La vía ubiquitina-proteasoma: La complejidad y las múltiples funciones de la muerte de las proteínas

Nuestra percepción de la degradación de las proteínas intracelulares ha cambiado drásticamente durante la última década. De ser un proceso de «punto final» carroñero, no regulado e inespecífico, ha quedado claro que la proteólisis de las proteínas celulares es un proceso altamente complejo, controlado temporalmente y estrechamente regulado que desempeña funciones importantes en una variedad de vías básicas durante la vida y la muerte celular. Se han descrito dos grandes cascadas proteolíticas. Las caspasas participan en la muerte celular programada (apoptosis), mientras que la degradación de la mayoría de las proteínas celulares reguladoras de vida corta está mediada por la vía de la ubiquitina-proteasoma. Entre ellas se encuentran los reguladores del ciclo y la división celular, como las ciclinas mitóticas y G1 y los inhibidores de las quinasas dependientes de ciclinas, los reguladores del crecimiento, como c-Fos y c-Jun, los supresores de tumores, como p53, los receptores de superficie, como el receptor de la hormona del crecimiento, y los canales iónicos, como el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). El sistema también participa en la proteólisis selectiva de proteínas anormales/mutadas y en el procesamiento de antígenos restringidos por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I. El descubrimiento de que el sistema está implicado en la degradación de c-myc y en la activación proteolítica en dos pasos de NF-κB, por ejemplo, supuso la «entrada» de la degradación mediada por ubiquitina en el ámbito de la regulación transcripcional. A través de la degradación de proteínas reguladoras clave y de corta duración, el sistema parece desempeñar importantes funciones en una serie de procesos celulares básicos. Entre ellos se encuentran la regulación del ciclo y la división celular, la participación en la respuesta celular al estrés y a los moduladores extracelulares, la morfogénesis de las redes neuronales, la modulación de los receptores de la superficie celular, los canales iónicos y la vía de secreción, la reparación del ADN, la biogénesis de los orgánulos y la regulación de las respuestas inmunitaria e inflamatoria. Recientemente se ha demostrado que el sistema también está implicado en la apoptosis. Con un abanico tan amplio de sustratos y procesos, no es de extrañar que las aberraciones del proceso se hayan implicado recientemente en la patogénesis de varias enfermedades, tanto hereditarias como adquiridas. Entre ellas se encuentran la degeneración muscular que sigue a la denervación o a la inmovilización prolongada, ciertas formas de la enfermedad de Alzheimer, la esterilidad masculina y el síndrome de Angelman (para revisiones recientes del sistema de ubiquitina, véanse las refs. 1-4).

