Propiedades fisicoquímicas de nanoemulsiones a base de lecitina obtenidas por emulsificación espontánea u homogeneización a alta presión

ARTIGO

Propiedades fisicoquímicas de nanoemulsiones a base de lecitina obtenidas por emulsificación espontánea u homogeneización a alta presión

Roselena S. Schuh#; Fernanda Bruxel#; Helder F. Teixeira*,#

Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 90610-000 Porto Alegre – RS, Brasil

ABSTRACT

Se prepararon nanoemulsiones compuestas por un núcleo de aceite de triglicéridos de cadena media estabilizado por lecitinas de colza o girasol mediante emulsificación espontánea y homogeneización a alta presión. Estas nanoemulsiones se comparan con formulaciones estabilizadas con lecitina de huevo. Las nanoemulsiones obtenidas por homogeneización a alta presión presentan un mayor tamaño de gota (230 a 440 nm) en comparación con las obtenidas por emulsificación espontánea (190 a 310 nm). Los potenciales zeta de las emulsiones fueron negativos e inferiores a -25 mV. La inversión del potencial zeta se produjo entre pH 3,0 y 4,0. Los resultados demuestran la viabilidad de la preparación de emulsiones lipídicas compuestas por lecitinas de colza o girasol mediante emulsificación espontánea y homogeneización a alta presión.

Palabras clave: nanoemulsión; lecitina; parenteral; homogeneización a alta presión; emulsificación espontánea.

INTRODUCCIÓN

Un régimen de nutrición parenteral se compone básicamente de macronutrientes (aminoácidos, carbohidratos y lípidos) y micronutrientes (vitaminas, electrolitos y microelementos), bajo la prescripción de un médico en función del estado, la edad y el peso del paciente.1 Los macronutrientes lipídicos, administrados en forma de emulsiones, son donantes de energía, proveedores de ácidos grasos esenciales y portadores de vitaminas liposolubles. Los ácidos grasos contenidos en estas formulaciones tienen una gran importancia metabólica, ya que son componentes de la membrana celular y desempeñan funciones específicas en la señalización y el transporte hormonal. Además, son precursores de las prostaglandinas, los leucotrienos, los tromboxanos y las prostaciclinas, que modulan los procesos inflamatorios, la función renal y la agregación plaquetaria.2 Una deficiencia de ácidos grasos esenciales en los bebés prematuros durante el desarrollo del cerebro da lugar a problemas de aprendizaje y a un deterioro de la función visual, que puede ser irreversible, incluso si se les proporciona una dieta adecuada que contenga ácidos grasos más adelante en el desarrollo.2

Las emulsiones lipídicas parenterales son sistemas heterogéneos, que consisten en una fase oleosa dispersada homogéneamente en una fase acuosa (dispersante), por la presencia de un emulsionante. Las formulaciones se caracterizan por un tamaño de gota pequeño, generalmente entre 200 y 500 nm, debido al riesgo de embolia por el uso de partículas más grandes. Las emulsiones también deben presentar un pH fisiológicamente compatible (en torno a 7), isotonicidad, baja viscosidad y un alto potencial zeta (en módulo), para evitar la aparición de fenómenos de inestabilidad.3

Las nanoemulsiones lipídicas se emplean habitualmente en las mezclas de nutrición parenteral total, conocidas como sistemas 3 en 1, en los que todos los macronutrientes y micronutrientes se añaden a una bolsa de etilvinilacetato (EVA). Sin embargo, estas mezclas experimentan cierta inestabilidad física relacionada con la presencia de electrolitos y otros componentes, que pueden precipitar o interactuar con las gotas de la emulsión. La precipitación de calcio y fosfato está ampliamente documentada en la literatura. Además, los iones divalentes (como el calcio y el magnesio) pueden interferir con el potencial zeta de la emulsión e inducir la agregación/floculación de las gotas de lípidos, seguida de coalescencia. Este fenómeno es muy grave, ya que cualquier gota de más de 5 µm de diámetro que entre en el torrente sanguíneo puede provocar una embolia grasa.4,5

