La ingeniería de ribosomas revela la importancia de la autonomía del ARNr 5S para el ensamblaje de los ribosomas

Construcción de plásmidos

Todos los plásmidos se construyeron mediante ensamblaje de Gibson50, con las columnas vertebrales de los plásmidos preparadas mediante PCR inversa o digestión con nucleasas de restricción y los insertos generados por PCR o sintetizados químicamente por Integrated DNA Technologies. Los plásmidos que codifican el ARNr se electroporaron inicialmente en células E. coli POP2136 (los genotipos de todas las cepas utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla Suplementaria 1) y las transformantes se recuperaron en placas LB suplementadas con los antibióticos adecuados; las placas se incubaron a 30 °C para evitar la expresión de los genes de ARNr controlados por el promotor lambda PL31. Todos los demás plásmidos se transformaron y propagaron en la cepa E. coli JM109 y se cultivaron a 37 °C en medio LB suplementado cuando fue necesario con 100 μg/ml de ampicilina (Amp), 50 μg/ml de kanamicina (Kan) o 50 μg/ml de espectinomicina (Spc).

Construcción del plásmido ptRNA100

La columna vertebral del plásmido, que incluye el origen de replicación pA15 y el gen de resistencia Spc, se amplificó por PCR a partir del plásmido ptRNA6751 utilizando los cebadores NA1 y NA2 (todos los cebadores se enumeran en la Tabla Suplementaria 4). El grupo de genes tRNA (que codifica tRNAGlu, tRNAAla, tRNAIle, tRNATrp y tRNAAsp), bajo el control del promotor Ptac y el terminador T1, se sintetizó como un gBlock (Integrated DNA Technology). El plásmido pTRNA100 se generó mediante ensamblaje Gibson. La estructura del plásmido se verificó mediante digestión de restricción y la presencia del clúster de ARNt nacido del plásmido se confirmó mediante amplificación por PCR utilizando los cebadores NA3 y NA4 y mediante secuenciación.

Construcción de los plásmidos pDH42, pDH39 y pCH84

Las construcciones que llevan el gen de ARNr 23S-cp5S híbrido se generaron sobre la base del plásmido pAM55229, que alberga el operón de ARNr rrnB de E. coli. El gen del ARNr 5S se eliminó mediante PCR inversa utilizando los cebadores NA17 y NA18, que albergan el sitio de restricción Xho1, la digestión del producto de la PCR por Xho1 y la ligación del ADN. A continuación, se introdujo la mutación de resistencia a Ery A2058G en el gen del ARNr 23S mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange Lightning Multi (Agilent Technologies) con el cebador NA7. El plásmido resultante, pAM552Δ5S, se utilizó para introducir los genes de ARNr cp5S con enlazadores en tres lugares diferentes dentro del gen de ARNr 23S.

La preparación de la secuencia de ADNr cp5S para su integración en el ADNr 23S se llevó a cabo en una única reacción de PCR en la que los pares de cebadores NA8/NA9 (para las construcciones DH39 y DH42) o NA26 y NA27 (para la construcción CH84) (100 nM cada uno) que albergaban el inserto de ADNr cp5S se combinaron con pares de cebadores (250 nM cada uno) que introducían enlazadores de secuencias aleatorias, cuyo tamaño oscilaba entre 0 y 3 nt, en las uniones 23S-cp5S «izquierda» y «derecha», como se indica a continuación: NA10-NA13 y NA14-NA17 para la DH39; NA18-NA21 y NA22-NA25 para la DH42; NA28-NA31 y NA32-NA35 para la CH84.

Para la generación de las bibliotecas de plásmidos de la DH39, la DH42 y la CH84, el plásmido pAM552Δ5S se abrió mediante PCR inversa utilizando los pares de cebadores NA36/NA37, NA38/NA39 y NA40/NA41, respectivamente. Los insertos de ADNr cp5S se introdujeron en los esqueletos de plásmidos resultantes amplificados por PCR mediante reacciones de ensamblaje de Gibson. Los productos de la reacción se transformaron en células E. coli POP2136 por electroporación y los transformantes se recuperaron en placas de agar LB/Amp cultivadas a 30 °C (condiciones que impiden la expresión del ARNr transportado por el plásmido). Cada biblioteca tenía al menos 3 veces más clones que la diversidad teórica estimada de 7225 variantes. Se lavaron las colonias de las placas LB, se extrajeron las bibliotecas de plásmidos y se almacenaron.

