Enterokokit

2.4.3.2 Enterokokkien hydrolyyttiset aktiviteetit

Enterokokkien tiedetään tuottavan kolmenlaisia entsyymejä, jotka vaikuttavat niiden opportunistiseen patogeenisyyteen: hyaluronidaasia, gelatinaasia ja seriiniproteaasia . Hyaluronidaasi, jota koodaa kromosomaalinen hyl-geeni, hajottaa isäntäsolujen solunulkoisen matriksin tärkeintä ainesosaa, hyaluronihappoa, mikä helpottaa kudosinvaasiota ja toksiinien leviämistä .

Gelatinaasi, jota koodaa kromosomaalinen gelE-geeni, on sinkkimetalloproteaasi, joka on aktiivinen gelatiinille, mutta myös kollageenille, kaseiinille, hemoglobiinille, β-insuliinille, ja toisille biologisesti aktiivisille peptideille . Tämä entsyymi edistää myös biofilmin muodostumisprosessia, joka voi helpottaa kudosten kolonisaatiota ja pysyvyyttä infektiokohdissa , . Seriiniproteaasi, jota koodataan geeni sprE:llä, joka sijaitsee ylävirtaan gelE:n yläpuolella ja transkriboituu yhdessä jälkimmäisen kanssa, osallistuu myös patogeneesiin hajottamalla isäntäkudoksia .

Enterokokit myötävaikuttavat juuston aromien kehittymiseen kypsymisen aikana proteolyyttisen ja lipolyyttisen aktiivisuutensa ja kykynsä tuottaa haihtuvia tai pitkäketjuisia rasvahappoja, diasetyyliä, asetoiinia ja muita haihtuvia yhdisteitä vuoksi . E. faecium osallistuu maun, aromin, värin ja rakenteen kehittymiseen. Näin ollen se vaikuttaa osaltaan tiettyjen juustojen yleiseen aistinvaraiseen profiiliin. Nämä ominaisuudet tekevät siitä myös muiden fermentoitujen tuotteiden, kuten vihannesten tai lihan, suosikkiflooran.

Maitohappobakteerien proteolyyttiset toiminnot on kuvattu hyvin fermentoituja tuotteita käsittelevässä kirjallisuudessa, mutta enterokokkien proteolyyttiset toiminnot eivät ole yhtä tunnettuja. Ne ovat melko vähäisiä maitotuotteissa, lukuun ottamatta joitakin E. faecalis -kantoja . Tämän suvun sisällä proteolyyttisen aktiivisuuden taso riippuu lajista ja saman lajin sisällä olevasta kannasta. Parhaiten kuvatut proteaasit pystyvät hydrolysoimaan kaseiinia mutta myös β-laktoglobuliinia ja α-laktalbumiinia . Monet tutkimukset osoittavat, että E. faecalis -bakteerilla inokuloidusta maidosta valmistetuilla juustoilla on suurempi proteolyyttinen aktiivisuus kuin juustoilla, jotka on valmistettu ilman näitä entsyymejä. Työt, joissa tutkittiin 24 E. faecium -kannan ja 60 E. faecalis -kannan kasvua rasvattomassa maidossa 37 °C:ssa, osoittavat, että E. faecalis -kannan proteolyyttinen aktiivisuus on paljon suurempi kuin E. faecium -kannan. Nämä tulokset vahvistetaan ja ja maitotuotteissa sekä pastöroiduista nestemäisistä kokonaisista kananmunista eristetyillä enterokokkeilla, jotka ovat vastuussa niiden pilaantumisesta.

Aminohappojen myöhemmällä hajoamisella katsotaan olevan merkittävä vaikutus juustojen aromin kehittymiseen. Proteolyyttinen toiminta voi myös olla vastuussa siitä, että enterokokit muodostavat biogeenisiä amiineja niiden (tai muiden bakteerityyppien) vapauttamista aminohapoista . Kuvassa 2.6 on esitetty erilaisia biogeenisiä amiineja, joita mahdollisesti muodostuu pilaantuvissa elintarvikkeissa.

Kuva 2.6. Biogeenisten amiinien muodostuminen elintarvikematriisissa mikrobiologisen aineenvaihdunnan vaikutuksesta. Harmaat nuolet kuvaavat dekarboksylaatioreaktioita, jotka johtavat suoraan biogeenisten amiinien muodostumiseen, ja katkoviivat kuvaavat biogeenisiä amiineja, jotka syntyvät yksivaiheisista dekarboksylaatioreaktioista poikkeavien metaboliareittien kautta.

