Los principios de ingeniería de la combinación de un bucle transcripcional de avance incoherente con retroalimentación negativa

Un modelo de regulación transcripcional de avance incoherente

Hay cuatro variedades de control de avance incoherente (FF) en un sistema de tres nodos . En este trabajo, estudiamos el motivo del bucle feedforward incoherente tipo 1 (I1-FFL), en el que la señal de entrada (X) activa tanto la intermedia (Y) como la de salida final (Z), mientras que Y reprime a Z (Fig. 1a) . Nuestro modelo es de regulación transcripcional, de modo que X representa un factor de transcripción de entrada, que puede unirse a las regiones cis-reguladoras de Y y Z, con afinidad K1 (Fig. 1b). Esto da lugar a la transcripción y traducción de Y (flechas dobles en la Fig. 1b), que también es un factor de transcripción que se une a la región reguladora de Z con afinidad K2. En nuestro modelo, la unión de X e Y es cooperativa (línea discontinua en la Fig. 1b), de modo que su unión sinérgica se describe mediante K12 = CK1K2. La unión cooperativa también puede tener lugar entre otros componentes; sin embargo, no se requiere una cooperatividad distinta a la de X e Y (véase el archivo adicional 1 para el análisis de la cooperatividad). Por lo tanto, retenemos sólo el término cooperativo necesario para probar nuestras hipótesis, y por lo tanto nuestro análisis principal asume que todas las demás interacciones de unión son no cooperativas.

En la ingeniería de control de procesos, X se ve como una perturbación del sistema; el objetivo del control FF estándar (que utiliza un motivo IFFL) es rechazar el efecto que X tiene en Z. Si el controlador FF se sintoniza correctamente, la variable de salida se mantiene en o cerca de su valor deseado (por ejemplo, dentro del 5%), tanto en el transitorio como en la salida final (Fig. 1c). Por el contrario, en los sistemas biológicos, X se considera una señal de entrada, y el motivo I1-FFL suele diseñarse de forma que los niveles de Z presenten una respuesta transitoria, para luego volver (cerca) de su valor original (Fig. 1d). Así, la altura del pico y la diferencia entre los niveles iniciales y finales de Z representan métricas de rendimiento (Fig. 1d).

Aquí modelamos el I1-FFL como un sistema de ecuaciones diferenciales de retardo, que son una extensión del modelo de (Ecs. 1-3 en Métodos). Nótese que X activa tanto a Y como a Z, con afinidad de unión K1, mientras que Y reprime a Z (incluso si X también está unido) con afinidad de unión K2. El término final en el denominador de fz es el término de cooperatividad (xy/K12 = xy/(CK1K2)). Ver Métodos para más detalles sobre la derivación del modelo.

En este trabajo, mantenemos x = x0 = 1 para t < 0, lo que resulta en un estado estacionario inicial de y0 y z0. En el tiempo t = 0, x experimenta un incremento escalonado: x(t ≥ 0) = x1 > 1, lo que resulta en un incremento inicial tanto de y como de z. Sin embargo, después de algún transitorio inicial, el incremento de y también comienza a reprimir a z. Para la mayoría de los valores de los parámetros, esto resulta en un valor máximo de z (zpeak), seguido por una adaptación de vuelta a un nuevo valor de estado estable, z1 (Fig. 1d). Aquí, hemos normalizado el nivel de pico y la métrica de adaptación como P ≡ (zpeak – z0)/z0 y f = (z1 – z0)/z0, respectivamente (véase la Fig. 1d). Para el resto del documento, tomaremos τy = τz = 1, y θy = θz = 0,5.

