Emerging Applications of Bacterial Spores in Nanobiotechnology

Spore coats are comprised of protein, have ordered arrays of protomeric subunits, showit self-assembly and have protective properties . Lepotilassa olevina, aineenvaihdunnallisesti inaktiivisina elämänmuotoina itiöt voivat säilyä loputtomiin kuivuneina, ja niiden on todettu säilyneen koskemattomina miljoonia vuosia . Itiöt kestävät jopa 90 °C:n lämpötiloja sekä altistumista haitallisille kemikaaleille . Useimmat (mutta eivät kaikki) itiöitä muodostavat bakteerit kuuluvat kahteen pääsukuun, Bacillus ja Clostridium. Toisin kuin Bacillus, Clostridia-suvun itiöitä muodostavat bakteerit erilaistuvat vain anaerobisissa olosuhteissa, mikä tekee Bacillus-suvusta parhaiten tutkittavissa olevan suvun.

Bacillus-suvun lajit tuottavat yksittäisen itiön tai endosporin (toisin kuin sienien eksosporit) bakteerisolun sisällä erilaistumisprosessilla, joka edellyttää satojen kehitysgeenien koordinoitua toimintaa . Tyypillisesti kypsät itiöt ovat 0,8-1,2 μm pitkiä ja joko pallomaisia tai ellipsinmuotoisia (ks. kuva 1A). Yksittäinen bakteerikromosomi on tiivistynyt itiön keskelle, jota kutsutaan ytimeksi. Lipidikalvon ja modifioidun peptidoglykaanin kerrokset ympäröivät itiön ydintä, mutta tärkein rakenne on itiökuori. Tämä kerrostunut proteiinipitoinen kuori antaa itiölle vastustuskyvyn orgaanisia liuottimia ja lysotsyymiä vastaan. Bacillus subtiliksessa on jopa 25 erilaista kuoriproteiinia kahdessa erillisessä kuorikerroksessa (kuva 1B), sisä- ja ulkokuoressa, mutta muilla lajeilla on viitteitä siitä, että kuori on vähemmän monimutkainen ja voi joissakin tapauksissa koostua vain muutamasta proteiinityypistä. Itiöiden vaipan rakenne ja kokoonpano on nyt nousemassa mallijärjestelmäksi, jonka avulla voidaan ymmärtää monimutkaisia morfogeneettisiä kokoonpanoprosesseja samaan tapaan kuin faagin T4-kokoonpanoa koskevissa klassisissa tutkimuksissa. B. subtilis -organismin itiökotelon ulompi, elektronitiheä kerros koostuu viidestä pääpolypeptidistä, CotA:sta (65 kDa), CotB:stä (59 kDa), CotG:stä (24 kDa), CotC:stä (11 kDa) ja CotF:stä (8 kDa). CotA on monikuparioksidaasi, ja se voi kerääntyä multimeerisiksi muodoiksi (mikroskooppisesti havaittavissa) itiösolujen sisälle joissakin päällystevaurioituneissa mutanteissa. Oletettavasti CotA:n oligomerisaatio ja itsekokoonpano edeltää sen laskeutumista itiökuoren pinnalle. CotG- ja CotB-proteiinien on myös osoitettu olevan kovalenttisessa vuorovaikutuksessa, ja lisäksi CotG:llä ja myös CotC:llä on erittäin epätavallisia aminohapposekvenssejä, jotka sisältävät useita 12-13 aminohapon toistoja (>13), joissa on runsaasti lysiinejä ja tyrosiineja. Lisäksi monilla itiökuoren proteiineilla on epätavallisia profiileja eli multimeerimuotoja ja poikkeavia molekyylimassoja, kun niitä tutkitaan SDS-PAGE:lla. Äskettäin on osoitettu, että itiökuori on itse asiassa joustava ja että se voi laajentua ja supistua, ja tämä ominaisuus on kriittinen itiönmuodostuksen kannalta, kun itiö kuivuu, ja vastaavasti itämisen kannalta, kun itiö kostuu. Tämä itsejärjestäytyvän rakenteen aspekti on erityisen mielenkiintoinen, ja se saattaa tarjota tulevaisuudessa useita sovelluksia lääkkeiden jakelussa, nanovalmistuksessa ja pintapinnoitteissa.

