Regulación de la síntesis de colesterol

00:00:08.12Mi nombre es Russell DeBose-Boyd,
00:00:10.03y soy del Departamento de Genética Molecular
00:00:12.01en la Universidad de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Texas.
00:00:15.17En esta presentación,
00:00:17.19hablaré de la regulación por retroalimentación de la HMG CoA reductasa,
00:00:20.27que es la enzima limitante de la tasa en la síntesis de colesterol.
00:00:25.06Así, esta diapositiva muestra la estructura del colesterol
00:00:27.06y algunas de las características de esta importante molécula.
00:00:31.01El colesterol es un esterol,
00:00:33.10que se distingue por esta estructura de cuatro anillos.
00:00:36.00Esta estructura de cuatro anillos imparte rigidez a esta molécula,
00:00:39.02que hace que sea un componente ideal de las membranas celulares.
00:00:43.18Ahora, debido a que el colesterol tiene un gran número
00:00:46.07de enlaces carbono-carbono y carbono-hidrógeno,
00:00:49.02esta molécula es prácticamente insoluble en agua.
00:00:52.07Así que, debido a esta razón,
00:00:54.13las células deben ser capaces de mantener el colesterol en un rango estrecho,
00:00:58.03de manera que se produzca suficiente colesterol para las necesidades celulares de la molécula
00:01:02.13pero evitando la sobreacumulación tóxica de colesterol.
00:01:06.16La sobreacumulación de colesterol puede ser tóxica a nivel celular.
00:01:12.11Ahora, esta diapositiva muestra algunas de las funciones esenciales del colesterol.
00:01:15.10El colesterol es absolutamente necesario para la vida.
00:01:17.26Como he mencionado antes,
00:01:19.27Una de las funciones más reconocidas para el colesterol
00:01:22.26es su papel en las membranas celulares,
00:01:25.08donde mantiene la fluidez óptima de la membrana.
00:01:29.00Ahora, el colesterol resulta ser un precursor importante
00:01:32.01para moléculas muy importantes como las hormonas esteroides,
00:01:34.25que ayudan a distinguir entre niñas y niños;
00:01:38.19los ácidos biliares, que ayudan a la digestión y a la nutrición solubilizando las grasas alimentarias y las vitaminas liposolubles;
00:01:47.10y, por último, el colesterol es abundante en el cerebro,
00:01:50.18donde se encuentra en las vainas de mielina que rodean los axones
00:01:53.17y ayudan en la sinap… transmisiones sinápticas.
00:01:58.18Ahora bien, las células de nuestro cuerpo — mamíferos… células de mamíferos —
00:02:02.01adquieren el colesterol a través de dos fuentes.
00:02:04.21Una de las fuentes se ilustra en esta diapositiva,
00:02:07.06y que es a través de la síntesis de colesterol
00:02:09.19del precursor acetil CoA.
00:02:13.00Ahora, la conversión de acetil CoA a colesterol
00:02:15.21ocurre a través de la acción de más de 20 enzimas.
00:02:20.22Ahora, como se puede imaginar,
00:02:22.21la síntesis de colesterol implica la producción de varios intermedios,
00:02:26.16y estos intermedios mismos
00:02:29.14también pueden convertirse en productos finales muy importantes.
00:02:33.11Por ejemplo, este compuesto, el pirofosfato de farnesilo,
00:02:36.29es un precursor de un importante compuesto llamado dolicol,
00:02:40.25que participa en la glicosilación ligada al N.
00:02:43.26También es un precursor del hemo y las ubiquinonas,
00:02:46.10que participan en la respiración celular;
00:02:49.26vitamina K, que participa en la coagulación de la sangre;
00:02:53.12y, por último, este pirofosfato de farnesilo y pirofosfato de geranilo
00:02:58.06se unen a muchas proteínas de señalización,
00:03:01.16las pequeñas proteínas GTP,
00:03:03.22dirigiéndolas a las membranas,
00:03:06.12y esta modificación es absolutamente necesaria para el funcionamiento normal de la célula.
00:03:13.04Ahora, esta diapositiva muestra que la síntesis de colesterol
00:03:16.02ocurre en varios tejidos a diferentes ritmos.
00:03:19.29Ahora, el hígado y las glándulas suprarrenales
00:03:23.14sintetizan la mayor cantidad de colesterol en nuestro cuerpo.