Sustitución de ptRNA67 por ptRNA100

La cepa E. coli SQ171 que carece de alelos cromosómicos de ARNr y lleva el plásmido pCSacB como fuente de los genes de ARNr y el plásmido ptARN67 como fuente de los genes cromosómicos de ARNt que faltan32,52, se utilizó como cepa huésped inicial. Para sustituir el plásmido ptRNA67 por el ptRNA100, las células SQ171 se transformaron primero con ptRNA-Amp (proporcionado por Michael O’Connor, Universidad de Missouri, Kansas City), que se parece al ptRNA67 pero confiere resistencia a Amp y contiene el origen de replicación pBR322. A continuación, las transformantes se curaron del plásmido ptRNA67 mediante pases en medio LB suplementado con Amp y Kan durante ~100 generaciones. La pérdida del plásmido ptRNA67 se verificó por la sensibilidad de los clones a Spc al realizar la replicación. La cepa resultante se transformó con ptRNA100 y se sembró en agar LB complementado con Spc y Kan. Las transformantes se pasaron durante unas 100 generaciones en medio LB suplementado con Spc y Kan. La pérdida del plásmido ptRNA-Amp se verificó por la sensibilidad de los clones individuales a Amp, tal y como se reveló por medio de chapado de réplica. La presencia de ptARN100 y la ausencia de ptARN67 se verificaron adicionalmente mediante PCR y digestión de restricción de los plásmidos totales preparados a partir del clon resultante.

Inactivación del gen recA en las células SQ171/ptARN100

El gen recA en la cepa SQ171/ptARN100 se inactivó mediante transducción de fagos P1. La cepa donante BW25113 recA::cat se preparó primero mediante el procedimiento convencional de recombinación52 utilizando el casete de resistencia al cloranfenicol (Chl) del plásmido pKD352. El casete se amplificó por PCR utilizando los cebadores NA42 y NA43. El fragmento de la PCR se transformó en la cepa BW25113, portadora del plásmido pDK46 que expresa la recombinasa roja. Tras verificar la integración del casete cat y curar el pKD46, las células BW25113 recA::cat se utilizaron como donantes para la transducción de fagos. La transducción de fagos P1 se llevó a cabo según el protocolo estándar53 , salvo que la incubación de recuperación se prolongó de 1 a 3 h antes de chapar los transductores en placas LB/agar suplementadas con Kan, Spc y 15 μg/ml de Chl. Para la escisión del casete cat, la cepa resultante se transformó con el plásmido pZFLP-TetR que codifica la enzima flippase y los transformantes se chaparon en la placa LB/agar suplementada con Kan, Spc y 2,5 μg/ml de tetraciclina (Tet). La eliminación del gen cat se confirmó por PCR y por la sensibilidad a Chl de los clones. A continuación, el plásmido pZFLP-TetR se curó haciendo pasar las células durante ~100 generaciones en medio LB suplementado con Kan, Spc, y se comprobó la sensibilidad de los clones resultantes a Tet. La cepa resultante se denominó SQA18 (Tabla Suplementaria 1).

Introducción de las bibliotecas 23S-cp5S en células SQA18

Las bibliotecas de plásmidos extraídas de las células POP2136 se transformaron en células SQA18 por electroporación. Tras 2 h de recuperación a 37 °C, las transformantes se sembraron en placas de agar LB/Amp que se incubaron durante toda la noche a 37 °C. Se lavaron las colonias de las placas de agar y se colocaron 0,01 A600 (~106 células) en un volumen de 2 ml de medio LB suplementado con 150 μg/mL de Ery y 0,25% de sacarosa. Después de crecer durante 16 h, las células se sembraron en placas de agar que contenían Amp, 1 mg/ml de Ery y 5% de sacarosa. Las placas se incubaron durante 48 h a 37 °C. Aparecieron colonias viables con las bibliotecas DH42 y CH84, pero no con la biblioteca DH39. Varias de las colonias que aparecieron en las placas se analizaron mediante PCR de colonias para detectar la presencia de ADNr 23S-cp5S utilizando los pares de cebadores NA44/NA45 para la construcción DH42 y los cebadores NA46/NA47 para la construcción CH84. La ausencia del gen ARNr 5S wt se verificó mediante PCR de colonia utilizando los cebadores NA48 y NA49.

