Apoentsyymi

5.11.3 Proteiinin rooli – entsyymin, koentsyymin ja substraatin väliset vuorovaikutukset

Koentsyymi sitoutuu kaikissa tapauksissa apoentsyymiin ilman, että absorptiospektri muuttuu perusteellisesti. Tämä havainto viittaa siihen, että entsyymi ei vääristä korriinirengasta sen perustilan liuoskonformaatiosta. Koentsyymi-proteiinikompleksin UV-näön absorptiospektristä ei kuitenkaan ole saatavissa tietoa α-aksiaalisen ligandin identiteetistä. Tutkimukset ovat osoittaneet, että α-aksiaalinen 5,6-dimetyylibentsimidatsoliligandi on korvattu histidiinisivuketjulla vastaavasta proteiinista ainakin kolmessa kobalamiinista riippuvaisessa entsyymissä: metioniinisyntaasissa,4,7 metyylimalonyyli-CoA-mutaasissa,8,45,46 ja glutamaattimutaasissa47. Sitä vastoin kobalamiinin 5,6-bentsimidatsoli-ligandi on edelleen α-akselin ligandin asemassa AdoCbl:ssä, joka on sitoutunut diol-dehydraasiin48 ja ribonukleotidireduktaasiin (ks. luku 5.08).

Histidiinisivuketjun koordinoinnin mahdollistamiseksi 5,6-dimetyylibentsimidatsoli-emäksen, ribofuranosyylifosfodiesterin ja propionamidisivuketjun ”nukleotidisilmukan” on heilahdettava poispäin korriinirenkaasta ja työnnyttävä proteiinissa olevaan sitoutumistaskuun. Konsensussekvenssi DxHxxG on tunnistettu kobalamiiniriippuvaisissa entsyymeissä, jotka korvaavat α-aksiaalisen ligandin histidiinisivuketjulla.7,49,50 Kobolttiatomin kanssa koordinoituva histidiini vuorovaikuttaa varmasti aspartaattijäännöksen kanssa vetysidoksen välityksellä. Koordinoivan ligandin roolin lisäksi His/Asp-dyadin tarkka tehtävä entsymaattisen aktiivisuuden modulaattorina ei ole vielä selvillä.49 Myös muut aktiivisen keskuksen jäännökset voivat osallistua laajennettuun vetysidosverkostoon, joka kontrolloi reaktiivisuutta metallikeskuksessa.7 7

Adenosyylikobalamiinista riippuvaisten entsyymien on lisättävä CoC-sidoksen homolyysin nopeutta vähintään kertoimella 1012 saavuttaakseen havaitun katalyysinopeuden.14 Adenosyylikobalamiinin labilisaatio vaatii CoC-sidoksen heikentämistä homolyyttisen halkeamisen mahdollistamiseksi. Vaikka kobalamiinista riippuvaisissa entsyymeissä ei olekaan todistettu, riittävä energia CoC-sidoksen vääristämiseen (heikentämiseen) voisi helposti olla peräisin ylimääräisen sidosenergian hyödyntämisestä, joka on peräisin monista vety-sidosvuorovaikutuksista kobalamiinin kofaktoriin, mukaan lukien korriinirengasta koristavat amidisivuketjut.51 Amidisivuketjut ovat myös tärkeitä tunnistuselementtejä sitoutumisessa ei-entsymaattisiin kobalamiinin kuljetusproteiineihin, transkobalamiiniin, haptokorriiniin ja sisäiseen faktoriin.52 Tiettyjen amidisivuketjujen poistaminen tai kemiallinen derivatisointi muuttaa sitoutumista transkobalamiiniin 3-40-kertaisesti52 , ja c-amidisivuketjun täydellinen poistaminen mahdollistaa ylimääräisen kaksoissidoksen lisäämisen makrosykliseen luurankoon, jolloin korriinirengas litistyy ja absorptiomaksimi siirtyy punaiseksi.53