Bakteerien endosporat. Paneelissa A on B. subtilis -bakteerista peräisin olevia endosporeita, joista yksi on vielä säilynyt sauvanmuotoisen ”emosolun” sisällä. B. subtiliksessa itiöt ovat noin 1,2 μm pitkiä ja ellipsinmuotoisia. Vapautuvilla itiöillä on kirkas suojakuori, jota kutsutaan itiökuoreksi ja joka koostuu jopa 25 eri protomeerikomponentista, jotka on koottu erillisiksi kerroksiksi. Paneelissa B on esitetty tyypillinen SDS-PAGE (12,5 %) -fraktiointi liuotetuista itiökuoren proteiineista, joka paljastaa vallitsevat lajit.

Bakteerien itiökuoren muokkaaminen

Kuvassa 2 on hiljattain raportoitu strategiasta, jonka avulla Bacillus subtilis -bakteerin itiöitä voidaan muokata siten, että ne pystyvät näyttämään heterologisia antigeenejä itiökuoren pinnalla. Sporaan perustuva display-järjestelmä tarjoaa useita etuja verrattuna bakteerisolujen käyttöön perustuviin järjestelmiin, kuten bakteeri-itiön kestävyys, joka mahdollistaa säilytyksen kuivattuna, tuotannon helppous, turvallisuus ja teknologinen alusta, jota tukevat laajat geneettisen manipuloinnin välineet.

Spore surface display using spore coat proteins. B. subtilis -sienen itiö koostuu sisäisestä ytimestä (keltainen), jota ympäröi peptidoglykaanin kaltainen kuori (punaisella), ja proteiinipitoisesta kuoresta, joka jakautuu sisäiseen (vihreään) ja ulkoiseen (mustaan) osaan. Fuusioproteiini, joka koostuu kantajaosasta (sininen) ja matkustajaosasta (violetti), on alttiina itiön pinnalla.

Vastakohtana sille runsaalle tiedolle, joka on saatavilla siitä, miten geeniekspressio kontrolloi kasvavan solun erilaistumista lepotilassa olevaksi itiöksi, tiedetään vain vähän mekanismeista, joilla proteiinit sulautuvat vaippaan, vaipan ulkoisimmaksi jäävän osan muodostavien rakenteellisten komponenttien luonteesta ja siitä, esiintyykö vaipassa kiinnitysmotiiveja. Ensimmäiset yritykset altistaa heterologisia proteiineja itiön pinnalle ovat keskittyneet kahteen päällyskomponenttiin, CotB:hen ja CotC:hen. CotB:n osalta tiedetään, että tämä itiön vaippaproteiini sijaitsee pinnalla, kun taas CotC:n osalta tämän lajin suhteellinen runsaus muihin vaippaproteiineihin nähden on suuri. Havainto siitä, että kumpikin näistä päällyskomponenteista oli välttämätön näennäisesti normaalin itiön muodostumiselle ja itämiselle, oli myönteinen lisäominaisuus CotB:n ja CotC:n valinnassa mahdollisiksi kantajaproteiineiksi.

Malliproteiineiksi itiöpinnalle valittiin aluksi kaksi antigeenia: i) tetanustoksiinin (TTFC), hyvin karakterisoidun ja erittäin immunogeenisen 51, myrkyttömän 459 aminohapon C-terminaalinen fragmentti.8 kDa:n peptidi, jota Clostridium tetani -bakteerin tetC-geeni koodaa; ja ii) Escherichia coli -bakteerin enterotoksisten kantojen lämpöherkän toksiinin (LTB) 103 aminohappoa sisältävä B-alayksikkö, 12 kDa:n peptidi, jota eltB-geeni koodaa.

CotB kantajaproteiinina

Kuten muutkin kuoren komponentit, CotB on yhdistetty ulkokuorikerrokseen geneettisten todisteiden perusteella, ja vasta äskettäin intakteista itiöistä tehty immunosytofluorimetrinen analyysi on osoittanut, että CotB on CotB-spesifisten vasta-aineiden saavutettavissa, ja siksi se on todennäköisesti alttiina itiön pinnalla .

CotB:n rakennegeeni, cotB, on σK:n ja DNA:ta sitovan proteiinin GerE:n kaksoistranskriptiokontrollin alaisena. Tämän seurauksena cotB transkriboituu vain itiösolun emosoluosastossa . Kun CotB on syntetisoitunut emosolun sytoplasmassa, se kootaan muodostuvan itiön ympärille tavalla, joka on jollakin tavalla riippuvainen CotE:stä, CotG:stä ja CotH:sta. Siksi CotB ja siihen mahdollisesti fuusioitu heterologinen proteiini eivät käy läpi soluseinän translokaatiovaihetta, joka on tyypillistä muiden bakteerien display-järjestelmille.