Selección de los enlazadores preferidos de ARNr 23S-cp5S

La biblioteca total de plásmidos DH42 aislada de las células POP2136 se transformó en células SQA18 y se sembró en placas LB/Amp como se ha descrito anteriormente. Las colonias (~50.000) se lavaron de la placa y el plásmido total se extrajo de ~109 células y se utilizó como biblioteca de preselección.

A continuación, se sometieron aproximadamente 109 células al procedimiento de intercambio de plásmidos. En concreto, se colocaron en un volumen de 20 ml de medio LB suplementado con 150 μg/mL de Ery y 0,25% de sacarosa. Después de crecer durante 4 h, las células se sembraron en placas de agar que contenían Amp, 1 mg/ml de Ery y 5% de sacarosa. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37 °C. Se lavaron las colonias (~50.000) de la placa. El plásmido total extraído de estas células representó la biblioteca de postselección.

El ADNr cp5S flanqueado por secuencias de ADNr 23S y enlazadores se amplificó por PCR a partir de las preparaciones de plásmido de la biblioteca de preselección y postselección utilizando los cebadores NA50 y NA51. Las bibliotecas de PCR se sometieron a la secuenciación de próxima generación.

El factor de enriquecimiento de pliegues para cada combinación de enlazadores se calculó mediante el siguiente procedimiento. Después de recortar el adaptador, se eliminó toda la secuencia de ARNr cp5S, excepto los 4 nucleótidos terminales de cada extremo, para reducir el número de falsas variantes de secuencia que aparecían debido a errores de secuenciación dentro de la secuencia de codificación 5S. Los motivos de secuencia resultantes se contaron en las bibliotecas anteriores y posteriores a la selección y se calculó la frecuencia de la fracción de cada variante de enlace.

Preparación del ARN celular total

Cultivos nocturnos de las cepas de E. coli POP2136 o SQA18 se cultivaron a 30 °C o 37 °C, respectivamente, en medio LB/Amp. Los cultivos se diluyeron 1:100 en 2 ml de medio fresco y se cultivaron a 37 °C hasta A600 ~ 0,5. Las células se cosecharon por centrifugación (5000 × g, 1 min) y se resuspendieron en 100 μl de tampón de lisis . Tras añadir 400 μl de tampón de extracción (50 mM Bis-Tris pH 6,5, 400 mM NaCl, 5 mM EDTA) e incubar durante 5 min a temperatura ambiente, se extrajo el ARN total mediante extracción con fenol/cloroformo. El ARN se precipitó con etanol, el pellet de ARN se lavó con 1 ml de etanol al 70%, se disolvió en agua libre de RNasa, se congeló y se almacenó a -80 °C.

Análisis en gradiente de sacarosa de los ribosomas y polisomas

Los cultivos de E. coli de la noche a la mañana se diluyeron en 50 ml de medio LB/Amp y se hicieron crecer hasta A600 ~ 0,5. Se añadió Chl hasta una concentración final de 125 μg/ml y, tras 5 min de incubación, se cosecharon las células por centrifugación (5000 × g, 10 min, 4 °C). Los pellets de células se resuspendieron en tampón de lisis frío (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml de lisozima, 0,25% de desoxicolato de sodio y 2U de RQ1 DNasa I libre). Las células se lisaron mediante tres ciclos de congelación-descongelación. Los lisados se aclararon por centrifugación (20.000 × g, 15 min, 4 °C) y se cargaron 20 unidades A260 de lisado en 12 mL de gradiente lineal de sacarosa al 10-40% en tampón 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 2 mM β-mercaptoetanol. Los gradientes se centrifugaron (3 h, 4 °C) a 39.000 rpm en un rotor SW41 (Beckman). Los gradientes se fraccionaron utilizando un fraccionador (BioComp), registrando la absorbancia a 254 nm. Las fracciones correspondientes a las subunidades 50S, a los ribosomas 70S y a los polisomas se agruparon. El ARN se aisló mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol.

