Alkalinen fosfataasi-isoentsyymi

Alkaalisen fosfataasin genomirakenne, proteiinikemia ja entsyymologia

ALP:tä (ortofosfori-monoesteri-fosfohydrolaasi, emäksinen optimi, EC 3.1.3.1) esiintyy kaikkialla luonnossa kasveissa ja eläimissä (McComb ym., 1979). Ihmisillä neljää ALP-isoentsyymiä koodaa neljä erillistä geeniä (Millán, 1988, 2006; Harris, 1990; Moss, 1992). Kolmella näistä isoentsyymeistä on olennaisesti kudosspesifinen ilmentymä, ja ne on nimetty suoliston, istukan ja sukusolujen (istukan kaltainen) ALP:ksi. Neljäs ALP-isoentsyymi ilmentyy ubiikkisesti, ja siksi sitä kutsutaan TNSALP:ksi (Stigbrand ja Fishman, 1984; Harris, 1990; Moss, 1992). Luusto-, maksa- ja munuaiskudoksessa on erityisen runsaasti TNSALP:tä. Ihmisen luusta, maksasta ja munuaisista puhdistettujen ALP:ien erilaiset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet (lämpöstabiilisuus, elektroforeettinen liikkuvuus jne.) häviävät, kun ne altistuvat glykosidaaseille (Moss ja Whitaker, 1985), ja TNSALP on näin ollen ”toissijaisten” isoentsyymien perhe (kutsun niitä nimellä ”isomuodot”). Niitä koodaa sama geeni, niillä on identtinen polypeptidisekvenssi, ja ne eroavat toisistaan vain hiilihydraatteja sisältävien posttranslationaalisten modifikaatioiden perusteella (Harris, 1980).

TNSALP:n geenikarttasymboli on ALPL (”ALP-liver”), vaikka TNSALP:n maksan isoformin toimintaa ei tunneta (ks. myöhemmin). ALPL sijaitsee lähellä kromosomin 1 lyhyen varren kärkeä (1p36.1-p34), kun taas suoliston, istukan ja sukusolujen ALP:ien geenit sijaitsevat kromosomin 2 pitkän varren kärjessä (2q34-q37) (Harris, 1990; Millán, 2006). ALPL näyttää edustavan esi-isägeeniä, kun taas kudospesifiset ALP:t ovat todennäköisesti muodostuneet geeniduplikaation kautta (Harris, 1990). ALPL on hieman yli 50 kb:n kokoinen, ja se sisältää 12 eksonia, joista 11 translatoidaan 507 aminohappojäännöksestä koostuvan kypsän entsyymin muodostamiseksi (Weiss ym., 1988b). TATA- ja Sp1-sekvenssit voivat olla sääteleviä elementtejä, mutta perusekspressio näyttää heijastavan ”taloutta ylläpitäviä” promoottorivaikutuksia, kun taas eri kudoksissa tapahtuva erilainen ekspressio voi johtua posttranskriptiomekanismista (Kiledjian ja Kadesch, 1990). ALPL:llä on kaksi promoottoria ja kaksi vastaavaa 5′-koodaamatonta eksonia, 1a ja 1b. Niiden ilmentyminen johtaa kahteen eri mRNA:han, joilla on erilaiset 5′-kääntämättömät alueet (Nosjean ym., 1997). Transkriptio tapahtuu ensisijaisesti ylävirran promoottorista (1a) osteoblasteissa ja alavirran promoottorista (1b) maksassa ja munuaisissa (Millán, 2006).

Kudosspesifiset ALP-geenit ovat pienempiä kuin ALPL, mikä johtuu pääasiassa lyhyemmistä introneista. Niiden cDNA:ista johdetut aminohapposekvenssit viittaavat 87 %:n positioidentiteettiin istukan ja suolen ALP:n välillä, mutta vain 50-60 %:n identiteettiin kudosspesifisten ALP:ien ja TNSALP:n välillä (Harris, 1990).

TNSALP:n aminohappojäämäsekvenssi viittaa viiteen potentiaaliseen N-sidoksiseen glykosylaatiokohtaan (Weiss ym., 1988). N-glykosylaatio on välttämätöntä katalyyttiselle aktiivisuudelle. O-glykosylaatio on ominaista luun mutta ei maksan isomuodolle (Nosjean ym., 1997).

Vuonna 2000 ihmisen istukan ALP:n kiderakenne hahmoteltiin 1,8 Å:n resoluutiolla (Le Due ym., 2000). TNSALP:n aktiivinen alue johtuisi nukleotidisekvenssistä, joka on konservoitunut ALP:issä kaikkialla luonnossa (Henthorn ja Whyte, 1992), heijastaisi kuutta eksonia ja koostuisi 15 aminohappojäännöksestä (Zurutuza ym., 1999).