00:03:25.10Y debo señalar que esto se hizo en realidad en los ratones,
00:03:28.06pero efectos similares se observan en los seres humanos
00:03:31.07y otros primates.
00:03:33.19El hígado… el hígado sintetiza grandes cantidades de colesterol
00:03:36.24para producir principalmente lipoproteínas
00:03:39.14y también para la síntesis de ácidos biliares.
00:03:42.10Las glándulas suprarrenales producen colesterol
00:03:45.28principalmente para la síntesis de hormonas esteroides,
00:03:48.13mientras que el intestino sintetiza colesterol para…
00:03:51.27la división celular.
00:03:54.12Un gran número de células del intestino se desprenden cada día
00:03:57.12y debe ser reemplazado por nuevas células,
00:03:59.27lo que requiere una marcada cantidad de síntesis de colesterol.
00:04:03.28También debo señalar que el intestino es también una fuente de producción de lipoproteínas.
00:04:09.21Ahora, la segunda fuente de colesterol
00:04:12.12es en realidad de las lipoproteínas
00:04:15.16que son producidas por el hígado y el intestino.
00:04:18.06Así, se muestra aquí es un modelo de la lipoproteína de baja densidad.
00:04:23.02Este es el principal portador de colesterol en el plasma humano.
00:04:28.02Así, la lipoproteína de baja densidad, o LDL,
00:04:31.14consiste en un núcleo que se compone de colesterol libre.
00:04:36.19Así, el colesterol hidrofóbico forma el núcleo de la partícula LDL.
00:04:41.19Ahora, este colesterol hidrofóbico
00:04:44.01está rodeado por una cáscara que se compone de un fosfolípido
00:04:47.02con varias cantidades de colesterol esterificado
00:04:51.13–esto es colesterol al que se le ha unido un ácido graso–
00:04:55.14que está intercalado en la cáscara de fosfolípidos.
00:04:59.03Ahora bien, toda esta partícula de LDL
00:05:02.18está rodeada por una proteína llamada apolipoproteína B.
00:05:08.02Así, esta diapositiva representa realmente
00:05:10.17cómo las células adquieren el colesterol de estas dos fuentes:
00:05:13.13síntesis endógena y de LDL.
00:05:18.19Así, los receptores de LDL
00:05:21.09–están en la superficie de las células —
00:05:23.20se unen a las LDL interactuando con esta partícula de apolipoproteína B
00:05:29.12que rodea la cáscara de la lipoproteína.
00:05:32.25Una vez que la partícula de LDL se une al receptor de LDL,
00:05:35.27todo el complejo se internaliza en fosas recubiertas.
00:05:40.06Y estas fosas recubiertas se dirigen a los lisosomas,
00:05:43.07donde la partícula de LDL se degrada y el colesterol
00:05:47.15– colesterol libre —
00:05:49.25es ahora liberado y proporcionado a la célula para diversos usos.
00:05:54.18Así que, de nuevo, estas dos fuentes de colesterol celular
00:05:58.03– ya sea desde el receptor… LDL mediada por el receptor de LDL,
00:06:03.07o a través de la síntesis endógena —
00:06:06.02pueden ser utilizados indistintamente.
00:06:09.01Así que, por ejemplo, si LDL se convierte en limitante,
00:06:12.00la célula cambia a la síntesis endógena para sus fuentes de colesterol.
00:06:18.02Y si la síntesis endógena se bloquea,
00:06:20.05entonces las células pueden ahora utilizar LDL exógena
00:06:23.01para su fuente de colesterol.
00:06:27.00Así, hemos hablado de la función esencial del colesterol.
00:06:30.10Es importante en las membranas celulares.
00:06:32.11Es un importante precursor de las hormonas esteroides
00:06:34.28y de los ácidos biliares.
00:06:36.16Sin embargo, hay un lado malo del colesterol,
00:06:38.13y que se ilustra en esta diapositiva.
00:06:41.00Desde hace varios años, los niveles elevados de colesterol LDL en sangre
00:06:46.14se asocian a un riesgo de enfermedad coronaria
00:06:49.19y de infarto de miocardio.
00:06:51.16Así, aquí se muestra que
00:06:54.27el nivel de colesterol en la sangre
00:06:57.26se correlaciona literalmente con el riesgo de enfermedad coronaria.
00:07:01.09Y esto se debe a que el colesterol elevado
00:07:04.21puede depositarse realmente en las arterias que conducen… al corazón.