Aislamiento de los ribosomas 70S y de las subunidades ribosómicas

Para el aislamiento de los ribosomas tight-couple54, se diluyeron cultivos de E. coli de una noche en 1 L de medio LB/Amp y se cultivaron hasta A600 ~ 0,5. Las células se cosecharon por centrifugación (5.000 g, 15 min, 4 °C), se resuspendieron en tampón A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0, 6 mM β-mercaptoetanol, 10 U/ml de RQ1 RNasa-free DNase I), y se lisaron utilizando prensa francesa a 10.000 psi. Los lisados se clarificaron mediante centrifugación en un rotor JA25-50 (Beckman) a 13.000 rpm durante 30 minutos a 4 °C y los sobrenadantes se cargaron en un cojín de sacarosa 1,1 M de 10 ml preparado en un tampón que contenía 20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NH4Cl, 10 mM de MgCl2, 0,5 mM de EDTA, pH 8,0 y 6 mM de β-mercaptoetanol, en tubos de centrífuga Quick-Seal (Beckman) de 35 ml. Los ribosomas se pelletearon por centrifugación durante 16 h a 36.000 rpm (4 °C) en un rotor Ti70 (Beckman). El pellet de ribosomas se resuspendió en tampón B (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 6 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl y 6 mM β-mercaptoetanol) y se cargaron 100 unidades A260 en un gradiente de sacarosa al 10-40% preparado en tampón B en los tubos de un rotor SW27 (Beckman). Los gradientes se centrifugaron durante 21 h a 20.000 rpm (4 °C) en un rotor SW27, se fraccionaron utilizando un fraccionador de gradiente (BioComp) y las fracciones que contenían ribosomas 70S y subunidades ribosomales 50S se agruparon por separado. El material se concentró utilizando concentradores Vivaspin de 2 ml (Sartorius) con membrana de triacetato de celulosa y se recuperó en tampón de almacenamiento de ribosomas (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-mercaptoetanol). Las alícuotas de ribosomas y subunidades ribosómicas se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C. Cuando fue necesario, el ARNr se aisló mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol.

Para el aislamiento de las subunidades 50S de los ribosomas 70S, se prepararon 130 pmol de ribosomas, como se ha descrito anteriormente, pero concentrados por peletización y almacenados en el tampón de almacenamiento de ribosomas (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 10 mM de MgCl2, 100 mM de NH4Cl, 6 mM de β-mercaptoetanol) se diluyeron en el tampón D (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM de NH4Cl, 0,5 mM de EDTA, 6 mM de β-mercaptoetanol) para alcanzar una concentración final de 1,5 mM de MgCl2. Las subunidades ribosómicas se separaron por centrifugación en gradientes de sacarosa al 10-40% preparados en el tampón D que contenía 1,5 mM de MgCl2. Los gradientes se centrifugaron durante 16 horas a 27.000 rpm (4 °C) en un rotor SW27 (Beckman), se fraccionaron, se concentraron y se recuperaron en el tampón de almacenamiento de ribosomas, como se ha descrito anteriormente. Las alícuotas se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C.

Análisis por CL-MS/MS de las proteínas ribosómicas

Se determinó la composición proteica de los ribosomas 70S de acoplamiento hermético wt y mutantes y de las subunidades ribosómicas 50S, preparadas como se ha descrito anteriormente, mediante espectrometría de masas cuantitativa55. Las preparaciones ribosómicas se mezclaron en una proporción molar de 1:1 con ribosomas wt marcados con SILAC que contenían arginina marcada en masa (Arg6: 6HN4O2 y lisina (Lys4: C6H104N2O2) (Silantes GmbH, Alemania). Las proteínas ribosomales se digirieron con tripsina (Sigma) o con la proteasa Lys-C (Wako, EEUU). Los péptidos resultantes se fraccionaron y analizaron mediante LC-MS/MS utilizando LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific). El análisis de identificación y cuantificación de proteínas se realizó con Maxquant v1.5.6.056 y Perseus v1.6.2.357. La búsqueda en Maxquant se realizó utilizando la base de datos de secuencias de proteínas de E. coli MG1655 de UniProtKB (24.04.2019). La abundancia de proteínas se normalizó para las proteínas de subunidades grandes y pequeñas por separado desplazando la relación L/M media a 1.