La degradación de una proteína a través de la vía de la ubiquitina procede en dos pasos discretos y sucesivos: (i) la unión covalente de múltiples moléculas de ubiquitina al sustrato proteico, y (ii) la degradación de la proteína objetivo por el complejo proteasoma 26S con la liberación de ubiquitina libre y reutilizable. Para garantizar la eliminación eficaz y específica de una determinada proteína en un momento determinado, tanto la conjugación de la ubiquitina como la degradación de los sustratos marcados deben estar estrechamente reguladas. En un estudio publicado en este número de Proceedings (5), Zhang y sus colegas informan de la identificación de una región de activación en la subunidad α del activador del proteasoma PA28 (REG). Para incorporar este hallazgo en el contexto bioquímico y fisiológico apropiado, revisaremos brevemente nuestra comprensión actual de la vía proteolítica de la ubiquitina. El sistema (representado en la Fig. 1) consta de varios componentes que actúan conjuntamente. Uno de ellos, la ubiquitina, una proteína evolutivamente conservada de 76 residuos, se activa en su C-terminal Gly a un intermedio tiol éster de alta energía, una reacción catalizada por la enzima activadora de la ubiquitina, E1. Tras la activación, una de las diversas enzimas E2 (proteínas transportadoras de ubiquitina o enzimas conjugadoras de ubiquitina, UBC) transfiere la fracción de ubiquitina activada de E1 a un miembro de la familia de la ubiquitina-proteína ligasa, E3, al que se une específicamente la proteína sustrato. E3 cataliza el último paso del proceso de conjugación, la unión covalente de la ubiquitina al sustrato. La primera fracción de ubiquitina se transfiere al grupo ɛ-NH2 de un residuo de Lys del sustrato proteico para generar un enlace isopéptido. En reacciones sucesivas, se sintetiza una cadena de poliubiquitina mediante la transferencia procesal de restos activados adicionales a la Lys48 de la molécula de ubiquitina previamente conjugada. La cadena sirve, muy probablemente, como marcador de reconocimiento para el proteasoma (véase más adelante). La ubiquitina K48R o la ubiquitina metilada (en la que todos los grupos aminos libres fueron modificados químicamente) no pueden generar cadenas de poliubiquitina y sirven como terminadores de la cadena. En consecuencia, cuando se sobreexpresan en células o se introducen en sistemas libres de células, inhiben la proteólisis. La unión del sustrato al E3 es específica e implica que los E3 desempeñan un papel importante en el reconocimiento y la selección de las proteínas para su conjugación y posterior degradación. La estructura del sistema parece ser jerárquica: un único E1 parece llevar a cabo la activación de la ubiquitina necesaria para todas las modificaciones. Se han caracterizado varias especies principales de enzimas E2 en células de mamíferos. Parece que cada E2 puede actuar con una o más enzimas E3. Aunque hasta ahora sólo se han descrito relativamente pocas enzimas E3, parece que las ubiquitinas ligasas pertenecen a una gran familia de enzimas que sigue creciendo. En cuanto al modo de reconocimiento de las ligasas, salvo en unos pocos casos, es poco probable que cada E3 se dirija a un único sustrato. Más bien, es concebible que varias proteínas celulares diferentes sean reconocidas por una sola ligasa a través de un motivo estructural similar, pero claramente no idéntico. Unas pocas proteínas pueden ser reconocidas a través de su residuo N-terminal libre y «desestabilizador» («regla del extremo N»; ref. 6). Sin embargo, la gran mayoría de las proteínas celulares están acetiladas en su extremo N o tienen un extremo amino «estabilizador» y son reconocidas a través de diferentes señales. Algunas son reconocidas a través de secuencias primarias que residen aguas abajo del residuo N-terminal. Otras se dirigen a través de modificaciones secundarias, postraduccionales, como la fosforilación, o tras la asociación con proteínas auxiliares, como las oncoproteínas o las chaperonas moleculares.

Después de la conjugación, la fracción proteica del aducto es degradada por el complejo proteasoma, y se libera ubiquitina libre y reutilizable (para revisiones recientes sobre los proteasomas, véanse las refs. 7-10). Aunque el consenso actual es que el proteasoma 26S sirve como el principal brazo proteolítico del sistema de ubiquitina, el espectro de sustratos de la enzima puede ser más amplio e incluir también proteínas no ubiquitiniladas. Un caso bien estudiado es el de la ornitina descarboxilasa (ODC). La ODC se degrada tras una asociación no covalente con una antizima que puede funcionar en el proceso de reconocimiento como una chaperona similar a la ubiquitina específica del sustrato. Otros sustratos, en su mayoría proteínas del retículo endoplásmico (RE), también pueden ser degradados por el proteasoma sin una ubiquitinilación previa, aunque esto no se ha establecido firmemente. Entre ellas se encuentran, por ejemplo, las moléculas de cadena pesada del MHC mal plegadas (HCs), la 3-hidroxi-3-metil glutaril CoA (HMG-R) de los mamíferos y la variante Z de la α-1-antitripsina (α1-ATZ) (revisada en la ref. 11). Además, ahora está claro que no todas las proteínas ubiquitiniladas son el objetivo de la degradación por el proteasoma. Esto es cierto sobre todo para las proteínas de membrana maduras de la superficie celular, como el receptor de la hormona del crecimiento. En el caso de estas proteínas, la modificación de la ubiquitina se produce después de la unión del ligando y es necesaria para su endocitosis y para que se dirijan al lisosoma (revisado en la ref. 12). La degradación de las proteínas ancladas a la membrana por el sistema de ubiquitina plantea problemas mecánicos importantes, pero aún no resueltos, que están relacionados principalmente con la cuestión de cómo se unen dos eventos topológicamente distintos, como el mal plegamiento en el RE y la degradación en el citosol, o la unión del ligando en el dominio extracelular y la ubiquitinilación en la cola citosólica de un receptor. En el caso de las proteínas de membrana de la superficie celular, un problema evidente es el papel de la modificación por ubiquitina: ¿es necesaria para la endocitosis de la proteína marcada o, en una fase posterior, para su orientación y captación específicas por el lisosoma? En el caso de las proteínas del RE degradadas por el proteasoma citosólico, son importantes los mecanismos que subyacen a la recuperación de estas proteínas a través de la membrana hacia el citosol. El dominio transmembrana de las proteínas ancladas a la membrana es hidrofóbico y su eliminación de la membrana probablemente implique un transporte especializado, dependiente de la energía y basado en canales. En el caso de las proteínas lumenales del RE, la cuestión se centra en cómo se transportan de vuelta al citosol.