00:07:08.12Y con el tiempo, esta deposición
00:07:11.15resulta en una enfermedad llamada aterosclerosis,
00:07:13.09en la que esta deposición de colesterol
00:07:15.04puede conducir a la producción de placas
00:07:17.12que en última instancia puede bloquear el flujo de sangre al corazón,
00:07:19.18creando así un ataque al corazón.
00:07:23.06Ahora bien, uno de los fármacos más recetados
00:07:28.16para reducir el colesterol LDL
00:07:31.11es un grupo de medicamentos llamados estatinas.
00:07:33.03Aquí se muestra la estructura central típica de las estatinas
00:07:37.26y algunas de las diversas formas de estatinas
00:07:41.29que se han utilizado en la clínica.
00:07:44.22A lo largo de los años, las estatinas
00:07:47.12se han convertido en uno de los… los medicamentos más vendidos…
00:07:49.10en los Estados Unidos
00:07:51.20por su capacidad para reducir el colesterol LDL en sangre.
00:07:57.19Así pues, en este experimento se muestra un resumen de al menos cuatro estudios
00:08:02.23que revelan que las estatinas reducen efectivamente el colesterol LDL
00:08:06.06y esa reducción conduce a una menor incidencia
00:08:10.04de la enfermedad coronaria.
00:08:12.11Así pues, lo que se muestra aquí en los círculos cerrados son ensayos clínicos
00:08:15.11en el que los pacientes fueron tratados con una estatina, que se muestra en el … se muestra en los círculos cerrados,
00:08:20.22o un placebo.
00:08:22.11Y en cada uno de estos estudios, el tratamiento con estatinas llevó a
00:08:25.17una caída en los niveles de colesterol LDL,
00:08:28.06y este descenso de los niveles de colesterol LDL
00:08:31.19 condujo a una reducción de los episodios coronarios, es decir, de los infartos de miocardio.
00:08:35.13Entonces, la pregunta es: ¿cómo funcionan las estatinas?
00:08:38.21¿Y qué hacen las estatinas?
00:08:40.28Entonces, primero respondimos, ¿qué hacen las estatinas?
00:08:43.16Entonces, las estatinas inhiben la enzima HMG CoA reductasa.
00:08:47.05La HMG CoA reductasa cataliza
00:08:50.20el paso que limita la tasa de síntesis del colesterol.
00:08:53.28De hecho, es el cuarto paso en la vía de síntesis del colesterol.
00:08:58.06Así, las estatinas inhiben competitivamente la HMG CoA reductasa
00:09:01.20al imitar el producto de la reacción de la reductasa,
00:09:05.13mevalonato.
00:09:07.20Así, esta inhibición competitiva de la reductasa
00:09:10.19sustenta la capacidad de las estatinas para reducir el colesterol LDL en la sangre.
00:09:18.07¿Cómo actúan las estatinas?
00:09:20.17De nuevo, al inhibir competitivamente la HMG CoA reductasa,
00:09:24.01esto conduce a una caída en las cantidades de mevalonato
00:09:27.09y, por supuesto, una caída en el colesterol.
00:09:30.18Esta disminución del colesterol conduce a un aumento
00:09:33.12en la transcripción del gen
00:09:36.06que codifica el receptor de LDL.
00:09:37.25Y como resultado, el número de receptores de LDL en la superficie…
00:09:41.14especialmente de las células del hígado,
00:09:43.15y este aumento de los receptores de LDL conduce
00:09:48.01a una mayor o mejor captación de LDL en sangre.
00:09:52.25Y esa reducción de las LDL en sangre
00:09:55.26es la responsable de la disminución de la enfermedad coronaria
00:09:58.20en los pacientes tratados con estatinas.
00:10:02.12Sin embargo, los efectos clínicos de las estatinas
00:10:05.26son en realidad atenuados por
00:10:09.06el aumento compensatorio de la HMG CoA reductasa
00:10:11.10que acompaña a la terapia con estatinas.
00:10:13.19Y eso se ilustra en esta diapositiva.
00:10:15.13Esta es una inmunoblot de la proteína HMG CoA reductasa
00:10:19.03en los hígados de ratones que han sido alimentados con una estatina,
00:10:22.17o incluso en células cultivadas
00:10:25.00que han sido tratadas con estatinas in vitro.