Sondeo químico de la estructura del ARNr

La estructura del ARNr se sondeó en los ribosomas 70S aislados de células wt o mutantes. Los ribosomas (10 pmol) se colocaron en 50 μl de tampón de modificación y se activaron mediante incubación durante 5 min a 42 °C. La reacción de modificación se inició mediante la adición de 2 μl de sulfato de dimetilo (Sigma) diluido 1:10 en etanol. Las muestras se incubaron durante 10 minutos a 37 °C. Las reacciones de modificación se detuvieron añadiendo 50 μl de solución de parada recién preparada (600 mM de NaOAc, 1 M de β-mercaptoetanol) y 300 μl de etanol. Las muestras se precipitaron, se resuspendieron en tampón (300 mM de acetato de sodio, 5 mM de EDTA, pH 8,0, pH 7,0, 0,5% de SDS) y se aisló el ARN mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. Las extensiones de los cebadores se llevaron a cabo utilizando los cebadores NA56-NA57.

Análisis del contenido de ARNr mutante

Para el análisis de la presencia del ARNr 23S-cp5S de ingeniería, se aisló el ARN total de las fracciones de gradiente de sacarosa como se describe anteriormente. El contenido de ARNr 23S-cp5S mutante se evaluó mediante la extensión del cebador utilizando los cebadores NA58 o NA59. Específicamente, el cebador marcado con 5′ (0,5 pmol) fue recocido a 1 μg de ARN total en tampón de hibridación (50 mM K-HEPES, pH 7,0, 100 mM KCl) incubando a 90 °C durante 1 min y luego enfriando durante 15 min a 42 °C, y extendido con 2 U de transcriptasa inversa AMV (Roche) durante 20 min a 42 °C en un volumen de reacción final de 8 µl. Para el cebador NA58, la reacción contenía 0,25 mM de ddATP y 0,2 mM de dCTP, dGTP, dTTP. Para el cebador NA59, la reacción contenía 0,25 mM de ddCTP y 0,2 mM de dATP, dGTP, dTTP. Las reacciones se terminaron añadiendo 120 μl de tampón de parada (84 mM de NaOAc, 0,8 mM de EDTA, pH 8,0, 70% de EtOH), enfriando a -80 °C durante 15 minutos, y pelando los ácidos nucleicos por centrifugación a 15.000 × g durante 1 h a 4 °C. Se eliminaron los sobrenadantes, se secaron los pellets y se disolvieron en tinte de carga de formamida. Los productos de ADNc se resolvieron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 12% y se visualizaron mediante fosforimagen.

Traducción in vitro

Las reacciones de traducción in vitro se llevaron a cabo en el sistema de traducción sin células Δribosome PURExpress (New England Biolabs). Las plantillas de ADN que contenían el promotor de la ARN polimerasa T7, el sitio de unión al ribosoma y la secuencia de codificación de la proteína se prepararon mediante PCR. La plantilla de ermBL se preparó utilizando los cebadores NA52-NA55. La plantilla de GFP se generó a partir del gen sf-gfp del plásmido pY71-sfGFP58 utilizando los cebadores NA31 y NA32. La dihidrofolato reductasa (DHFR) se expresó a partir de la plantilla de plásmido suministrada con el kit PURExpress.

La reacción de traducción para la expresión de la GFP se montó en un volumen total de 10 μl y contenía 2 μl de la solución A del kit PURExpress, 12 μl de mezcla de factores, 1 μl de mezcla de aminoácidos (3 mM cada uno), 1 μl de ARNt (20 μg/ml), 16 U de inhibidor de RNasa RiboLock (ThermoFisher), 10 ng de plantilla de GFP y 12 pmol de ribosomas wt o mutantes. Las muestras se colocaron en pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 384 pocillos de pared negra/fondo plano transparente (BD Biosciences) y se cubrieron con la tapa. Las reacciones se incubaron a 37 °C en un lector de microplacas (Tecan) registrándose la fluorescencia de la GFP cada 10 min a λexc = 488 nm y λem = 520 nm durante un periodo de 4 h.

