han. Optimoi hybridisointilämpötila käytetyn koettimen sekvenssin sekä solu- tai kudostyypin mukaan. Tämä lämpötila on optimoitava kullekin analysoitavalle kudostyypille.

Optimaalinen hybridisaatiolämpötila koettimille riippuu kohdesekvenssissä olevien emästen prosenttiosuudesta. Sytosiinin ja guaniinin pitoisuudet sekvenssissä ovat tärkeitä tekijöitä.

10) Tiukat pesut

Liuosparametreja, kuten lämpötilaa, suolan ja detergenttien pitoisuutta, voidaan manipuloida epäspesifisten vuorovaikutusten poistamiseksi.

Valmistetaan 1 L 20x suolaliuosta natriumsitraattia (SSC)

• 175,3 g NaCl (3 M)
• 88.2 g natriumsitraattia
• 800 ml steriiliä dH2O:ta
• Säädä pH 5:een sitruunahapolla, täytä 1 L:ksi ja autoklavoi

Huuhtele 1

• 50-prosenttinen formamidi 2x:ssä SSC:ssä
• 3×5 min, 37-45°C

Huuhtele ylimääräinen koetin ja hybridisaatiopuskuri pois korkeammissa lämpötiloissa (enintään 65°C) lyhytaikaisesti. Jos sitä jätetään liian pitkäksi aikaa, tämä voi pestä pois liikaa hybridisoitunutta koettimen RNA/DNA:ta.

Huuhtelu 2

• 0,1-2x SSC
• 3×5 min, 25-75°C

Vaiheessa poistetaan epäspesifinen ja/tai toistuva DNA/RNA:n hybridisaatio.

Seuraa näitä ohjeita optimoidaksesi lämpötilan ja suolakonsentraation tiukkuuspesuja varten:

• Erittäin lyhyille DNA/RNA-koettimille (0.5-3 kb) tai hyvin monimutkaisia koettimia varten pesulämpötilan tulisi olla alhaisempi (enintään 45 °C) ja stringensiteetin alhaisempi (1-2x SSC).
• Yksilokusisten tai suurten koettimien pesulämpötilan tulisi olla noin 65 °C ja stringensiteetin korkea (alle 0.5x SSC).
• Lämpötilan ja stringenssin olisi oltava korkeimmat toistuville koettimille (kuten alfa-satelliittitoistot).

11) Pese kahdesti MABT:ssä (maleiinihappopuskuri, joka sisältää Tween 20:tä) 30 minuutin ajan huoneenlämmössä. MABT on hellävaraisempi kuin PBS ja soveltuu paremmin nukleiinihappojen osoittamiseen.

Valmistetaan 5x MABT:n kanta

• 58 g maleiinihappoa
• 43,5 g NaCl
• 55 g Tween-20:tä
• 900 ml vettä

Huojennetaan pH-arvo 7,5:een lisäämällä tris-basea. Tarvitaan noin 100 g. Tuo lopullinen tilavuus 1 litraan.

12) Kuivaa objektilasit.
13) Siirretään kostutettuun kammioon ja lisätään 200 µl estopuskuria jokaiseen leikkeeseen (MABT + 2 % BSA, maito tai seerumi). Blokkaa 1-2 tuntia huoneenlämmössä.
14) Valuta blokkauspuskuri pois. Lisää leimavasta-aine tarvittavassa laimennoksessa estopuskuriin. Tarkista suositeltu pitoisuus/laimennus vasta-aineen tietolehdestä. Inkuboi 1-2 h huoneenlämmössä.
15) Pese objektilasit 5×10 min MABT:llä huoneenlämmössä.
16) Pese objektilasit 2×10 min kukin huoneenlämmössä esivärjäyspuskurilla (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2).
17). Fluoresenssin havaitsemiseksi siirry vaiheeseen 18. Muita toteamismuotoja varten palauta objektilasit kostutettuun kammioon ja noudata valmistajan ohjeita värin kehittymistä varten.

18) Huuhtele objektilasit tislatulla vedellä.
19) Kuivaa dioja ilmakuivaksi 30 minuutin ajan. Pese 100-prosenttisella etanolilla ja kuivaa huolellisesti ilmakuivaksi.
20) Kiinnitä käyttäen DePeX-kiinnitysliuosta.