El bucle feedforward incoherente de tipo I puede ser sintonizado para una adaptación perfecta

Análisis anteriores del modelo anterior (Ecs. 1-3) mostraron que la regulación transcripcional I1-FFL puede, bajo las condiciones adecuadas, actuar como un detector de cambio de pliegue (FCD) . Una de las condiciones necesarias para que un modelo actúe como un FCD es la adaptación casi perfecta (NPA), que se produce cuando el estado final, z1, está dentro de unos pocos porcentajes del estado inicial, z0 (por ejemplo, |f| ≤ ε = 0,05). Mientras que los trabajos anteriores analizaban el modelo (Ecs. 1-3) desde el punto de vista de la FCD, el modelo (y las I1-FFLs en general) pueden producir varios otros fenotipos, incluyendo los fenotipos menos restrictivos de la adaptación y la generación de pulsos.

Nuestro análisis del modelo muestra que es posible afinar la FFL de tal manera que se logre la adaptación perfecta (PA). En otras palabras, z1 = z0 (curva azul en la Fig. 2a, b). Esta condición se obtiene cuando, para unos K1, K2 dados, el valor de C es igual a CPA, que viene dado por la Ec. 5 (ver Métodos). Si el valor de C se desvía ligeramente de CPA, se pierde PA, pero puede mantenerse CNPA. Aquí definimos CNPA+ y CNPA- como los valores de C en los que f = + ε y -ε, respectivamente (curvas roja y dorada en la Fig. 2a, b). Para la mayor parte de este trabajo, hemos fijado ε = 0,05; sin embargo, nuestros resultados no se ven materialmente afectados por el valor preciso de ε (véase el archivo adicional 1).

Sintonización de la I1-FFL para una adaptación casi perfecta. a Dinámica de la salida, z(t), ante un incremento escalonado de x de 1 a 10 en el tiempo t = 0. Curva azul: adaptación perfecta. Curvas roja y amarilla: adaptación casi perfecta, tal que |f| = 0,05. b Salida normalizada de z(t). Cuando se normalizan las curvas, está claro que las curvas rojas y amarillas logran una adaptación casi perfecta. c Mapa de calor del valor de C requerido para una adaptación perfecta dado K1, K2, para un aumento de paso en x de 1 a 10. Las curvas rojas (aquí y en otros lugares) representan contornos cuyos valores se indican directamente en el gráfico. Obsérvese que los límites del eje para K1 van desde una afinidad fuerte (10- 2) a una muy débil (106), mientras que los de K2 van desde una afinidad muy fuerte (10- 6) a una débil (102). d Mapa de calor de la métrica del pico, P. A medida que K1 se vuelve demasiado bajo, esta métrica cae a valores inaceptablemente bajos. e Niveles absolutos del pico en la salida. Curvas naranjas: P = 0,1 y CPA = 0,01. Estas curvas, junto con el contorno de zpeak = 0,01, delimitan una región biológicamente realista del espacio de parámetros. f Mapa de calor del rango normalizado de valores de C bajo el cual se alcanza el NPA. Las curvas negras delimitan dos regiones en las que se puede alcanzar el NPA con cualquier valor de C. En la región I, Y y Z están desacoplados y sólo cambian ligeramente al aumentar X. La región II se describe como una región FCD, que requiere NPA. En la región biológicamente realista del espacio de parámetros, los valores de C bajo los cuales puede lograrse NPA van del 13 al 65% de CPA

Para x1 = 10, un mapa de calor de los valores de CPA, en función de K1, K2, se representa en la Fig. 2c. Tenga en cuenta que la cooperatividad se requiere para lograr PA: CPA < 1, aunque se acerca a 1 para K1, K2 ≪ 1 (véase el archivo adicional 1 y la Fig. 2c). Como C representa un parámetro de cooperatividad de cambio de pliegues, los valores de C < 1 representan una sinergia positiva: cuando X se une a la región reguladora de Z, aumenta la capacidad de Y para unirse, y viceversa. Un límite inferior para los valores reportados de C en otros sistemas es del orden de 0,01 . Por lo tanto, como los modelos de procesos biológicos deben ser restringidos a fenotipos biológicamente realistas, es poco probable que la AP pueda ser alcanzada en la región superior derecha del espacio de parámetros (Fig. 2c).