Evidencias recientes sugieren que el principio de modificación de la ubiquitina no se limita a la orientación de las proteínas para su degradación. Parece que la ubiquitina es un miembro de una familia más amplia, y también se han descrito varias proteínas similares a la ubiquitina. Un caso interesante es el de la localización en estructuras complejas. Se ha descubierto que la localización de RanGAP1, una proteína activadora de la GTPasa Ran, a la proteína del complejo del poro nuclear RanBP2, depende de una modificación covalente única y estable por parte de una proteína similar a la ubiquitina de 11,5 kDa y 101 residuos, SUMO-1 (13). La reacción de activación es similar a la de la ubiquitina e implica a E1 y a una E2 específica, UBC9. Así pues, la modificación covalente postraduccional por la ubiquitina y las moléculas similares a la ubiquitina cumple un amplio espectro de funciones. Participa en la selección de proteínas para su degradación por el proteasoma y el lisosoma, pero también desempeña funciones no proteolíticas.

El complejo del proteasoma mejor estudiado que participa en la degradación de las proteínas marcadas con ubiquitina es el complejo del proteasoma 26S. Se trata de una estructura simétrica con forma de concha compuesta por una unidad catalítica central, un complejo proteasoma 20S con forma de barril, que está flanqueado a ambos lados por complejos proteasoma 19S reguladores (19S-20S-19S). La estructura cristalina del proteasoma 20S eucariótico (levadura) se ha resuelto a 2,4 Å (14). El estudio ha corroborado las predicciones anteriores sobre la estructura del complejo, pero también ha revelado algunas características inesperadas. El complejo de la levadura está dispuesto como una pila de cuatro anillos, cada uno de los cuales contiene siete subunidades distintas, α1-7β1-7β1-7α1-7. Las diferentes subunidades α y β tienen masas moleculares del orden de 25-30 kDa. Los sitios activos residen en tres subunidades β, β1, β2 y β5, pero no en las subunidades α. El análisis topológico de la localización de las diferentes subunidades ha revelado que para las tres actividades proteolíticas distintas, la similar a la tripsina, la similar a la quimotripsina y la postglutamílica, los sitios activos son generados por pares adyacentes de subunidades idénticas de tipo β que residen en diferentes anillos β. El análisis de los residuos del sitio activo revela un nuevo tipo de mecanismo proteolítico. Las tres subunidades β sufren una autocatalización entre el último residuo Gly del propéptido y Thr1 de la subunidad madura que participa en el proceso autocatalítico y se convierte en una parte esencial del sitio catalítico. La resolución de la estructura cristalina también permitió comprender mejor el modo de acción de los diferentes inhibidores del proteasoma. Thr1 en β1, β2 y β5 se une al inhibidor menos específico de la calpaína I, Acetil-Leu-Leu-Norleucinal (ALLN). La lactocistina, un inhibidor más específico, puede unirse covalentemente a β5 donde puede generar, además, una gran cantidad de enlaces de hidrógeno con otras cadenas laterales circundantes. El análisis mutacional ha revelado que las otras subunidades β, en particular β4 y β7 que residen adyacentes a β5 y β1, afectan a la actividad de estas subunidades. Las β6 y β7 también se generan a partir de proproteínas mediante un procesamiento específico. Las β3 y β4 no se procesan. Debido a su posible papel en el establecimiento de contactos intersubunitarios y la estabilización de la estructura del complejo, parece que los propéptidos son esenciales para la biogénesis y la estabilización de la estructura proteasomal, y el procesamiento se produce sólo después del ensamblaje. La estructura del cristal también ha demostrado que las cadenas α, aunque catalíticamente inactivas, desempeñan un papel esencial en la estabilización de la estructura de dos anillos de las cadenas β. También deben desempeñar un papel en la unión de los complejos de tapa 19S, pero la estructura de los contactos y los mecanismos de unión sólo se dilucidarán cuando se resuelva la estructura cristalina del complejo 26S. La estructura cristalina también ha revelado una distancia de 28 Å entre los residuos Thr1 de subunidades β activas adyacentes. Esta distancia probablemente determina la longitud de los péptidos generados durante el proceso proteolítico (≈8-aa residuos) y explica el papel del proteasoma en la generación de péptidos antigénicos presentados en las moléculas MHC de clase I. La existencia, sin embargo, de productos intermedios de longitud variable sugiere la existencia de un segundo sitio hidrolítico aguas abajo de Thr1 (véase más adelante).