CotB:llä on vahvasti hydrofiilinen C-terminaalipuolisko, joka muodostuu kolmesta 27:stä 27:stä aminohappoa sisältävästä toistosta, joissa on runsaasti seriini-, lysiini- ja glutamiinijäämiä. Seriinijäämien osuus CotB:n C-terminaalipuoliskosta on yli 50 %. CotB:n toistojen lysiinijäämien on ehdotettu edustavan molekyylin sisäisiä tai molekyylien välisiä ristisilloittumiskohtia analogisesti sidekudosproteiinien kollageenin ja elastiinin kanssa. CotB-proteiinin päätelty molekyylimassa on 46 kDa, mutta se siirtyy SDS-PAGE:ssa 59 kDa:n polypeptidinä. Viime aikoina mitatun ja johdetun molekyylimassan välinen ristiriita on selitetty osoittamalla, että CotB syntetisoidaan alun perin 46 kDa:n lajina ja muunnetaan 59 kDa:n homodimeeriksi , joka säilyttää sekä N- että C-terminaaliset päät, jotka on ennustettu cotB:n nukleotidisekvenssin perusteella.

STRATEGIA, jolla pyritään saamaan rekombinantti B. subtilis itiöiden, jotka ilmentävät CotB-TTFC:tä tai CotB-LTB:tä pinnallaan, perustui i) cotB-geenin ja sen promoottorin käyttöön translaatiofuusioiden rakentamiseen ja ii) cotB-tetC- ja cotB-eltB-geenifuusioiden kromosomaaliseen integrointiin ei-essentiaalisen geenin amyE:n koodaavaan sekvenssiin (kuva 3A) . Fuusioproteiinien sijoittaminen cotB:n transkriptio- ja translaatiosignaalien alle varmisti ilmentymisen oikean ajoituksen sporulaation aikana, kun taas sen kromosomaalinen integrointi takasi rakenteen geneettisen vakauden. Koska CotB:n vaipan kokoonpanosta ja ankkurointimotiivien vaatimuksista ei ollut tietoa, ensimmäiset kokeilut tehtiin sijoittamalla matkustajaproteiini CotB:n C-terminaaliin, N-terminaaliin tai keskelle CotB:tä (kuva 3B).

Spore-surface display -järjestelmä B. subtiliksessa . (A) Kaaviokuva geenifuusioiden integroitumisesta kromosomiin. Punaiset pylväät kuvaavat geenifuusioita, harmaa ja vihreä pylväs kuvaavat integraatiokohteena käytettyä B. subtiliksen ei-essentiaalista amyE-geeniä ja kloramfenikoliasetyylitransferaasigeeniä (cat), jota käytetään selektiivisenä merkkiaineena. (B) Kaavamainen esitys fuusioproteiineista, joissa käytetään kantajaproteiineina joko täyspitkää CotB:tä (380 aminohappoa) tai CotBΔ105:tä (275 aminohappoa) tai CotC:tä (66 aminohappoa) (kaikki sinisellä). Täyspitkän CotB:n kolme 27 aminohapon toistoa ja CotBΔ105:een jäävä osa niistä ovat mustalla. Violetit palkit kuvaavat fuusioiden heterologista osaa (TTFC tai LTB).

Kun TTFC ja LTB fuusioitiin CotB:n C-terminaaliseen päähän, kimeeriset proteiinit eivät pystyneet kunnolla assosioitumaan itiön pinnalle (Isticato ja Ricca, julkaisematon). Tällaiset alkuvaiheen epäonnistumiset johtuivat konstruktioiden mahdollisesta epävakaudesta joko DNA-tasolla (toistuvat DNA-sekvenssit) tai proteiinitasolla. Tällaisten ongelmien välttämiseksi TTFC ja LTB fuusioitiin kolmen 27 aminohappokertauksen poistaman CotB-muodon, CotBΔ105-TTFC:n, C-terminaaliseen päähän (kuva 3A). Täyspitkästä versiosta poiketen CotBΔ105-TTFC-kimeerinen proteiini koottiin oikein ja se paljastui itiön pinnalle. Kvantitatiivinen dot blot osoitti, että kukin rekombinantti-itiö paljasti CotBΔ105-TTFC-fuusioproteiinia 0,00022 pg, minkä perusteella voidaan päätellä, että kunkin rekombinantti-itiön pinnalla on 1,5 × 103 kimeeristä molekyyliä.