00:10:26.24Y como se puede ver,
00:10:28.20el tratamiento con estatinas provoca una marcada acumulación
00:10:31.09de HMG CoA reductasa.
00:10:33.10Y esta acumulación, como mencioné antes,
00:10:35.24disminuye los efectos clínicos de las estatinas.
00:10:38.12Entonces, nuestra siguiente pregunta es, ¿por qué las estatinas provocan
00:10:41.27que la HMG CoA reductasa se acumule a un nivel tan alto?
00:10:44.14Que debo señalar que se ha estimado que es
00:10:47.02al menos 200 veces.
00:10:49.29Así, normalmente la HMG CoA reductasa
00:10:51.25está sujeta a una enorme cantidad de regulación de retroalimentación.
00:10:55.02Y esta regulación de retroalimentación está mediada en parte
00:10:57.29por los esteroles.
00:11:00.02Ahora bien, el tratamiento con estatinas, como he mencionado antes,
00:11:02.05bloquea la actividad de la HMG CoA reductasa,
00:11:04.12e impide la síntesis de estas moléculas de esterol.
00:11:07.29Y, por supuesto, esa prevención de la síntesis de esteroles
00:11:10.26es en realidad la responsable de la regulación al alza de los receptores de LDL
00:11:14.17y de la consiguiente reducción del colesterol LDL.
00:11:18.09Sin embargo, debido a que las estatinas
00:11:21.03bloquean la síntesis de esteroles,
00:11:22.18se interrumpe la regulación por retroalimentación de la reductasa.
00:11:25.14Y como resultado, se producen tres acontecimientos.
00:11:27.28En primer lugar, debido a esta reducción del colesterol
00:11:31.09y otros productos de la vía de síntesis del colesterol,
00:11:35.08se produce un aumento de la transcripción del gen de la reductasa,
00:11:39.07se produce un aumento de la traducción
00:11:41.28del ARNm de la reductasa,
00:11:43.17y luego, finalmente, hay una mayor estabilidad
00:11:45.24de la proteína reductasa.
00:11:47.13Así, estos tres eventos son responsables
00:11:49.19de ese marcado aumento de la proteína reductasa
00:11:52.03que les mostré en la diapositiva anterior.
00:11:55.18Así que, a lo largo de los años,
00:11:57.06mi laboratorio se ha interesado en intentar comprender
00:11:59.27los mecanismos moleculares que subyacen
00:12:02.22a esta estabilidad mejorada de la proteína,
00:12:04.09y que será el tema del resto de esta presentación.
00:12:09.16Así, esta diapositiva ilustra que los esteroles
00:12:13.08de hecho aceleran la degradación
00:12:15.26de la HMG CoA reductasa.
00:12:17.14Así, en este experimento,
00:12:19.11utilizamos el clásico análisis de pulsos
00:12:20.29para monitorizar la estabilidad de la reductasa en células
00:12:23.16que han sido tratadas en ausencia o presencia de esteroles.
00:12:26.00Entonces, lo que hacemos aquí es etiquetar típicamente las células con radiactividad,
00:12:29.27un pequeño subconjunto de moléculas de HMG CoA reductasa.
00:12:33.25Luego retiramos esa radiactividad,
00:12:35.25y seguimos la pres…
00:12:37.25estabilidad de la proteína reductasa
00:12:39.26en ausencia o presencia de esteroles.
00:12:44.10Y como se puede ver aquí,
00:12:46.08cuando las células se persiguen en medios
00:12:49.07que no contienen radiactividad,
00:12:51.01en ausencia de esteroles
00:12:52.28la reductasa es bastante estable en el tiempo.
00:12:55.16Sin embargo, como se puede ver,
00:12:57.21la adición de esteroles en el medio de persecución
00:12:59.26hace que los niveles de reductasa disminuyan notablemente.
00:13:02.20De nuevo, esto es indicativo de la degradación acelerada por los esteroles
00:13:06.04de la HMG CoA reductasa.
00:13:09.16Ahora, para entender los mecanismos moleculares
00:13:11.22para esta degradación de la reductasa inducida por esteroles,
00:13:14.15tenemos que entender la estructura de la proteína HMG CoA reductasa.
00:13:18.05Y la estructura del dominio de la reductasa
00:13:20.14se ilustra en esta diapositiva.
00:13:22.18Así, la HMG CoA reductasa
00:13:24.16consiste en dos dominios distintos.