Un importante problema, aún no resuelto, tiene que ver con la entrada de sustratos proteicos y la salida de productos proteolíticos del proteasoma. El proteasoma de la arqueobacteria (Thermoplasma acidophilum) contiene dos poros de entrada de ≈13 Å en los dos extremos del cilindro rodeados por segmentos definidos de las siete cadenas α. En contraste llamativo y bastante sorprendente, estos puertos de entrada no existen en el proteasoma 20S eucariótico, y la entrada a la cámara catalítica de los anillos inter-β no es posible desde los extremos del complejo. Los dominios N-terminales de α1, α2, α3, α6 y α7 sobresalen entre sí y llenan el espacio en varias capas de cadenas laterales que interactúan estrechamente. Por lo tanto, la entrada desde los extremos sólo será posible después de un reordenamiento sustancial que puede ocurrir potencialmente después de la asociación con el complejo 19S. Tal reordenación también puede requerir energía metabólica que puede ser proporcionada por la actividad ATPasa de varias de las subunidades del complejo 19S. El complejo de la levadura muestra algunos orificios laterales estrechos, particularmente en la interfaz entre los anillos α y β. Estos orificios conducen directamente a los sitios activos Thr1. Están recubiertos de residuos polares que pueden reorganizarse potencialmente para generar aperturas de ≈10 Å a través de las cuales pueden entrar sustratos proteicos desplegados y extendidos.