Las características físicas y la consiguiente estabilidad de las emulsiones lipídicas están muy relacionadas con su método de producción y su composición.3,6 Los métodos de producción son diversos y pueden requerir más de un paso para producir una emulsión con un tamaño de gota reducido. Por ejemplo, un homogeneizador de alta velocidad (Ultraturrax®) puede crear primero una emulsión gruesa. La reducción del tamaño de las gotas puede lograrse entonces mediante la homogeneización a alta presión, la microfluidización o la ultrasonicación.7-9 Entre los métodos que no requieren un tratamiento previo se encuentra la emulsificación espontánea, utilizada principalmente en estudios de formulación y que se realiza fácilmente a escala de laboratorio, ya que no es necesario utilizar equipos sofisticados.10

La tabla 1 muestra la composición de las emulsiones lipídicas intravenosas típicas disponibles en el mercado. Además de los componentes descritos, las formulaciones deben cumplir los requisitos de los productos inyectables.11

La fase oleosa de las emulsiones parenterales está compuesta por triglicéridos de cadena larga (LCT), que pueden combinarse con triglicéridos de cadena media (MCT), como se muestra en la Tabla 1. Los LCT comprenden una amplia variedad de aceites, como el de girasol, el de ricino, el de oliva o, más comúnmente, el de soja. Todos estos aceites contienen cadenas de ácidos grasos de más de 12 carbonos. Los MCT se obtienen por esterificación de los ácidos grasos del aceite de coco. Los emulsionantes de elección para la estabilización de emulsiones inyectables son las lecitinas, ya que son biocompatibles y biodegradables. Las lecitinas son mezclas naturales de fosfolípidos polares y neutros, obtenidas de fuentes animales o vegetales.12 La composición de fosfolípidos de las lecitinas de fuentes vegetales puede ser variable debido a la extracción, el cultivo y otras condiciones de procesamiento.13 Contienen principalmente fosfolípidos anfóteros, como la fosfatidilcolina y la fosfatidiletanolamina, pero también puede haber fosfolípidos negativos.

Las emulsiones lipídicas disponibles comercialmente para la nutrición parenteral suelen estar compuestas por lecitina de yema de huevo o, raramente, por lecitina de soja (Solipid® E&S). A pesar de los numerosos beneficios de la suplementación con grasas, existen informes de efectos clínicos adversos relacionados con la suplementación a largo plazo, debido a limitaciones metabólicas y reacciones inmunológicas en pacientes críticos.14,15 Se ha informado de reacciones adversas a las emulsiones lipídicas parenterales relacionadas con la presencia de lecitinas de soja y de yema de huevo.16-18 Las interacciones alérgicas entre fármacos y alimentos pueden provocar una serie de respuestas adversas, desde molestias gastrointestinales hasta anafilaxia.19

En este contexto, continúa la búsqueda de materias primas alternativas para encontrar sustitutos hipoalergénicos que sean más seguros para la administración parenteral en pacientes. Este trabajo prioriza la búsqueda de diferentes lecitinas con el fin de encontrar nuevas alternativas para las emulsiones lipídicas destinadas a la nutrición parenteral, o incluso como transportadores de fármacos, para ofrecer las opciones más seguras a los pacientes (especialmente a los prematuros) con hipersensibilidad a los emulsionantes a base de huevo o soja. Hemos intentado desarrollar nanoemulsiones lipídicas parenterales estabilizadas con lecitinas de colza o girasol, y las hemos comparado con nanoemulsiones que contienen lecitina de huevo. Además, se compara la preparación por emulsificación espontánea con la homogeneización a alta presión, utilizada habitualmente para la producción industrial de emulsiones lipídicas parenterales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Productos químicos y reactivos

Las lecitinas de TCM, aceite de soja y yema de huevo (Lipoid E80®), de colza (Lipoid R100®) y de girasol (Lipoid H100®) se obtuvieron de Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Alemania), que amablemente donó las lecitinas de colza y de girasol. El glicerol y el etanol se obtuvieron de Merck (Brasil) y Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), respectivamente. El agua ultrapura se obtuvo de un aparato Milli-Q® (Millipore, Billerica, EE.UU.).