00:13:26.28Tiene un dominio N-terminal
00:13:29.06que ancla la proteína en las membranas del retículo endoplásmico,
00:13:32.14o el ER.
00:13:35.00Ahora, este dominio N-terminal,
00:13:36.29al que nos referimos como el dominio de membrana,
00:13:39.04contiene ocho regiones que abarcan la membrana.
00:13:42.05Y es seguido por el segundo dominio de la HMG CoA reductasa,
00:13:45.07que llamamos el dominio catalítico.
00:13:47.24Así, el dominio catalítico sobresale en el citosol de las células
00:13:51.24y contiene toda la actividad enzimática de la HMG CoA reductasa.
00:13:56.03De hecho, una versión truncada de la reductasa
00:13:59.29que sólo contiene el dominio catalítico
00:14:02.13puede rescatar completamente la síntesis de mevalonato
00:14:06.28en células que carecen de HMG CoA reductasa.
00:14:10.13Así pues, el dominio catalítico es a la vez necesario y suficiente
00:14:13.01para la síntesis de mevalonato.
00:14:15.29Luego se plantea la pregunta,
00:14:17.28¿por qué esta proteína está unida a la membrana?
00:14:19.26Y resulta que la reductasa
00:14:22.02es en realidad una proteína unida a la membrana ya en la levadura.
00:14:25.18Así, la función del dominio de membrana de la reductasa
00:14:28.26se ilustró en este primer experimento
00:14:31.27en el que se comparó la estabilidad del dominio catalítico
00:14:35.08–que, recordemos, contiene toda la actividad enzimática–
00:14:37.26con la enzima de longitud completa.
00:14:40.20Y, de nuevo, se utilizó un sencillo análisis de pulso-caza
00:14:42.21para controlar la estabilidad de estas dos proteínas.
00:14:47.13Como se puede ver en el panel de la izquierda,
00:14:49.03el dominio catalítico truncado produce
00:14:53.14una proteína muy estable que… importantemente,
00:14:57.08su degradación no está influenciada por los esteroles.
00:14:59.20En cambio, la proteína de longitud completa –que, de nuevo, contiene el dominio de membrana–
00:15:03.07es menos estable, incluso en ausencia de esteroles.
00:15:06.13Y se puede ver que los esteroles aceleran notablemente
00:15:09.25la degradación de la HMG CoA reductasa,
00:15:12.09lo que indica que el dominio de membrana…
00:15:15.12la función del dominio de membrana
00:15:17.25es para esta degradación acelerada por el esterol o inducida por el esterol.
00:15:22.08Así pues, lo que indicaban los estudios anteriores
00:15:25.12es que el dominio de membrana de la reductasa
00:15:28.03es necesario y suficiente para la degradación acelerada por esteroles,
00:15:30.25y sugirieron que el dominio de membrana,
00:15:33.16ya sea directa o indirectamente,
00:15:35.16puede detectar los niveles intracelulares de esteroles.
00:15:38.00Y la detección da lugar, tal vez,
00:15:41.02un cambio conformacional en el dominio de membrana de la reductasa
00:15:43.29que hace que la proteína sea susceptible de degradación rápida.
00:15:48.14Y, por supuesto, dado que las estatinas bloquean la síntesis de colesterol,
00:15:52.01las estatinas bloquean efectivamente esto
00:15:54.22que llamamos degradación asociada al RE -o ERAD-
00:15:57.08de la HMG CoA reductasa.
00:16:02.23Así, un avance clave en nuestra comprensión
00:16:04.23de la ERAD de la HMG CoA reductasa
00:16:06.15se produjo con el descubrimiento de un par de proteínas
00:16:08.28– proteínas de la membrana del RE —
00:16:10.23llamadas Insig-1 e Insig-2.
00:16:14.15Estas proteínas Insig, a efectos de esta charla,
00:16:16.27son muy redundantes.
00:16:18.14Realizan funciones redundantes en la degradación, o ERAD,
00:16:22.06de la HMG CoA reductasa.
00:16:24.00Son idénticas… son idénticas en un 85% aproximadamente,
00:16:26.23y son proteínas altamente hidrofóbicas.
00:16:29.24Ahora, el papel de Insigs en la ERAD de la HMG CoA reductasa
00:16:34.28fue ilustrado por primera vez en este experimento.