Toisin kuin CotBΔ105-TTFC, CotBΔ105-LTB ei ollut kunnolla koottu. Tätä kimeeraa ilmentävällä kannalla oli heikentynyt sporulaatio- ja itävyystehokkuus, eivätkä sen itiöt olleet vastustuskykyisiä lysotsyymille. Nämä havainnot yhdessä vapautuneiden vaippaproteiinien SDS-PAGE-analyysin kanssa viittasivat siihen, että CotBΔ105-LTB:n läsnäolo muutti voimakkaasti itiöiden vaippakerrosta. In-silico -analyysi osoitti jonkin verran homologisuutta kimeerisen tuotteen (fuusioalueella) ja LytF:n, B. subtiliksen vegetatiivisen kasvun aikana tuottaman soluseinään assosioituneen endopeptidaasin, välillä, mikä herätti mahdollisuuden, että kimeerinen tuote voisi häiritä asianmukaista kotelon muodostumista hajottamalla joitakin kotelon komponentteja (Mauriello ja Ricca, tietoja ei ole esitetty).

Yllä kuvatun C-terminaalisen päätyfuusion lisäksi mallimatkustajaproteiini TTFC on fuusioitu myös CotB:n N-terminaalista ja keskeltä (kuva 3B). Molemmissa tapauksissa käytettiin CotBΔ105-muotoa CotB:stä, jotta vältettäisiin C-terminaalifuusion yhteydessä ilmenneet ongelmat (ks. edellä). Sekä N-terminaaliset että sandwich-fuusiot synnyttivät kimeerisiä tuotteita, jotka asettuivat asianmukaisesti kotelorakenteeseen sekä kvalitatiivisesta että kvantitatiivisesta näkökulmasta . Ainakin CotB:n tapauksessa voitiin tällöin päätellä, että siellä, missä matkustajaproteiini on alttiina, se ei vaikuta itiön pinnalla esiintymiseen.

CotC kantajaproteiinina

CotC on B. subtilis -itiön itiökuoren 12 kDa:n suuruinen alkaliliukoinen komponentti, joka on aiemmin tunnistettu käänteisen genetiikan avulla ja joka on sen jälkeen assosioitunut uloimpaan kuorikerrokseen geneettisen todistusaineiston perusteella . CotC:tä pidettiin alun perin kantajaehdokkaana sen suhteellisen runsauden vuoksi kuoressa (kuva 1B). Yhdessä CotG:n ja CotD:n kanssa CotC:n osuus on noin 50 prosenttia kaikista liuennutista vaippaproteiineista. Tällaiset suhteellisen suuret määrät mahdollistaisivat merkittävän määrän CotC:hen perustuvia kimeerejä, mikä takaisi tehokkaan heterologisen näytön. CotC-geenin ilmentyminen on emosolukohtaisen σ-faktorin σK ja transkriptiosäätäjien GerE ja SpoIIID:n valvonnassa. Kuten CotB:n tapauksessa, myös CotC:n transkriptio tapahtuu emosolussa, eikä sen kokoaminen kuoreen vaadi kalvotranslokaatiota. CotC-geenin päätuote on 66 aminohappoa sisältävä polypeptidi, jossa on erittäin paljon tyrosiini- (30,3 %) ja lysiinijäämiä (28,8 %). Hiljattain kuitenkin osoitettiin, että CotC:stä muodostuu ainakin neljä erilaista proteiinimuotoa, joiden koko vaihtelee 12 ja 30 kDa:n välillä . Kaksi näistä proteiineista, joiden molekyylimassat ovat 12 ja 21 kDa ja jotka vastaavat todennäköisimmin CotC:n monomeeristä ja homodimeeristä muotoa, kerääntyvät muodostuvaan itiöön heti synteesinsä jälkeen kahdeksan tuntia sporulaation alkamisen jälkeen. Kaksi muuta muotoa, 12,5 ja 30 kDa, ovat luultavasti kahden muun muodon posttranslationaalisten modifikaatioiden tuotteita, jotka tapahtuvat suoraan päällyksen pinnalla itiön kypsymisen aikana.