Preparación de nanoemulsiones

Se prepararon emulsiones lipídicas por triplicado mediante dos métodos: emulsificación espontánea y homogeneización a alta presión. Las formulaciones obtenidas por emulsificación espontánea se prepararon según un procedimiento previamente descrito.10,20 Brevemente, se mezcló aceite de soja con MCT, lecitina y etanol. Se disolvió glicerol en agua, a la que se añadió lentamente la fase etanólica bajo agitación magnética moderada durante 30 minutos. A continuación, se eliminó el disolvente por destilación a presión reducida en un evaporador rotatorio. Las formulaciones obtenidas por homogeneización a alta presión se prepararon como se ha descrito previamente.21 En primer lugar, la lecitina se dispersó en agua que contenía glicerol y se mezcló bajo agitación magnética a 40 ºC, hasta obtener una fase acuosa homogénea. La fase oleosa estaba formada por aceite de soja y MCT. Ambas fases, aceite y agua, se mezclaron bajo agitación magnética (15 minutos, a temperatura ambiente) para obtener una emulsión gruesa. A continuación, las emulsiones gruesas se mezclaron a 9500 rpm durante 2 minutos utilizando un mezclador IKA® Ultra-Turrax T8 (IKA® Works Inc., NC, EE.UU.) para formar preemulsiones crudas, que se sometieron individualmente a una homogeneización a alta presión (EmulsiFlex-C3®, Avestin, Canadá) a 750 bares (10 000 psi) durante 10 ciclos para producir la emulsión final. El valor del pH de todas las formulaciones se ajustó a 8,0 con una solución de NaOH de 0,01 mol L-1. Las emulsiones se almacenaron a 4 ºC. Las formulaciones y sus componentes se indican en la Tabla 2.

Caracterización fisicoquímica de las nanoemulsiones

Los valores de pH de las formulaciones se determinaron directamente en las muestras justo después de su preparación, utilizando un potenciómetro calibrado (Digimed, São Paulo, Brasil) a temperatura ambiente. El tamaño medio de las gotas y el índice de polidispersidad se midieron mediante espectroscopia de correlación de fotones (PCS) y el potencial zeta se determinó mediante movilidad electroforética, utilizando un Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instrument, Reino Unido) a 25 ºC. Para estas mediciones, las nanoemulsiones se diluyeron en una solución de NaCl de 1 mmol L-1 en el rango de pH de 2,0 a 8,0 unidades. La viscosidad se evaluó por viscometría capilar a 25 ºC (constante del viscosímetro, k = 0,0212), a 25 ± 0,1 ºC. Se registró el tiempo, en segundos, para que el líquido fluyera desde la marca superior a la inferior en un tubo capilar. Todas las formulaciones se analizaron por triplicado.

Análisis morfológico

El examen morfológico se realizó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Se colocó una gota de la nanoemulsión en una rejilla de cobre recubierta de carbono (malla 200), se tiñó en negativo con una solución de acetato de uranilo al 2,0 % y se dejó secar durante 24 horas antes del examen. Se utilizó un instrumento JEM-1200 EXII (JEOL, Tokio, Japón), que funcionaba a 80 kV.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En el presente estudio, desarrollamos emulsiones lipídicas destinadas a la nutrición parenteral o al transporte de fármacos, estabilizadas por dos lecitinas obtenidas de fuentes vegetales (colza (R) y girasol (S)), como alternativas a la lecitina de yema de huevo (E), un estabilizador tradicional para emulsiones parenterales. Para comparar las nuevas formulaciones con las tradicionales, todos los demás componentes de la emulsión se mantuvieron en concentraciones similares a las de los productos comerciales de emulsión lipídica. Este trabajo también compara dos métodos de producción diferentes: la emulsificación espontánea y la homogeneización a alta presión.

La tabla 3 presenta las propiedades fisicoquímicas de las nanoemulsiones resultantes. Las formulaciones obtenidas por emulsificación espontánea presentan un tamaño medio de gota de 220 a 300 nm, determinado por PCS. En teoría, este es un rango de alta estabilidad de la emulsión.11,22,23 A medida que se reduce el tamaño de la gota, la tasa de autodifusión aumenta hasta un punto en el que las gotas muy pequeñas pueden evitar la formación de crema mediante la mezcla difusional.7,23 Las nanoemulsiones que contienen lecitina de colza o de girasol muestran un tamaño medio de gota menor en comparación con las que contienen lecitina de yema de huevo. Se han descrito resultados similares para nanoemulsiones obtenidas por el mismo método, compuestas únicamente por MCT, como fase oleosa, y estabilizadas por un 2 % (m/m) de lecitina de huevo.24 Basándose en estos datos, se podría concluir que una concentración del 1,2 % sería suficiente para emulsionar la mezcla de aceite de soja, MCT y agua. Sin embargo, aunque se obtuvo un tamaño de gota pequeño y un bajo índice de polidispersidad, las emulsiones no permanecieron físicamente estables durante más de una semana después de su preparación, tras lo cual se pudo observar visualmente la separación de fases (coalescencia). El proceso de coalescencia es un fenómeno de inestabilidad irreversible, ya que las gotas de aceite pierden sus interfaces y se fusionan en gotas más grandes.25