(Kuva otettu lähteestä , muokattu )

Histamiini, tyramiini, fenyylietyyliamiini ja kadaveriini tuotetaan yksivaiheisella dekarboksylaatioreaktiolla niiden esiasteista histidiinistä, tyrosiinista, fenyylialaniinista ja lysiinistä. Näiden biogeenisten amiinien tuotanto ja niiden erittyminen edellyttävät (1) aktiivisia kuljetusjärjestelmiä esiasteina oleville aminohapoille, (2) dekarboksylaatioita ja (3) näiden dekarboksylaatioiden tuloksena syntyviä amiinien erittymisjärjestelmiä. Kuljetukseen liittyy yleensä proteiini, joka vaihtaa esiasteaminohapon sen dekarboksylaation tuloksena syntyvään amiiniin. Soluun päästyään aminohappo käy läpi dekarboksylaation, jota katalysoi spesifinen dekarboksylaasi (karboksylaasit EC 4.1.1.1.1.) pyridoksaalifosfaatin läsnä ollessa. Tutkituimmat dekarboksylaasit ovat histidiinidekarboksylaasi (HDC), tyrosiinidekarboksylaasi (TDC) ja lysiinidekarboksylaasi (LDC), joita koodaavat vastaavasti hdcA-, tdcA- ja cadA-geenit. Myöhemmin ne järjestäytyvät operoneiksi muiden geenien kanssa, jotka osallistuvat biogeenisten amiinien tuotantoprosessin muihin vaiheisiin, kuten kuljetukseen ja kypsytykseen. Näiden dekarboksylaasien spesifisyydestä on kiistelty pitkään, ja nykyään on vakiintunut, että yksi dekarboksylaasi voi dekarboksyloida useita substraatteja. Esimerkiksi Enterococcus TDC voi dekarboksyloida fenyylialaniinia ja tyrosiinia tuottaakseen fenyylietyyliamiinia ja tyramiinia . Putressiini, agmatiini, spermidiini ja spermiini syntetisoidaan eri reiteillä, joita katalysoivat geeniryhmät, jotka voivat olla laji- tai kantaspesifisiä, koska ne on mahdollisesti hankittu horisontaalisella siirrolla .

Enterokokkien on kuvattu kykenevän aiheuttamaan dekarboksylaasiaktiviteetteja, jotka ovat vastuussa biogeenisten amiinien tuotannosta fermentoiduissa elintarvikkeissa. Niillä tunnustetaan olevan jopa bakteerimaailman voimakkaimmat tyrosiini- ja fenyylialaniinidekarboksylaasiaktiivisuudet . Maitohappobakteerit, jotka kuuluvat fermentoidun lihan, kuten makkaroiden, endogeeniseen kasvistoon, tunnustetaan tärkeimmiksi tyramiinin tuottajiksi . Juustot ja jotkin lihatuotteet voivat olla sopivia substraatteja 2-fenyylietyyliamiinin, tyramiinin, histidiinin tai muiden amiinien tuotantoon. Näissä kannoissa on siis geenejä tai operoneja, jotka koodaavat dekarboksylaaseja tai muita entsyymejä, jotka osallistuvat biogeenisten amiinien synteesiin tai niiden kataboliaan . Meri- ja äyriäistuotteiden osalta biogeenisten amiinien synteesin ei katsota olevan enterokokkien ansiota. Lämpöä kestävät bakteerit, kuten enterokokit, jotka ovat tärkeimmät maitotuotteiden biogeenisten amiinien tuotantoon osallistuvat bakteerit , häviävät vain osittain pastöroimalla, mutta lämpökäsittely vähentää biogeenisten amiinien määrää. Tämä ilmiö voi johtua elintarvikkeen saastumisen vähenemisestä ja/tai siitä, että pastörointi on denaturoinut välttämättömän dekarboksylaatiokofaktorin .