CotC:n tapauksessa on toistaiseksi konstruoitu vain C-terminaalisia fuusioita (kuva 3B). Sekä CotC-TTFC- että CotC-LTB-geenifuusio saatiin kloonaamalla tetC- tai eltB-geeni viimeisen cotC-kodonin kanssa samaan kehykseen cotC-promoottorin alueen transkriptio- ja translaatiokontrollin alaisena. Geenifuusio integroitiin sitten B. subtilis -kromosomiin amyE-lokuksen kohdalle kaksinkertaisella cross-over-rekombinaatiolla (kuva 3A). Molemmat näistä kahdesta kimeerisestä proteiinista asettuivat rekombinantti-itiöiden kuoreen ilman merkittävää vaikutusta itiön rakenteeseen ja/tai toimintaan, koska ne näyttivät identtisiltä villityyppisten itiöiden kanssa itiön sporulaation ja itämisen tehokkuuden sekä resistenssiominaisuuksien suhteen. Western blot, sytofluorimetrinen analyysi ja CotC-TTFC:n osalta immunofluoresenssimikroskopia (kuva 4) osoittivat, että kumpikin CotC-pohjainen kimeera esiintyi rekombinantti-itiöiden pinnalla. B. subtilis -sienen itiöissä altistuneiden rekombinanttiproteiinien kvantitatiivinen määritys osoitti, että n. 9,7 × 102 ja 2,7 × 103 molekyyliä CotC-TTFC:tä ja CotC-LTB:tä uutettiin kustakin itiöstä.

CotC-LTB:n ja CotC-TTFC:n esiintymisen toteaminen immunofluoresenssimikroskopialla. B. subtilis -kantojen sporulaatio indusoitiin resuspensiomenetelmällä, ja näytteet otettiin 6 tuntia sporulaation alkamisen jälkeen ja analysoitiin immunofluoresenssimikroskopialla aiemmin kuvatulla tavalla . Näytteet merkittiin hiiren anti-LTB-vasta-aineella, jota seurasi antihiiren IgG-TRITC-konjugaatti (punainen fluoresceiini, taulut A & B), tai kanin anti-TTFC-vasta-aineella, jota seurasi kanin IgG-FITC-konjugaatti (vihreä fluoresceiini, taulut C & D). Paneelit A & C, villityypin itiöt; Paneeli B, isogeeniset itiöt, jotka ilmentävät CotC-LTB); Paneeli D, isogeeniset itiöt, jotka ilmentävät CotC-TTFC:tä.

Vaikka CotC:tä näyttäisikin esiintyvän runsaampana kuin CotB:tä vaipassa, CotC-pohjainen ja CotBΔ105-pohjainen järjestelmä paljastavat vertailukelpoisia määriä heterologisia proteiineja. Tämä tulos oli jokseenkin odottamaton, koska CotC näyttää olevan paljon runsaampi kuin CotB turkissa. Mahdollinen selitys tulee hiljattain tehdystä havainnosta, jonka mukaan CotC:n C-terminaalinen pää ei ole välttämätön ainoastaan vuorovaikutuksessa muiden CotC-molekyylien kanssa, vaan myös muiden vaipan komponenttien kanssa (Isticato ja Ricca, käsikirjoitus valmisteilla), mikä osoittaa, että CotC:n käyttöä kantajana on vielä optimoitava.

Stability of Spore-Displayed Proteins

Yksi tärkeimmistä syistä, joiden vuoksi ehdotetaan bakteeri-itiön käyttöä suotuisaksi näytteillepanosysteemiksi, on sen hyväksi todettu vakaus. Sporeja voidaan yksinkertaisesti säilyttää huoneenlämmössä pitkään ilman, että niiden kestävyys- ja stabiilisuusominaisuudet heikkenevät. Tämä olisi erittäin hyödyllinen ominaisuus monissa bioteknisissä sovelluksissa. Jos esimerkiksi matkustajaproteiini on antigeeni, rekombinantti-itiöstä voisi tulla ihanteellinen lämpöstabiili oraalinen rokote käytettäväksi kehitysmaissa, joissa lämpöstabiilisuus on suurin huolenaihe huonon jakelun ja varastoinnin vuoksi.

Vaikka itiön stabiilisuus on hyvin dokumentoitu, itiön pinnalle altistuvien heterologisten proteiinien stabiilisuutta on kuitenkin tutkittu vasta äskettäin. CotBΔ105-TTFC:tä (ks. edellä) ilmentäviä itiöitä ja vanhempien itiöitä säilytettiin -80 °C:ssa, -20 °C:ssa, +4 °C:ssa ja huoneenlämmössä, ja ne tutkittiin eri säilytysaikoina aina 12 viikkoon asti. Kaikissa tapauksissa rekombinantti-itiöiden pinnalla olevan heterologisen proteiinin määrä näytti olevan identtinen vastavalmistettujen itiöiden ja enintään 12 viikkoa säilytettyjen itiöiden välillä (kuva 5). Nämä tulokset, jotka osoittavat, että heterologisia proteiineja voidaan stabiilisti altistaa rekombinantti-itiöiden pinnalle, vahvistavat, että itiöpohjainen järjestelmä on erittäin lupaava esitysmenetelmä, jolla voidaan poistaa eräitä muiden järjestelmien haittoja ja jolla voisi olla sovelluksia monilla erilaisilla bioteknologian aloilla.