La composición cualitativa y cuantitativa de las nanoemulsiones, además del tipo de emulsionante y el método de emulsificación, puede influir directamente en el tamaño de las gotas.7,23 Por tanto, se probó un segundo método para la preparación de nanoemulsiones. La homogeneización a alta presión se utiliza habitualmente en la industria farmacéutica para la producción de este tipo de formulaciones, aunque a escala industrial. Entre los diversos métodos disponibles para la emulsificación, se prefiere este método debido a su eficaz disrupción de las gotas. Se trata de un método de alta energía, en el que la reducción de tamaño se consigue forzando una emulsión gruesa a alta presión a través de una válvula de homogeneización, deformando y reduciendo así el tamaño de las gotas.26 La emulsificación espontánea es un método de bajo coste, fácil y fiable, y suele utilizarse en estudios experimentales en lugar de un homogeneizador de alta presión, que es mucho más complejo y caro.

Como se demuestra en la Tabla 3, la homogeneización a alta presión produjo tamaños de gotas más grandes en las nanoemulsiones compuestas por colza (296 ± 18 nm) o lecitina de girasol (417 ± 25 nm), en comparación con el método anterior, y en relación con las emulsiones de huevo-lecitina de control (243 ± 12 nm). No obstante, hay que señalar que, aunque la homogeneización a alta presión fue menos eficaz en la disrupción de las gotas, confirió más estabilidad a las formulaciones. A diferencia de las emulsiones obtenidas por emulsificación espontánea, éstas fueron visualmente estables durante al menos 30 días. Estos resultados confirman la importancia del método de preparación para conferir estabilidad a la emulsión.

Considerando las aplicaciones intravenosas, la distribución del tamaño de las gotas de emulsión lipídica puede ser incluso más importante que el tamaño medio de las gotas. Una pequeña población de gotas grandes de aceite puede ser suficiente para provocar una embolia grasa en los pacientes.4,5 Las distribuciones del tamaño de las gotas de las formulaciones preparadas se presentan en la Figura 1.

En la Figura 1, se observan dos poblaciones en las formulaciones compuestas por lecitina de colza (obtenida por emulsión espontánea, Figura 1C) y lecitina de girasol (obtenida por emulsión espontánea o por homogeneización a alta presión, Figuras 1E y 1F). Como resultado, se obtiene un índice de polidispersidad superior a 0,20 para estas formulaciones.

La estabilidad de las emulsiones puede estar correlacionada con la composición y las propiedades de su película interfacial (lecitina), ya que ésta determina el potencial zeta de las formulaciones y la repulsión entre gotas, que es uno de los mecanismos de estabilización de la emulsión.27 La lecitina es una mezcla heterogénea de fosfolípidos; su heterogeneidad es extremadamente beneficiosa debido a la fluidez de la película interfacial, en comparación con la de un fosfolípido puro.28 Los principales fosfolípidos de las mezclas de lecitina son la fosfatidilcolina y la fosfatidiletanolamina, que no tienen carga a pH fisiológico (7,4). También pueden estar presentes cantidades más pequeñas de lípidos ácidos, como el fosfatidilinositol, la fosfatidilserina y el fosfatidilglicerol. Estos lípidos se ionizan a pH 7,0 e inducen una carga superficial negativa en las gotas de la emulsión, lo que contribuye a su estabilidad. Cualquier sustancia añadida que interfiera con esta carga es probable que altere la estabilidad del sistema.29 Incluso si la lecitina de grado parenteral está altamente purificada, todavía contiene una pequeña cantidad de otros fosfolípidos, como se muestra en la Tabla 4, que describe la composición de las tres materias primas de lecitina utilizadas en este estudio.