La regulación de la actividad del proteasoma 20S se produce a varios niveles. Después de la estimulación de las células presentadoras de antígenos con interferón γ, tres subunidades β constitutivas, 1, 2 y 5, se sustituyen por subunidades β nuevas y distintas, β1i (LMP2), β2i (MECL1) y β5i (LMP7). Las nuevas subunidades son relativamente más eficientes en la generación de péptidos antigénicos reconocidos por las moléculas MHC de clase I y las células T citotóxicas adecuadas a través de los receptores de células T. Un tipo diferente de regulación implica la formación de complejos con complejos reguladores. El proteasoma 26S se genera tras la asociación dependiente de ATP del complejo 20S con dos complejos 19S. Los complejos 19S están compuestos por al menos 18 proteínas distintas con un rango de masa molecular de 25-110 kDa. Este complejo sirve como puerto de entrada al núcleo catalítico y proporciona las diferentes funciones reguladoras necesarias para asegurar la degradación selectiva de los sustratos marcados con ubiquitina. Estas incluyen, por ejemplo, un sitio de unión para las cadenas de ubiquitina, la actividad de reciclaje de ubiquitina y varias ATPasas, así como la capacidad de estimular las diferentes actividades de las peptidasas del complejo 20S. De hecho, se han identificado subunidades que llevan a cabo dichas actividades. De particular interés es la subunidad de unión a la cadena de ubiquitina que se ha descrito tanto en mamíferos (S5a) como en plantas (MBP1). Estas subunidades se unen a monómeros de ubiquitina; sin embargo, las cadenas de poliubiquitina, y en particular las que contienen más de cuatro moléculas, se unen con mayor afinidad. Recientemente se ha clonado el gen de la levadura que codifica la cadena homóloga, Mcb1. Sorprendentemente, los mutantes de deleción de Δmcb1 no muestran ningún defecto de crecimiento y degradan normalmente las proteínas ubiquitiniladas, excepto la proteína modelo de fusión lineal ubiquitina-Pro-β-Gal. Sin embargo, muestran una ligera sensibilidad al estrés, como la exposición a análogos de aminoácidos (15). Una posible explicación de estos resultados inesperados es que las proteínas ubiquitiniladas son reconocidas por una subunidad proteasomal adicional, aún no definida. Una de estas candidatas es la enzima deubiquitiniladora Doa4, que funciona para eliminar los restos de ubiquitina de los sustratos proteolíticos. Una posibilidad remota es que el proteasoma no reconozca los restos de ubiquitina, sino que, al igual que las chaperonas moleculares, se asocie con motivos mal plegados en el sustrato proteico. Estos motivos se generan tras la «desnaturalización» de la proteína por el marcado con ubiquitina. La identificación de la especificidad de reconocimiento del proteasoma y el papel que desempeña la ubiquitina en este proceso son esenciales para comprender los mecanismos de acción de la proteasa en particular y del sistema de la ubiquitina en general. Otra función reguladora del proteasoma 19S implica la edición de la cadena de poliubiquitina. El complejo contiene una isopeptidasa de 37 kDa que elimina los restos de ubiquitina del extremo distal de las cadenas cortas de poli-ubiquitina (16). Se supone que esta isopeptidasa está implicada en la edición y el rescate de proteínas poco ubiquitiniladas o lentamente degradadas de la degradación. Es diferente en este sentido de Doa4 y de una isopeptidasa dependiente de ATP que está asociada al proteasoma. Las dos enzimas están implicadas en el reciclaje de la ubiquitina y en el mantenimiento del nivel de ubiquitina libre en la célula.

Otro complejo que se asocia con el proteasoma 20S y que aumenta drásticamente su actividad es el PA28 (REG o el regulador 11S; refs. 17 y 18). A diferencia de la asociación con el 19S, la formación del complejo con el PA28 es independiente del ATP. Tras la asociación, el PA28 aumenta la Vmax y disminuye la Km del complejo 20S hacia toda una serie de péptidos diferentes. El complejo PA28-20S-PA28 es inactivo, sin embargo, hacia proteínas nativas intactas o conjugadas con ubiquitina. El activador puro es un complejo de dos subunidades ≈28-kDa, PA28α y PA28β, que son ≈50% idénticas. La inmunoprecipitación con anticuerpos específicos de las subunidades y los experimentos de entrecruzamiento químico revelaron que la PA28 es un hexámero con forma de anillo que está compuesto por subunidades α y β alternas con una estequiometría de (αβ)3 (19). Curiosamente, estas subunidades también son idénticas en un 30-40% a una proteína nuclear de función hasta ahora desconocida, el antígeno Ki, que reacciona con los sueros de pacientes con la enfermedad autoinmune lupus eritematoso sistémico. El complejo hexamérico tiene una estructura en forma de anillo (Fig. 1) y cubre el complejo del proteasoma 20S en una o ambas placas terminales. La estructura de la tapa está atravesada por un canal central con una abertura de 20 Å en el extremo y una abertura de 30 Å en la superficie de unión del proteasoma (20, 21). Las aberturas y el canal sirven, muy probablemente, como parte de la maquinaria de translocación de sustratos peptídicos en ruta hacia la cámara catalítica del complejo 20S. PA28α puede generar hexa- o hepta-homotímeros que se asocian con el complejo 20S y lo activan, aunque, de forma menos eficiente que el (αβ)3 heteromultímeros. Por el contrario, PA28β no se asocia con el complejo 20S y no tiene ninguna actividad estimulante. El papel de las subunidades β probablemente sea el de modular la actividad de PA28 influyendo indirectamente en la actividad de las subunidades α o modificando la afinidad de la partícula PA28 al proteasoma 20S.