Dot blot -analyysi valkuaisaineista, jotka on uutettu villityyppisistä itiöistä ja itiöistä, joissa on altistettu CotBΔ 105 -TTFC-kimera. Tuoreet puhdistetut itiöt, jotka ilmentävät CotBΔ105-TTFC-kimera (t0) tai 4, 8 tai 12 viikon (t4, t8 ja t12) huoneenlämpötilassa tapahtuneen varastoinnin jälkeen, tutkittiin uutettujen itiön vaippaproteiinien pisteblottauksella. Puhdistetun TTFC:n (nanogrammoina) ja vaippaproteiinien (mikrogrammoina) pitoisuudet on merkitty. Proteiinit ladattiin ja reagoivat monoklonaalisilla anti-TTFC-vasta-aineilla (Boeringher) ja sen jälkeen fosfataasikonjugoiduilla sekundäärisillä vasta-aineilla. Vastaavan intensiteetin signaaleja saatiin tuoreilla puhdistetuilla itiöillä ja itiöillä, joita säilytettiin huoneenlämmössä jopa 12 viikkoa.

Periaatetodistus suun kautta annettavasta rokotteesta, jossa käytetään jäykkäkouristusta malliksi

CotBΔ105-TTFC:tä ekspressoivilla itiöillä on saatu immunisoitua hiiriä oraalista reittiä käyttäen . Seerumin IgG ja ulosteen sIgA osoittivat selvää serokonversiota TTFC:lle. Annosteluohjelmassa käytettiin kolmea kolmen annoksen sarjaa (1,67 × 1010) viiden viikon aikana, ja se perustui suun kautta tehtäviin immunisaatioihin optimoituihin järjestelmiin. TTFC-spesifisen IgG:n titterit 33 päivän kuluttua (>103) viittasivat siihen, että ne olivat suojaavalla tasolla, ja hiiret, jotka altistettiin jäykkäkouristustoksiinille, joka vastasi 10 LD50-arvoa, olivat täysin suojattuja. Kahdeksasta hiirestä, joille annettiin 20 LD50-annos, seitsemän jäi eloon, mikä viittaa siihen, että tämä oli suojan kynnysarvo. Samankaltainen tutkimus tehtiin käyttäen nenäimmunisaatiota CotB-TTFC-itiöillä, mutta pienemmällä annoksella ja kolmella immunisaatiokerralla. Tässä tapauksessa TTFC-spesifiset IgG-vasteet olivat pienempiä, mutta serokonversio saatiin silti aikaan. Nämä tutkimukset osoittavat, että heterologista antigeenia ilmentäviä muokattuja itiöitä voidaan käyttää suojaavaan immunisaatioon. Lisäksi vaikka limakalvovasteet eivät ole tärkeitä suojautumisessa Clostridium tetani -bakteeria (systeeminen patogeeni) vastaan, ne ovat ilmeisen tärkeitä limakalvopatogeeneja vastaan. Lisätutkimuksia tarvitaan annostelujärjestelmien optimoimiseksi (pienemmät annokset ja vähemmän itiöitä), mutta nämä uraauurtavat tutkimukset ovat avanneet tien kehitystyölle tiettyjä limakalvopatogeeneja vastaan. Vaikka nämä tutkimukset ovat rohkaisevia ja osoittavat humoraalisia vasteita, ei ole vielä selvää näyttöä soluvasteista. On kuitenkin osoitettu, että itiöt leviävät GALT:hen ja niitä löytyy Peyerin laikuista (PP) ja suoliliepeen imusolmukkeista. Itiöiden pienen koon (1 μm) ansiosta M-solut voivat ottaa ne vastaan ja kuljettaa ne PP:hen, jossa ne voivat olla vuorovaikutuksessa antigeeniä esittävien solujen kanssa. Ensimmäiset tutkimukset ovat osoittaneet, että itiöt voivat itää ja säilyä lyhyen aikaa suoliston makrofageissa sekä synnyttää in vivo Th 1 -sytokiineja, kuten IFN-γ .

.