Como se demuestra en la Tabla 3, se observa un potencial zeta más pequeño (valor del módulo) para las nanoemulsiones compuestas por lecitina de colza o girasol y obtenidas por emulsificación espontánea. Sin embargo, no se observan diferencias en los potenciales zeta de las nanoemulsiones producidas por homogeneización a alta presión. Estos resultados indican que el principal factor que afecta al potencial zeta es el método de preparación. Aunque nuestro grupo ha optimizado ambos métodos, las condiciones experimentales deben ajustarse normalmente, teniendo en cuenta la composición de las formulaciones. Parámetros como el número de ciclos y la presión pueden modificarse para obtener las propiedades fisicoquímicas deseadas de las formulaciones finales.30,31

El potencial zeta de las nanoemulsiones también depende de la ionización del emulsionante. Una reducción de la carga resultante (en módulo) de 40 mV a menos de 25 mV puede aumentar las tasas de floculación y coagulación.32 El potencial zeta y el tamaño medio de las gotas de nanoemulsiones compuestas por diferentes lecitinas y producidas por diferentes métodos de emulsión se evaluaron en el rango de pH de 2,0 a 8,0. Los resultados se presentan en la Figura 2.

La carga superficial de todas las formulaciones disminuye a cero entre pH 3,0 y 4,0, como se observó anteriormente para Intralipid®, una emulsión de triglicéridos estabilizada con lecitina de huevo.25 El potencial zeta depende del pH, ya que el H+ es un ion determinante del potencial en las superficies de los fosfolípidos, con un pH isoeléctrico de 3,1.33 Una reducción del pH da lugar a una disminución del potencial zeta (menos negativo) y a una tasa de floculación más rápida.34 El tamaño medio de las gotas muestra un pequeño aumento en el pH de inversión del potencial zeta. A partir de la Figura 3, se puede concluir que el pH de las nanoemulsiones debe ser preferentemente superior a 7,0, ya que se alcanza una meseta en ese valor de pH, donde se observa la máxima repulsión entre las gotas de aceite.

Por último, se examinó mediante TEM la morfología de las gotas de aceite de las nanoemulsiones preparadas por homogeneización a alta presión. La figura 3 revela partículas homogéneas y esféricas, mostrando que las gotas de la emulsión tienen un tamaño medio de gota en el rango de los nanómetros. Estos resultados corroboran el análisis anterior del tamaño de las gotas.

Las nanoemulsiones son sistemas de baja viscosidad con comportamiento newtoniano. La evaluación de la viscosidad de la emulsión es crucial, ya que la administración intravenosa de emulsiones de alta viscosidad puede ser muy dolorosa para el paciente.23,32 Las nanoemulsiones compuestas por diferentes lecitinas muestran viscosidades similares. Como era de esperar, no se observa ninguna relación entre el tamaño medio de las gotas y la viscosidad de las nanoemulsiones, ya que todas las formulaciones contenían sólo un 10 % de núcleo de aceite.35 En cambio, se observan algunas diferencias en la viscosidad de las formulaciones obtenidas por los distintos métodos de preparación: la emulsificación espontánea produjo emulsiones ligeramente más viscosas.

Cabe mencionar que las composiciones de las nanoemulsiones estudiadas en este trabajo se basan en las de las nanoemulsiones comerciales que utilizan lecitina de huevo como emulsionante. El uso de un emulsionante diferente puede requerir la optimización de su concentración y/o de las condiciones de emulsión. Las nanoemulsiones inyectables comerciales compuestas por lecitina de soja (Solipid®) requieren una concentración del 1,5% del emulsionante, por ejemplo. A veces se utilizan coemulsionantes adicionales para estabilizar las emulsiones y promover una menor polidispersidad y gotas más pequeñas. Sin embargo, su aplicación se limita a las emulsiones lipídicas como portadoras de fármacos, ya que se administran pequeñas cantidades de las formulaciones con ese fin: los coemulsionantes no se utilizan con frecuencia en las emulsiones para la nutrición parenteral, debido a los elevados volúmenes de estas formulaciones que se administran y a los problemas de seguridad, especialmente en el caso de los bebés prematuros. El oleato de sodio se utiliza habitualmente para estabilizar las formulaciones de emulsiones lipídicas inyectables,36 actuando como tensioactivo aniónico y agente solubilizante.27

CONCLUSIONES

Los resultados demuestran la viabilidad de la preparación de emulsiones lipídicas inyectables compuestas por lecitinas de colza o girasol mediante emulsificación espontánea y homogeneización a alta presión, como alternativas a las tradicionales nanoemulsiones de lecitina de huevo para pacientes sensibles a los derivados del huevo. Deben realizarse más estudios para optimizar las condiciones de emulsificación con el fin de mejorar la estabilidad a largo plazo de las formulaciones.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean agradecer al Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) por el apoyo financiero y a Lipoid GmbH por los materiales proporcionados.

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Recibido el 03/02/2014; aceptado el 17/04/2014; publicado en la web el 15/07/2014