Los valores moderados del espacio de parámetros corresponden a fenotipos biológicamente realistas

Dado el límite inferior aproximado de C, es razonable preguntarse qué otras restricciones pueden ser puestas en el modelo. Imponemos dos restricciones adicionales biológicamente realistas en el modelo. En primer lugar, el tamaño del pico relativo, P = (zpeak – z0)/z0, debe ser mayor que 0,1 para garantizar una respuesta de señalización de calidad. En la Fig. 2d se muestra un mapa de calor de P en función de K1, K2. El contorno de P = 0,1 reside aproximadamente en K1 = 0,25; esto implica que, si X se une a la región reguladora de Z con demasiada fuerza, un aumento de 10 veces en x (de 1 a 10) no produce un pico fuerte, ya que el promotor de Z ya está saturado, incluso en valores bajos de x.

En segundo lugar, el pico absoluto en z debe ser mayor que 0,01 (Fig. 2e). Como nuestro modelo está escalado de manera que el valor máximo posible de z es 1, esto corresponde al 1% de la concentración máxima posible de z, dada la fuerza del promotor y la tasa de degradación. Tomamos zpeak = 0,01 como el valor mínimo para conseguir una señal biológicamente detectable; sin embargo, se puede relajar un poco este valor mínimo, lo que no afectaría significativamente a nuestros resultados. Tomando estas tres restricciones sobre CPA, P y zpeak, una pequeña región del espacio de parámetros K1, K2 se considera «biológicamente realista». Para contextualizar, los tres contornos se representan en la Fig. 2e. De nuevo, esta región podría modificarse si se eligen otros valores de las restricciones «biológicamente realistas». También debe tenerse en cuenta que la región biológicamente realista también delimita la región del espacio de parámetros en la que el I1-FFL puede actuar como un generador de impulsos o adaptador perfecto (véase el archivo adicional 1).

Sensibilidad del NPA con respecto a los parámetros del I1-FFL

La robustez es un objetivo adicional que a menudo se impone a los sistemas biológicos . Por lo tanto, analizamos el rango de valores C sobre CPA para el que se mantiene el NPA. Definimos ΔCFF ≡ CNPA+ – CNPA-, y trazamos un mapa de calor de ΔCFF/CPA en la Fig. 2f (véase el archivo adicional 1 para la derivación de CNPA+ y CNPA-). Hay dos regiones del espacio de parámetros K1, K2 en las que se alcanza NPA independientemente del valor de C (véase el archivo adicional 1 y la Fig. 2f), ninguna de las cuales reside en la región biológicamente realista del espacio de parámetros (región blanca discontinua en la Fig. 2f). En la Región I, el valor de K1 es lo suficientemente bajo como para que, incluso en x0 = 1, las regiones reguladoras tanto de Y como de Z estén saturadas de X y, por tanto, Y y Z sean relativamente insensibles a X (véase el archivo adicional 1). Además, en la región I, K2 es lo suficientemente grande como para que Y tenga poca influencia sobre Z. Así, un aumento de x no cambia apreciablemente el valor de z, lo que significa que mientras z1 ≈ z0 (de modo que |f| < ε), no hay un pico en el valor de z (véase el archivo adicional 1: Figura S1). Este escenario no puede describirse realmente como NPA. De hecho, los nodos de la IFFL están desacoplados en esta región, de modo que el fenotipo biológico, o la función, de la IFFL es indistinto de dos nodos que actúan independientemente el uno del otro.

La región II se ha reportado previamente no sólo como la región en la que la NPA se logra fácilmente, sino también donde el I1-FFL puede actuar como un detector de cambio de pliegue (archivo adicional 1: Figura S2A) . En este régimen, en el que K1 ≫ 1, K2 ≪ 1, y K1K2 < 1, la unión de X está en el régimen lineal, y z depende de la relación de x/y . Por otra parte, la respuesta absoluta de Z se limita al 0,01% de su máximo (archivo adicional 1: Figura S2B).