00:16:37.19Así que, aquí también utilizamos el análisis de pulso-caso
00:16:40.15para medir la degradación acelerada por esteroles
00:16:43.29de la reductasa en células
00:16:47.02que fueron transfectadas con moléculas de control,
00:16:51.06llamadas siRNAs,
00:16:53.05o células que fueron transfectadas con siRNAs
00:16:55.26que conducirían al derribo de la expresión
00:16:58.13tanto de Insig-1 como de Insig-2.
00:17:02.07Y como se puede ver en el panel de la izquierda,
00:17:04.13en las células transfectadas con los ARNsi de control,
00:17:08.04los esteroles aceleran notablemente la degradación
00:17:12.07de la HMG CoA reductasa.
00:17:14.13Así, los círculos abiertos son experimentos realizados en ausencia,
00:17:17.09y los círculos cerrados son experimentos realizados
00:17:20.15en presencia de esteroles.
00:17:22.12Y lo que se puede ver fácilmente es que el knockdown de Insig-1 e Insig-2
00:17:26.23suprime completamente la degradación acelerada por esteroles,
00:17:30.02indicando que estas proteínas
00:17:32.28Jugar un papel clave en el proceso.
00:17:35.27Así, nuestra siguiente pregunta es,
00:17:38.02¿Cuál es el mecanismo
00:17:39.26por el que los Insigs aceleran la ERAD de la HMG CoA reductasa?
00:17:47.09Entonces, este experimento…
00:17:48.21esta diapositiva muestra que los inhibidores del proteasoma, el proteasoma 26S,
00:17:53.21bloquean la degradación de la HMG CoA reductasa inducida por esteroles.
00:17:57.15Así que, como se puede ver en este experimento…
00:18:00.18en los dos primeros carriles, los esteroles hicieron que la reductasa se degradara notablemente,
00:18:04.17y esta degradación se bloquea completamente
00:18:06.19cuando estas células se tratan con el inhibidor del proteasoma.
00:18:12.03Así que, con… esto nos permite crear otro modelo
00:18:15.27en el que, de nuevo, el dominio de membrana de la reductasa
00:18:18.25directa o indirectamente
00:18:21.22siente los niveles de esteroles intracelulares,
00:18:24.15es lo que hace que la reductasa se una a Insigs,
00:18:28.12y que la unión de Insigs conduzca a reacciones que hacen que la reductasa
00:18:32.06sea ahora degradada por el proteasoma 26S.
00:18:37.22Ahora bien, se sabe que la mayoría de los sustratos de los proteasomas
00:18:41.00requieren su ubiquitinación previa.
00:18:44.05La ubiquitinación es un proceso por el que
00:18:46.23la pequeña proteína ubiquitina se une covalentemente
00:18:50.16a las moléculas de sustrato.
00:18:52.08Y una vez que una cadena de ubiquitinas
00:18:54.16se une a los sustratos,
00:18:56.08se convierte en reconocido por los proteasomas para la degradación.
00:19:00.25Ahora, esto se llama polyubiquitination,
00:19:02.25y polyubiquitination de proteínas
00:19:05.14requiere la acción de al menos tres tipos diferentes de enzimas.
00:19:07.29Eso se ilustra en esta diapositiva.
00:19:11.09En el primer paso,
00:19:13.15la ubiquitina se activa
00:19:15.20de manera dependiente del ATP por una enzima llamada E1,
00:19:19.11o proteína activadora de la ubiquitina.
00:19:22.15En el siguiente paso, la ubiquitina se transfiere de la E1…
00:19:27.13a otra enzima llamada E2, o enzima conjugadora de ubiquitina.
00:19:32.16En el último paso, la E2 se combina con una E3,
00:19:36.24o ubiquitina ligasa,
00:19:39.08que a su vez se asocia con el sustrato,
00:19:42.09que se muestra aquí en verde.
00:19:44.11Lo que hace la E3 es facilitar la transferencia de ubiquitina
00:19:47.27desde la enzima conjugadora de ubiquitina
00:19:50.00a un residuo de lisina en la proteína sustrato,
00:19:53.08generando un sustrato ubiquitinado.
00:19:57.28Ahora, este proceso ocurre muchas veces,
00:20:00.02hasta que se construye una cadena de ubiquitina sobre la proteína sustrato.
00:20:06.02Que ahora puede ser reconocida por los proteasomas para su degradación.