Halutun reaktion edistämisen lisäksi adenosyylikobalamiinista riippuvaiset entsyymit suorittavat toisen tärkeän tehtävän estämällä ei-toivottuja sivureaktioita, jotka usein liittyvät radikaalireaktioihin.54 Tämä negatiivisen katalyysin54 tehtävä edellyttää erittäin rajoitettua vapaan energian pintaa, jonka voisi kuvitella syväksi kanjoniksi, jonka läpi reaktio etenee vapaan energian pintaa pitkin. Tässä kanjonissa on oltava jyrkät seinämät sivureaktioiden estämiseksi ja erittäin reaktiivisen radikaalin välituotteen rajoittamiseksi. Reaktiosekvenssin lopussa radikaaliväliaine sammutetaan 5′-deoksiadenosyyliradikaalin ja kob(II)alamiinin rekombinaatiolla, jolloin adenosyylikob(III)alamiinikofaktorin perustila (lepotila) palautuu. Jos entsyymi käyttää 25 kcal mol-1 edistääkseen C-Co-sidoksen homolyysiä katalyyttisen syklin aloittamiseksi, tämä energia on palautettava reaktiosarjan lopussa. Energian palauttaminen ei olisi mahdollista, jos tapahtuisi ei-toivottu uudelleenjärjestäytymissarja, joka tuottaa radikaalin, joka on termodynaamisesti stabiilimpi kuin 5′-deoksiadenosyyliradikaali. Siksi entsyymin on estettävä alkyyliradikaalia järjestäytymästä matalaenergiseksi välituotteeksi tai siirtymästä proteiinitelineen läpi muodostaen stabiilin radikaalin, joka ei voi osallistua katalyysiin.55

Paramagneettinen laji muodostuu vasta, kun kaikki reaktiokomponentit ovat läsnä entsyymi- ja substraattikompleksissa, sillä koentsyymiperäisen radikaalin muodostuminen substraatin puuttuessa saattaisi johtaa ei-toivottuihin sivureaktioihin. Metyylimalonyyli-CoA-mutaasilla46,55 tehdyt EPR-kokeet vahvistavat, että CoC-sidoksen homolyysi tapahtuu vasta substraatin lisäämisen jälkeen, minkä osoittaa tuotteen kaltaisen EPR-signaalin ilmaantuminen.46 Vastaavasti etanoliamiiniammoniakkilyaasilla tehdyt pysäytetyn virtauksen spektrofotometriset kokeet osoittavat, että kob(II)alamiinin allekirjoitus ilmaantuu näkyvässä spektrissä vasta sen jälkeen, kun entsyymin ja koentsyymin kanssa on yhdistetty tyydyttävät substraattimäärät.56-59

Adenosyylikobalamiinin CoC-sidoksen fotolyysi, termolyysi ja entsyymin edistämä homolyysi johtavat singlettiradikaalipariin, joka koostuu kob(II)alamiinista ja 5′-deoksiadenosyyliradikaalista.60,61 Koska kaikki nämä prosessit johtavat saman radikaaliparin muodostumiseen, fotolyysi-tutkimusten reaktiodynamiikasta saatavat tiedot voidaan liittää ehdotettuihin entsymaattisiin reaktiomekanismeihin. Adenosyylikobalamiinin fotohomolyysi alkaa elektronisella π → π*-promootiolla korriinirenkaassa, ja siihen täytyy sisältyä varauksensiirtotilan välitila matkalla CoC-sidoksen homolyysiin.60,61 Adenosyylikobalamiinin pikosekunnin fotolyysitutkimukset paljastavat geminaattiradikaaliparien rekombinaationopeuden olevan 109 s-1 ja häkin rekombinaatiotehokkuuden Fc olevan noin 94 %.42,62-64 Kobalamiinien nanosekunnin ja jatkuvan aallon fotolyysitutkimukset vahvistavat, että radikaaliparien rekombinaatio on tehokasta geminaattiradikaaliparien häkissä, ja että fotokemiallinen kvanttituotos on noin 20 % adenosyylikobalamiinille ja 35 % metyylikobalamiinille.65,66 Entsyymin puuttuessa suuri osa geminaattiradikaalipareista yhdistyy uudelleen ennen kuin tapahtuu merkittävää diffuusioerottelua. Vakauttaakseen 5′-deoksiadenosyyliradikaalin ja edistääkseen katalyysiä entsyymin on kasvatettava radikaaliparien erotusväliä todennäköisesti konformaatiomuutoksen kautta. Olipa mekanismi mikä tahansa, radikaaliparin suuri geminaattirekombinaationopeus edellyttää, että yksi entsyymin tehtävistä on erottaa radikaalit toisistaan tai vangita väliaikaisesti toinen radikaaleista ennenaikaisen rekombinaation estämiseksi.