La expresión de la DHFR fue seguida de la incorporación de -L-metionina a la proteína de tamaño completo. La traducción se llevó a cabo en reacciones de 10 μl montadas como se ha descrito anteriormente pero complementadas con 5 μCi de -L-metionina (1175 Ci/mmol), utilizando 50 ng del molde de ADN y 6 pmol de ribosomas wt o mutantes. Las reacciones se incubaron a 37 °C. Cada 12 min, se extrajeron alícuotas de 1 μl, que se mezclaron con 3 μl de colorante de carga de gel que contenía SDS y se almacenaron en hielo hasta que se completó el curso de la reacción. Los productos proteicos se analizaron mediante electroforesis en gel SDS en geles Bis-Tris al 16,5% (Biorad) utilizando el tampón de funcionamiento NuPAGE MES/SDS (Invitrogen). Los geles se tiñeron, se secaron y se expusieron a una pantalla de fosforímetro durante la noche. Las bandas radiactivas se visualizaron por fosforimagen.

Análisis por crio-EM de los ribosomas 70S y las subunidades 50S

Las rejillas de crio-EM se prepararon de la siguiente manera. Las rejillas de cobre de 400 M recubiertas con carbono laceado y una fina capa de carbono de 2 nm (Ted Pella Inc.) se descargaron con una corriente de 20 mA con polaridad negativa durante 60S en una unidad de descarga brillante PELCO easiGlow. Se precalibró un Vitrobot Mark IV (ThermoFisher) a 4 °C y 95% de humedad relativa. Se descongeló una alícuota de ribosomas previamente congelados y, cuando se observó la opalescencia, se aclaró la solución en una microcentrífuga (10 minutos a 16.000 × g a 4 °C). La concentración del sobrenadante aclarado se derivó de la A260 medida con un Nanodrop (ThermoFisher) y los ribosomas se diluyeron a 200 nM en tampón LPP . Se aplicaron tres µl de solución de ribosomas de 200 nM a la rejilla; tras un retraso de 10S, la rejilla se secó durante 4S y luego se sumergió en etano líquido refrigerado con nitrógeno.

Los datos se recogieron en un microscopio electrónico Talos (ThermoFisher) que funcionaba a 200 KV y estaba equipado con un detector de electrones directo K3 (Gatan Inc.) con un enfoque de 0,5-1,8 μm. La recogida de datos se automatizó con SerialEM59 utilizando la inclinación del haz para recoger múltiples películas (por ejemplo, una toma en el centro, 6 con desplazamiento) en cada posición de la platina60. Las películas de superresolución tenían un total de 19 fotogramas con 1,5 e-/Å2 por fotograma para una dosis total de 30 e-/Å2 en la muestra. Se recogieron un total de 5222 películas a lo largo de 22 horas. Las películas se alinearon sobre la marcha durante la recogida de datos utilizando IMOD61 para descomprimir los fotogramas, aplicar la referencia de ganancia, agrupar los datos de superresolución en un píxel físico de 0,87 Å en la muestra y corregir la deriva de la imagen.

Los primeros pasos de la generación del mapa 3D a partir de la determinación del CTF, la recogida de partículas sin referencia (489.732 partículas) y la creación de la pila se llevaron a cabo en cisTEM. La alineación y el refinamiento de las partículas se llevaron a cabo en Frealign 9.11 y cisTEM62,63. Para acelerar el procesamiento, se prepararon pilas de imágenes de 2×-, 4×- y 8×-binned utilizando resample.exe, que forma parte de la distribución de FREALIGN64. El modelo inicial para la alineación de partículas de los mapas 70S fue el EMD-100365, que se redujo para que coincidiera con la pila de imágenes de 8× utilizando EMAN266. Se realizaron dos rondas de búsqueda en modo 3 con un corte de alta resolución de 30 Å y luego de 20 Å utilizando la pila de imágenes de 8×. A continuación, se ejecutaron 7 rondas de refinamiento en modo 1 con la pila de 4×, eventualmente sin binar, a medida que se añadían gradualmente conchas de resolución (límite de 5 Å) y se alcanzaba una resolución de 2,94 Å. Se utilizó el refinamiento por desplazamiento de haz para mejorar la resolución global a 2,87 Å.