Vaikka maitohappobakteerit eivät ole kovin aktiivisia lipidien suhteen, niiden tiedetään osallistuvan juustojen maustamiseen joko muuntamalla lyhytketjuisia rasvahappoja ketoneiksi tai metyloituneiksi laktoneiksi tai muodostamalla aldehydejä, jotka syntyvät tyydyttymättömien rasvahappojen hapettumisen tuloksena ja jotka ovat vastuussa härskiintyneiden hajujen ja makujen kehittymisestä, joko liuottamalla lipideistä, mutta myös valkuaisaineista ja laktoosista syntyviä aromaattisia yhdisteitä . Mukaan , ja , enterokokkeilla on esteraasiaktiivisuus, joka on usein voimakkaampi kuin muilla maitohappobakteereilla. Myös enterokokkien keskuudessa nämä aktiivisuudet vaihtelevat, ja tutkimukset osoittavat, että ne ovat voimakkaampia E. faecalis -bakteerilla kuin E. faecium -bakteerilla. Muut tutkimukset osoittavat, että enterokokkien lipolyyttinen aktiivisuus ei vaihtele lajin vaan sen juustotyypin mukaan, josta kanta on peräisin .

Jo vuonna 1965 osoitettiin E. faecalis- ja E. faecium -kantojen ilmaisemaa esteraasiaktiivisuutta. osoittaa, että enterokokit olivat aktiivisempia triglyserideille kuin Streptococcus-kannat ja että hydrolyysinopeudet vähenivät vapautuvien rasvahappojen hiiliketjun pituuden kasvaessa (tripropioniini > tributyriini > trikapriini > trikapryliini). Ne korostavat aktiivisuuden puutetta trioleiinin suhteen. osoittavat, että enterokokkien lipolyyttinen aktiivisuus on alhainen, kun ne sijoitetaan täysmaitoa sisältävään kasvualustaan. Työ osoittaa, että E. faecium- ja E. faecal -kantojen ilmentämä tributyriinihydrolyysi eristetään juustosta, mutta nämä kannat eivät kuitenkaan ole aktiivisia maidon lipidien suhteen. osoittavat, että E. faecalis -lajin lipaasi on aktiivisempi myös tributyriinille kuin trikaproiinille, trikapryliinille ja trioleiinille. Enterokokkien kyky hydrolysoida maidon lipidejä vaihtelee kuitenkin suuresti kannasta toiseen. Joillakin kannoilla ei ole lainkaan lipolyyttistä aktiivisuutta, kun taas toisilla on suuri aktiivisuus monille rasvahapoille. Synteettisillä substraateilla (4-nitrofenyyliasyyleillä) tehdyt tutkimukset osoittavat, että E. faecium on aktiivinen rasvahapoille, joiden ketjun pituus on 2-18 hiiltä. Myöhemmissä tutkimuksissa samat kirjoittajat osoittivat, että E. faecium -bakteerin solunsisäinen esteraasi kehittyy in vitro aktiiviseksi 4-nitrofenyyliasyyleille, joiden ketjun pituus on 2-12 hiiliyhdisteen välillä, ja sen aktiivisuus on optimaalinen 4-nitrofenyylibutyraatin (C2) läsnä ollessa. Työ osoittaa, että suurin osa testatuista enterokokkikannoista (90 %, N = 129) pystyy hydrolysoimaan homogeenisia triglyseridejä, jotka sisältävät rasvahappoja, joiden ketjun pituus on 4-18 hiiltä, ja aktiivisuus vähenee hiiliketjun pituuden kasvaessa. Kaikki samassa tutkimuksessa testatut kannat (100 %) osoittavat aktiivisuutta synteettisillä substraateilla 4-nitrofenyyliasetaatista (C2) 4-nitrofenyylistearaattiin (C18), ja aktiivisuus vähenee myös rasvahappojen hiiliketjun pituuden kasvaessa.

Munatuotteiden pilaantumiseen mahdollisesti liittyviä hydrolyyttisiä aktiviteetteja käsittelevien harvojen julkaistujen tutkimusten joukossa on tutkimuksia, joissa osoitetaan pilaantuneista pastöroiduista nestemäisistä kokonaisista kananmunatuotteista eristettyjen E. faecium- ja erityisesti E. faecalis -kantojen ilmentämiä lipolyyttisiä aktiviteetteja. Työ paljastaa, että lipaasiaktiivisuutta on havaittu myös puolessa teollisesta kananmunanvalkuaisesta saaduista Enterococcus-kannoista, ja testattiin niiden kykyä pilata yksi kelluvien saaristolaisjälkiruokien pääkomponenteista, vaniljakerma.