00:20:10.18Así que, teniendo en cuenta que estas proteínas Insig
00:20:12.26se requieren para la degradación de la reductasa,
00:20:15.08y que la reductasa realmente es degradada por los proteasomas,
00:20:19.02nuestra siguiente pregunta es, ¿se ubiquitina la reductasa?
00:20:23.20Esa pregunta se respondió en este experimento
00:20:26.11que se muestra en esta diapositiva.
00:20:28.21Entonces, lo que hemos hecho en este experimento es que hemos tratado las células
00:20:31.15en ausencia y presencia de esteroles
00:20:33.20y el inhibidor del proteasoma.
00:20:37.05Después de estos tratamientos,
00:20:39.11inmunoprecipitamos la reductasa
00:20:41.21y luego sondear esos inmunoprecipitados para la reductasa total,
00:20:43.20que se muestra en el panel inferior,
00:20:45.18o la reductasa ubiquitinada.
00:20:49.07Así que, como se puede ver en el primer carril,
00:20:51.01aunque la reductasa se tira hacia abajo en estos experimentos,
00:20:55.11no vemos ninguna reactividad con la ubiquitinación.
00:20:58.14Sin embargo, los esteroles hacen que la reductasa se ubiquitine.
00:21:03.09Y esta ubiquitinación aumenta notablemente
00:21:07.22si también incluimos inhibidores del proteasoma.
00:21:09.27Así pues, lo que esto nos indica es que los esteroles
00:21:12.16hacen que la reductasa se ubiquitine,
00:21:14.20y esta proteína ubiquitinada es ahora degradada por los proteasomas,
00:21:17.18como lo indica la estabilidad de la ubiquitinated reductase
00:21:21.21por estos inhibidores del proteasoma.
00:21:24.27Nuestra siguiente pregunta es,
00:21:27.07¿Son los Insigs necesarios para esta ubiquitinación de la reductasa inducida por esteroles?
00:21:32.16Y de nuevo, recurrimos a los siRNAs.
00:21:35.08Las células se transfectaron bien con el siRNA de control
00:21:38.18o siRNAs contra Insig-1 y -2.
00:21:41.03A continuación, tratamos estas células en ausencia o presencia de esteroles,
00:21:43.20y luego sondeamos la reductasa ubiquitinada.
00:21:47.16Y como se puede ver en los dos primeros carriles,
00:21:49.10la reductasa está muy bien ubiquitinada en presencia de esteroles,
00:21:52.08y la eliminación de Insig-1 e Insig-2
00:21:56.02 suprime completamente esta ubiquitinación.
00:22:01.01Así pues, eso nos permite ahora llenar más lagunas en nuestro modelo
00:22:04.07 para la ERAD mediada por Insig de la HMG CoA reductasa.
00:22:09.14Ahora, resulta que un subconjunto de moléculas Insig
00:22:12.00se asocia realmente con un complejo de ubiquitina ligasa E3/E2.
00:22:16.27Además, en presencia de esteroles,
00:22:20.15el dominio de membrana de la reductasa
00:22:23.03siente el esterol,
00:22:24.25y esta detección hace que la reductasa se una a Insigs,
00:22:27.28y por supuesto estos Insigs
00:22:31.13pueden establecer un puente entre la reductasa y el complejo de ubiquitina ligasa E3/E2.
00:22:36.26Este puente da lugar a la ubiquitinación de la reductasa
00:22:40.00en dos residuos de lisina en el dominio de membrana.
00:22:43.17Y esta ubiquitinación hace que la reductasa
00:22:46.17sea retirada de la membrana del RE
00:22:50.09y posteriormente degradada por los proteasomas,
00:22:52.22a través de un proceso que no estamos completamente…
00:22:55.07a través de un proceso que no se entiende completamente.
00:23:00.20Así que, en resumen, he dicho hoy
00:23:03.16que la HMG CoA reductasa es la enzima que limita la tasa
00:23:06.07en la vía de síntesis del colesterol,
00:23:08.01y es un objetivo de estos fármacos de estatinas que reducen el colesterol.
00:23:11.26La reductasa se controla a través de un muy complejo
00:23:15.16sistema de regulación de retroalimentación
00:23:18.01que está mediada por el colesterol y otros tipos de esteroles.
00:23:20.18Y que las estatinas interrumpen este sistema de regulación de retroalimentación,
00:23:24.03en parte mediante el bloqueo de esta ubiquitinación mediada por Insig
00:23:27.10y ERAD de la HMG CoA reductasa.