En cambio, en la región biológicamente realista del espacio de parámetros, ΔCFF se limita al 13% — 65% de CPA (Fig. 2f). Por ejemplo, para K1 = 1, K2 = 0,1, para mantener el objetivo de NPA, el sistema puede tolerar sólo un ∼ 30% de perturbación a CPA. En otras palabras, el modelo I1-FFL es relativamente sensible a los cambios en C cuando se trata de NPA. Para aumentar la robustez del sistema, consideramos un sistema combinado feedforward/feedback (FF/FB).

Ciclos de retroalimentación negativa

En ingeniería, la sensibilidad del algoritmo del controlador feedforward con respecto a los parámetros del modelo puede mitigarse mediante la acción de un bucle de retroalimentación negativa (véanse las ecuaciones 6-8 en Métodos). De hecho, se ha demostrado que la retroalimentación negativa confiere robustez a los objetivos de rendimiento de I1-FFL, como el tiempo de subida y el tiempo de decaimiento, en un modelo simplificado de regulación genética . Sin embargo, en contraste con la alta frecuencia de motivos FFL transcripcionales, se ha informado previamente que no existen ciclos transcripcionales (más allá de la autorregulación) en el organismo modelo E. coli . Otros estudios sugieren que la retroalimentación negativa transcripcional es poco frecuente, posiblemente debido a la naturaleza lenta de los bucles transcripcionales dobles, aunque se reconoce el uso generalizado de bucles de retroalimentación negativa mixtos en los que una rama es transcripcional y la otra se basa en interacciones proteína-proteína . Para investigar más a fondo, analizamos un conjunto de datos recientemente actualizado de interacciones transcripcionales de E. coli, y encontramos 17 casos de ciclos de longitud 2, cinco de los cuales son de retroalimentación positiva, nueve de retroalimentación negativa y tres mixtos . De estas interacciones, uno de los ciclos de retroalimentación negativa estaba incrustado dentro de múltiples estructuras I1-FFL (véase el archivo adicional 2).

Un sistema combinado de avance/retroalimentación es más robusto que uno con avance solo

Dada la predicción relativa a la eficacia de un bucle FB para ampliar la robustez de NPA en un motivo IFFL, investigamos un sistema combinado FF/FB. Añadimos un cuarto nodo, W, que es activado por Z, y reprime a Z (Fig. 3a, b). Estas interacciones introducen múltiples parámetros nuevos en el modelo (ver Métodos), incluyendo dos parámetros de afinidad de unión (K3, K4) y un retraso de transcripción/traducción en W (θw; ver Fig. 3b).

Comportamiento del sistema combinado FF/FB. a La adición de W al motivo de la red da lugar a un bucle de retroalimentación negativa en el que participan Z y W. b Ilustración del mecanismo de retroalimentación negativa. Z activa W y es reprimido por W. No se muestra la ilustración de Y (véase la Fig. 1b). c Dinámica de la salida, z(t), tras un aumento escalonado de x de 1 a 10 en el tiempo t = 0 para el sistema combinado FF/FB. Curva azul: adaptación perfecta. Curvas rojas y amarillas: adaptación casi perfecta, tal que |f| = 0,05. d Salida normalizada de z(t). Cuando se normalizan las curvas, queda claro que las curvas roja y amarilla están ajustadas para una adaptación casi perfecta. El valor de C necesario para lograr la APN está más alejado de la APN que para el sistema de sólo FF. e Mapa de calor del rango normalizado de valores de C bajo el cual se logra la APN. Las curvas negras que delimitan las regiones I y II son análogas a las descritas en la Fig. 2. En la región biológicamente realista (definida para el sistema FF/FB), el rango de valores de C bajo el cual se puede alcanzar el NPA oscila entre el 25 y el 100% del CPA. f Mapa de calor de la relación de rangos de valores de C para los que se alcanza el NPA para el sistema FF/FB frente al sistema sólo FF. La adición de un bucle FB aumenta el rango de valores de C en un 21–54%