PA28α contiene en su parte central una secuencia única, el motivo KEKE que es un dominio hidrofílico compuesto por residuos de Lys con carga positiva y residuos de Glu con carga negativa alternativamente. Se postuló que este motivo, que no existe en PA28β, promueve la interacción proteína-proteína entre las subunidades α de la partícula PA28 y las subunidades α del proteasoma 20S (22). El análisis mutacional reveló, sin embargo, que ΔKEKE PA28α conserva su actividad estimuladora (23). La unión al proteasoma 20S, sin embargo, requiere una terminación C intacta del PA28α y puede implicar a la subunidad C2 α del proteasoma 20S (8). Se sugirió que la fosforilación activa la actividad estimuladora de PA28α, sin embargo, este modo de regulación no se ha establecido firmemente.

El análisis mutacional de PA28α realizado por Zhang y sus colegas (5) reveló varias mutaciones inactivadoras en un bucle definido en la base de la molécula. Algunas de las proteínas mutantes se unen fuertemente al complejo 20S, pero no pueden activarlo (5). Así, la unión al proteasoma puede separarse claramente de la actividad estimuladora de la PA28. Curiosamente, existe una gran brecha en la distribución de las mutaciones inactivadoras que abarca los residuos de aminoácidos 51-122. Esta zona libre de mutaciones representa una región que es única para cada subunidad del complejo PA28. Probablemente no está implicada en la interacción de PA28 con el complejo 20S ni en la estimulación de su actividad proteolítica. Más bien puede desempeñar un papel en la función de la partícula en la célula intacta, como en su localización intracelular o en la asociación con otros componentes que determinan su actividad e interacciones específicas.

Un problema importante tiene que ver con las funciones fisiológicas de PA28. Ambas subunidades son marcadamente inducidas por el interferón γ, lo que sugiere un papel de la partícula en la función de procesamiento de antígenos del proteasoma. La sobreexpresión de PA28α en una línea de fibroblastos de ratón que expresa la proteína pp89 del citomegalovirus da lugar a un marcado aumento del reconocimiento por parte de las células T citotóxicas específicas de pp89. Del mismo modo, la presentación de una nucleoproteína de la gripe también se vio potenciada (24). Los estudios realizados en un sistema libre de células revelaron que el complejo PA28-20S-PA28, mediante un mecanismo coordinado de doble corte, puede recortar eficazmente grandes péptidos (que tienen secuencias de flanqueo tanto en el extremo N como en el C) a los epítopos antigénicos precisos reconocidos por el complejo MHC y la célula T citotóxica apropiada (25). Así pues, parece que PA28 desempeña un papel importante en el procesamiento de los antígenos para su presentación en las moléculas del MHC de clase I. Dado que el proteasoma PA28-20S-PA28 no puede digerir proteínas nativas intactas o ubiquitiniladas, debe actuar aguas abajo del proteasoma 19S-20S-19S que degrada proteínas marcadas con ubiquitina o péptidos grandes. También es posible, aunque no se ha demostrado, que exista un único proteasoma 19S-20S-PA28 asimétrico que pueda llevar a cabo este proceso proteolítico de dos pasos, la proteólisis inicial a péptidos grandes y el recorte final. Los proteasomas simétricos o putativamente asimétricos que contienen PA28 también pueden estar involucrados en la degradación terminal de péptidos a aminoácidos libres, una actividad que no puede ser catalizada por el proteasoma 19S-20S-19S (Fig. 1). Por lo tanto, parece que la elucidación de las funciones celulares del complejo PA28 tendrá que esperar a una mayor experimentación.