Vaikka tuloksena syntyvillä singletti {5′-deoksiadenosyyliradikaali:kob(II)alamiini} -radikaalipareilla on identtiset elektroniset tilat,59-61,67 CoC-sidoksen entsymaattinen homolyysi ei pääse kiihottuneeseen elektroniseen tilaan, vaan se on aloitettava jollakin muulla prosessilla, jolla CoC-sidosta voidaan heikentää ja jolla voidaan siirtää tasapainoa kohti dissosiaatiota (ks. kohta 5.11.2). Jännityksen aiheuttama pilkkoutuminen ei johda ainoastaan CoC-sidoksen homolyysiin, vaan tämä prosessi kasvattaa myös radikaaliparin erotusväliä, jos osa vääristymästä tapahtuu apikaalisen kobolttiakselin suuntaisesti. Tämä CoC-sidoksen venyttäminen raa’alla voimalla saattaa olla tehokkain menetelmä, jolla saavutetaan sekä homolyysi että radikaaliparien rekombinaationopeuden nettovähenemä.

Ensiymin on myös mahdollista vahvistaa CoC-sidosta ja epäsuotuisasti homolyysiä puristamalla apikaalista Co-α-N-vuorovaikutusta. Adenosyylikobinamidianalogien + ja + termodynaamisia ominaisuuksia tutkittiin.68 +:ssa havaittiin vahvempi CoC-sidos ja lyhyempi CoN-sidoksen etäisyys verrattuna pyridiiniin α-aksiaalisena emäksenä. Vahvempi CoC-sidos johtaa merkittävään siirtymiseen kohti heterolyysiä ensisijaisena reittinä. Tässä mallisysteemissä tutkittavan entsyymin, metyylimalonyyli-CoA-mutaasin, on joko estettävä CoC-heterolyysi tai seurattava heterolyyttistä reittiä.68

Metioniinisyntaasissa kobalamiinin corrin-osa on 27 kDa:n pirstaleen kahden domeenin välissä, ja nukleotidihäntä tunkeutuu syvään taskuun, joka on muodostettu C-terminaalisen domeenin jäännösten muodostamasta taskuista.7,69,70 Tämä sekvenssi sisältää kohtalaisen hydrofobisen alueen, jota reunustavat pitkät hydrofiiliset segmentit.71 Rakenteellisia yhtäläisyyksiä odotetaan korriinirenkaan kanssa rajapinnassa olevien domeenien välillä. Metioniinisyntaasin ja metyylimalonyyli-CoA-mutaasin α/β-domeenin, joka sitoo korriinirenkaan alempaa puoliskoa ja ottaa vastaan metioniinisyntaasin ja metyylimalonyyli-CoA-mutaasin pidennetyn nukleotidihännän (fosfodiesteriosa ja 5,6-dimetyylibentsimidatsoliryhmä), odotetaan esiintyvän myös glutamaattimutaasissa (ks. alempana).