Se utilizaron veinte rondas de clasificación de máxima verosimilitud en 3D sin enmascaramiento y a una resolución de 14 Å para separar rápidamente las partículas binadas 8x en 12 clases de diferentes composiciones que revelaban subunidades 50S, ribosomas 70S sin ARNt, o ribosomas 70S con ARNt y el 30S en una conformación rotada o no rotada (Fig. Suplementaria 3a). Se crearon subapilamientos de partículas 50S (133.490), partículas 70S vacías (120.428), o partículas 70S en estado no rotado y unidas al ARNt (55.677) utilizando el apilamiento 1x binned usando merge_classes.exe, parte del paquete Frealign, requiriendo puntuaciones de partículas de 0 y un mínimo de 50% de ocupación. Las subpilas se volvieron a dividir en 4x utilizando resample.exe para acelerar los pasos posteriores de clasificación.

La subpila de partículas 50S se separó en 6 clases con una máscara de enfoque de 55-Å de radio alrededor de la porción de ARNr 5S del ARNr híbrido 23S-cp5S. Se separaron las clases con uL16 y/o bL33 débiles o ausentes y las clases que difieren en la posición del ARNr 5S. Las clases se reconstruyeron con los parámetros originales de alineación e inclinación del haz a 1x binning y una de estas clases se utilizó para el modelado estructural como se detalla en la siguiente sección.

También se investigaron las partículas 70S. La subpila de partículas 70S vacía (sin ARNt) se separó en 12 clases utilizando la misma máscara de enfoque de 55-Å. Las clases mostraron diferencias en la ocupación de uL16 y/o bL33 y en la posición del ARNr 5S, de forma similar a las clases 50S descritas anteriormente. Sin embargo, en contraste con las partículas 50S, 3 de las 12 clases 70S vacías revelaron un PTC normalmente plegado.

La clasificación de la subpila de partículas 70S unidas al ARNt de estado clásico en 12 clases con la misma máscara reveló una ocupación casi estequiométrica de 16 uL, y todas las partículas tenían un PTC normalmente plegado y una fuerte densidad de P-ARNt. Por el contrario, la ocupación del ARNt del sitio A era débil en algunas clases con una densidad L33 más débil. La clasificación de las partículas 70S con un 30S rotado y un estado híbrido P/E-ARNt en 12 clases también reveló diferentes ocupaciones de uL16 y bL33, y siete clases presentaban un PTC aberrante.

La estructura crio-EM de 3,2Å del ribosoma 70S unido con los ARNt A y P67 se utilizó como modelo de partida para el refinamiento de la estructura. Los componentes/dominios del ribosoma se ajustaron en mapas utilizando Chimera68. Aquí, el 50S, el tallo L1, el tallo L11, el cuerpo y la cabeza del 30S y los tRNAs se ajustaron independientemente. El modelado del 5S rRNA, y los ajustes del PTC y del centro de decodificación se hicieron usando PyMOL69. Los modelos estructurales se refinaron utilizando el espacio real de refinamiento simulado con RS Ref 70,71 contra los mapas correspondientes. Los parámetros de refinamiento, como la ponderación relativa de las restricciones estereoquímicas y el término de energía experimental, se optimizaron para producir la estereoquímica óptima de la estructura, el coeficiente de correlación del espacio real y el factor R, que informa sobre el ajuste del modelo al mapa72. Las restricciones de la estructura secundaria, que comprenden restricciones de enlaces de hidrógeno para las proteínas ribosómicas y restricciones de emparejamiento de bases para las moléculas de ARN, se emplearon como se describe73. A continuación, las estructuras se refinaron utilizando phenix.real_space_refine74 seguido de una ronda de refinamiento en RSRef aplicando restricciones armónicas para preservar la geometría de la proteína70,71. Phenix se utilizó para refinar los factores B de los modelos contra sus respectivos mapas sin filtrar los factores B74. Los modelos estructurales resultantes tienen buenos parámetros estereoquímicos, caracterizados por una baja desviación de las longitudes y ángulos de enlace ideales y concuerdan estrechamente con los mapas correspondientes, como indican los altos coeficientes de correlación y los bajos factores R del espacio real (Tabla Suplementaria 2). Las figuras se prepararon en PyMOL69.

Resumen del informe

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el resumen del informe de Nature Research vinculado a este artículo.