Para comparar directamente los dos sistemas, trazamos la relación ΔCFFFB/ΔCFF en la Fig. 3f. Para el rango de valores biológicamente realistas, ΔCFFFB es un 21% — 54% mayor que ΔCFF (ratios de 1,21 — 1,54). (Nótese que la región biológicamente realista mostrada en las Figs. 3e, f es para el sistema FF/FB; véase el archivo adicional 1: Figura S3). De hecho, con la excepción de una pequeña región del espacio de parámetros K1, K2 (cerca de la región II), el sistema FF/FB es siempre superior al sistema sólo FF (relación mayor que uno). Dada la ventaja del sistema FF/FB con respecto a los objetivos NPA, a continuación investigamos si las propiedades dinámicas del sistema FF/FB eran también ventajosas.

Como se mencionó anteriormente, en nuestro análisis, intentamos retener sólo las interacciones que eran necesarias para explicar el fenotipo NPA su robustez. Así, sólo las interacciones entre X e Y incluían la cooperatividad. También podemos incorporar la cooperatividad entre X y W, o Y y W, lo que no afecta cualitativamente a nuestro resultado de que añadir el módulo FB al I1-FFL aumenta la robustez del sistema (Archivo adicional 1: Figura S4). Además, nuestros resultados no dependen de la elección exacta de ε (archivo adicional 1: Figura S5).

El análisis dinámico revela que el sistema FF/FB es superior al que sólo tiene FB

Los bucles de retroalimentación negativa están acosados por múltiples inconvenientes . En primer lugar, la retroalimentación proporcional (que es el mecanismo más común que se da de forma natural en los sistemas biológicos) siempre da lugar a un desplazamiento (véase la Fig. 4a). En otras palabras, después de que una perturbación altere el sistema, la salida no vuelve a su valor original. Para mitigar esto, se puede aumentar la fuerza de la respuesta de retroalimentación negativa. Sin embargo, esto suele provocar el segundo gran inconveniente de la retroalimentación negativa: las inestabilidades dinámicas y/o las oscilaciones en anillo pueden ser el resultado de una retroalimentación negativa fuerte, especialmente en sistemas con retrasos considerables (Fig. 4b) . Por otro lado, si la perturbación primaria puede ser parcial o totalmente rechazada por un FFL, ambos inconvenientes pueden ser evitados (Fig. 4a, b). Para investigar estos principios en un sistema de regulación de genes, comparamos el comportamiento de un modelo sólo FB con un modelo combinado FF/FB. Para ilustrar la inestabilidad dinámica, fijamos el coeficiente de Hill para todas las interacciones de unión al ADN en n = 2 (véase el archivo adicional 1).

Dinámica de los sistemas sólo FB y combinados FF/FB. a Una retroalimentación negativa (proporcional) por sí sola (curva azul), tras la perturbación, siempre resulta en un desplazamiento del valor original. Un sistema comparable combinado FF/FB también puede mostrar un desplazamiento; sin embargo, el I1-FFL en el sistema FF/FB puede ser ajustado para una adaptación perfecta. El sistema FF/FB también puede tener una aproximación más rápida al estado estacionario. b La adición de un I1-FFL al sistema FB puede dar lugar a una dinámica más estable. Para esta elección de parámetros, el sistema sólo FB es inestable, mientras que el sistema FF/FB es estable. c Mapa de calor de la parte real del valor propio principal (α) para el sistema sólo FB. La curva negra es el contorno para el que α = 0, que indica el límite de estabilidad del sistema sólo FB. Los valores más pequeños de K4 dan lugar a un sistema inestable (véase la parte B). Aquí y en otras partes, los valores de α para otros contornos (curvas rojas) se indican directamente en el gráfico. d Igual que C, pero para el sistema combinado FF/FB. e Mapa de calor de Δα, la diferencia entre las partes reales de los valores propios principales para los dos sistemas. A la derecha del contorno cero, los valores de Δα son mayores que cero, lo que indica que el sistema FF/FB tiene una aproximación más rápida al estado estacionario. Las curvas negra y blanca indican los límites de estabilidad para los sistemas sólo FB y FF/FB, respectivamente (véanse también las partes C, D)