ALP:t ovat Zn++-metallialkoentsyymejä (McComb ym., 1979). Katalyyttinen aktiivisuus edellyttää identtisten alayksiköiden multimeeristä konfiguraatiota, jossa kullakin monomeerillä on yksi aktiivinen alue ja kaksi Zn++-atomia, jotka stabiloivat tertiäärirakennetta (Kim ja Wycoff, 1991).

ALP:ia pidetään verenkierrossa yleensä homodimeerisinä (McComb ym., 1979). TNSALP:llä on symmetrisessä dimeerimuodossaan αβ-topologia kummallakin alayksiköllä, mukaan lukien kymmensäikeinen β-arkki sen keskellä (Hoylaerts ja Millán, 1991). Kudoksissa ALP:t ovat kuitenkin kiinnittyneinä (ks. myöhemmin) solujen pinnoille, ehkä homotetrameereina (Fedde ym., 1988).

In vitro ALP:illä on laaja substraattispesifisyys ja pH-optimi, joka riippuu katalyysin kohteena olevan fosforiyhdisteen tyypistä ja konsentraatiosta (McComb ym., 1979). Katalyyttinen aktiivisuus edellyttää Mg++:aa kofaktorina (McComb et al., 1979). PPi:tä sekä fosforiestereitä voidaan hydrolysoida (Xu et al., 1991). Reaktioon kuuluu seriinijäännöksen fosforylaatio-defosforylaatio. Kovalenttisesti sidotun piin dissosiaatio näyttää olevan nopeutta rajoittava vaihe. Pi on itse asiassa voimakas kilpailullinen ALP:n estäjä (McComb et al., 1979; Kim ja Wyckoff, 1991; Coburn et al., 1998). Voi kuitenkin myös olla, että Pi stabiloi entsyymiä (Farley, 1991).

ALP:n biosynteesistä korkeammissa organismeissa on edelleen epäselvyyksiä. Ihmisen ALP-isoentsyymien geenisekvenssit osoittavat, että syntyvillä polypeptideillä on lyhyt, 17-21 aminohappojäännöstä käsittävä signaalisekvenssi (Harris, 1990) ja hydrofobinen domeeni niiden karboksyyliterminaalissa (Weiss ym., 1988b). ALP:ien solunsisäiseen hajoamiseen voivat osallistua proteasomit (Cai ym., 1998). Nämä ALP:t kiinnittyvät kuitenkin plasmakalvojen ulkopinnalle kiinnittyneinä fosfatidylinositoli-glykaanin polaariseen pääryhmään (Whyte ym., 1988; Whyte, 1994), ja fosfatidylinositoli-spesifinen fosfolipaasi voi vapauttaa ne (Fedde ym., 1988). Niiden tarkka vuorovaikutus fosfatidylinositolin kanssa voi kuitenkin vaihdella ALP:n isoentsyymien välillä (Seetharam ym., 1987).

Lipidivapaa ALP on osa, jota tavallisesti esiintyy verenkierrossa. ALP:n vapautumisen mekanismeja solupinnoilta ei kuitenkaan tunneta. Prosessiin voi liittyä C- tai D-tyypin fosfatidaasi, detergenttien vaikutus, proteolyysi, kalvojen fraktioituminen tai lipolyysi (Alpers ym., 1990).

Terveillä miehillä ja naisilla lähes kaikki ALP-aktiivisuus seerumissa tai plasmassa on peräisin suunnilleen yhtä suurista määristä TNSALP:n luun ja maksan isomuotoja (Millán ym., 1980). Imeväisillä ja lapsilla, erityisesti vastasyntyneillä ja nuorilla, on verenkierrossa korkeammat luun isoformin pitoisuudet (McComb ym., 1979). Joillakin henkilöillä, joilla on B- ja O-veriryhmät ja jotka ovat ”sekretoijia”, verenkierrossa oleva pieni määrä suoliston ALP:tä lisääntyy rasvaisen aterian nauttimisen jälkeen (Langman ym., 1966; McComb ym., 1979). Tyypillisesti suoliston ALP:n osuus seerumin ALP:n kokonaisaktiivisuudesta on kuitenkin vain muutama prosentti (enintään 20 %) (McComb ym., 1979; Mulivor ym., 1985). Istukan ALP ilmentyy ja kiertää yleensä vain raskauden viimeisen kolmanneksen aikana (Birkett ym., 1966). Erilaiset syövät kuitenkin vapauttavat istukan tai sukusolujen (”istukan kaltaista”) ALP:tä (Millán, 1988) verenkiertoon. Verenkierrossa olevan ALP:n, kuten monien muidenkin glykoproteiinien, puhdistumiseen liittyy todennäköisesti imeytyminen ja hajoaminen maksassa (Young ym., 1984).