Para determinar la estabilidad de los sistemas sólo FB y combinados FF/FB, calculamos α, la parte real del valor propio principal (véase el archivo adicional 1), para valores variables de K3, K4 (para el sistema FF/FB, fijamos K1 = 1, K2 = 0,1; Fig. 4c, d). Aunque ninguno de los dos sistemas es claramente superior al otro, para una activación moderada de W por Z (K4 ≈ 0,1 o mayor), una fuerte retroalimentación negativa (K3 < 0,1) tiende a dar lugar a un sistema inestable sólo FB, mientras que el sistema FF/FB es siempre estable. De hecho, αFB – αFFFB > 0 para esta región de activación moderada de W (Fig. 4e). Incluso cuando ambos sistemas son estables, αFFFB < αFB implica que el sistema FF/FB alcanza el estado estacionario más rápidamente (véase, por ejemplo, la Fig. 4a). Sin embargo, añadir una segunda capa de control puede dar lugar a menudo a compensaciones, en las que una ventaja obtenida en un área resulta en una desventaja en otra. Por lo tanto, compararemos el rendimiento de los modelos FB sólo y combinado FF/FB con respecto a otros dos objetivos: pico normalizado, P, y pico absoluto, zpeak.

Un sistema combinado FF/FB logra un compromiso en múltiples objetivos

Para comparar el rendimiento del sistema FF/FB frente al del sistema FB sólo, calculamos el valor pico de z en ambos sistemas mientras variamos K3, K4 de 0,01 a 1. En primer lugar, comprobamos que el pico normalizado, P, del sistema sólo FB oscilaba aproximadamente entre 0,7 y 1 (Fig. 5a). Por otro lado, el pico normalizado para el sistema FF/FB es casi independiente de los valores K3, K4 y es aproximadamente 1,256 (véase el archivo adicional 1: Figura S6). Por lo tanto, el sistema FF/FB supera al sistema sólo FB en esta métrica también: el sistema FF/FB es una mejora del 30-80% sobre el sistema sólo FB (Fig. 5b).

Comparación de las métricas de rendimiento del sistema sólo FB con el sistema combinado FF/FB. a Mapa de calor del pico normalizado, P, para el sistema sólo FB. Este parámetro (y otros definidos en esta figura) no está definido para los sistemas inestables. b Relación entre P para el sistema FF/FB y el sistema FB solo. Según esta métrica, el sistema FF/FB siempre supera al sistema sólo FB. Sin embargo, la métrica PFFFB es aproximadamente constante en 0,46, independientemente de los valores de K3, K4 (véase el archivo adicional 1). c Mapa de calor del pico absoluto, Zpeak, para el sistema FF/FB y los valores variables de K3, K4. Obsérvese que el valor del pico absoluto es, en el mejor de los casos, de 0,06. Aunque es bajo, es adecuado. d Relación entre el pico absoluto del sistema FF/FB y el de FB solamente. Según esta métrica, el sistema sólo FB siempre supera al sistema FF/FB (relación inferior a uno). Sin embargo, teniendo en cuenta los otros objetivos de rendimiento para los que el sistema FF/FB es superior, se trata de una compensación aceptable

Un inconveniente importante del sistema combinado es que, con dos represores de la salida (Y y W), los niveles de la salida (con respecto a sus niveles máximos posibles) son bajos. Para los valores de los parámetros elegidos (K1 = 1, K2 = 0,1), zpeak se mantiene por encima del límite inferior de 0,01 (véase la Fig. 2e). Sin embargo, este valor es significativamente menor que el valor de zpeak observado en el sistema de FB solamente (Fig. 5d). En total, el sistema combinado FF/FB es superior en su dinámica y valor de pico normalizado, aunque compromete el valor de pico absoluto.