Isoenzima de la fosfatasa alcalina

Estructura genómica, química de la proteína y enzimología de la fosfatasa alcalina

La ALP (fosfohidrolasa ortofosfórica-monoéster, óptima alcalina, EC 3.1.3.1) se encuentra en toda la naturaleza en plantas y animales (McComb et al., 1979). En los seres humanos, cuatro isoenzimas de la ALP están codificadas por cuatro genes distintos (Millán, 1988, 2006; Harris, 1990; Moss, 1992). Tres de las isoenzimas tienen una expresión esencialmente tisular y se denominan ALP intestinal, placentaria y de células germinales (similar a la placentaria). La cuarta isoenzima de la ALP se expresa de forma ubicua, por lo que se denomina TNSALP (Stigbrand y Fishman, 1984; Harris, 1990; Moss, 1992). El tejido esquelético, hepático y renal es especialmente rico en TNSALP. Las propiedades fisicoquímicas distintivas (estabilidad al calor, movilidad electroforética, etc.) entre las ALP purificadas de hueso, hígado y riñón humanos se pierden al ser expuestas a las glucosidasas (Moss y Whitaker, 1985), por lo que la TNSALP es una familia de isoenzimas «secundarias» (las llamaré «isoformas»). Están codificadas por el mismo gen, tienen la misma secuencia polipeptídica y sólo difieren por las modificaciones postraduccionales que implican a los carbohidratos (Harris, 1980).

El símbolo de mapeo del gen para la TNSALP es ALPL («ALP-hígado»), aunque la función de la isoforma hepática de la TNSALP no se conoce (véase más adelante). ALPL se encuentra cerca del extremo del brazo corto del cromosoma 1 (1p36.1-p34), mientras que los genes de las ALP intestinales, placentarias y de células germinales se encuentran en el extremo del brazo largo del cromosoma 2 (2q34-q37) (Harris, 1990; Millán, 2006). ALPL parece representar el gen ancestral, mientras que las ALP específicas de tejido se formaron probablemente por duplicación génica (Harris, 1990). ALPL es algo mayor de 50 kb y contiene 12 exones, 11 de los cuales se traducen para formar la enzima madura que consta de 507 residuos de aminoácidos (Weiss et al., 1988b). Las secuencias TATA y Sp1 pueden ser elementos reguladores, pero la expresión basal parece reflejar los efectos del promotor «de mantenimiento», mientras que la expresión diferencial en varios tejidos puede estar mediada por un mecanismo postranscripcional (Kiledjian y Kadesch, 1990). La ALPL tiene dos promotores y dos exones 5′ no codificantes correspondientes, 1a y 1b. Su expresión da lugar a dos ARNm diferentes con distintas regiones 5′ no traducidas (Nosjean et al., 1997). La transcripción se produce preferentemente a partir del promotor ascendente (1a) en los osteoblastos y del promotor descendente (1b) en el hígado y el riñón (Millán, 2006).

Los genes ALP específicos de cada tejido son más pequeños que los ALPL, principalmente debido a que los intrones son más cortos. Las secuencias de aminoácidos deducidas de sus ADNc sugieren un 87% de identidad posicional entre las ALP placentarias e intestinales, pero sólo un 50%-60% de identidad entre las ALP específicas de tejido y la TNSALP (Harris, 1990).

La secuencia de residuos de aminoácidos de la TNSALP indica cinco sitios potenciales de glicosilación ligada a N (Weiss et al., 1988). La N-glicosilación es necesaria para la actividad catalítica. La O-glicosilación caracteriza la isoforma ósea, pero no la hepática (Nosjean et al., 1997).

En el año 2000, se delineó la estructura cristalina de la ALP placentaria humana a una resolución de 1,8-Å (Le Due et al., 2000). El sitio activo de la TNSALP provendría de una secuencia de nucleótidos conservada en las ALP en toda la naturaleza (Henthorn y Whyte, 1992), reflejaría seis exones y comprendería 15 residuos de aminoácidos (Zurutuza et al., 1999).

Las ALP son metalocitos de Zn++ (McComb et al., 1979). La actividad catalítica requiere una configuración multimérica de subunidades idénticas con cada monómero que tiene un sitio activo y dos átomos de Zn++ que estabilizan la estructura terciaria (Kim y Wycoff, 1991).

Las ALP se consideran generalmente homodiméricas en la circulación (McComb et al., 1979). Las TNSALP, en su forma dimérica simétrica, tienen una topología αβ para cada subunidad que incluye una hoja β de diez filamentos en su centro (Hoylaerts y Millán, 1991). Sin embargo, en los tejidos, las ALP están unidas (véase más adelante) a las superficies celulares, quizás como homotetrámeros (Fedde et al., 1988).

In vitro, las ALP tienen amplias especificidades de sustrato y óptimos de pH que dependen del tipo y la concentración del fosfocompuesto que se cataliza (McComb et al., 1979). La actividad catalítica requiere Mg++ como cofactor (McComb et al., 1979). Tanto la PPi como los fosfógenos pueden ser hidrolizados (Xu et al., 1991). La reacción implica la fosforilación-defosforilación de un residuo de serina. La disociación del Pi unido covalentemente parece ser el paso que limita la velocidad. De hecho, el Pi es un potente inhibidor competitivo de la ALP (McComb et al., 1979; Kim y Wyckoff, 1991; Coburn et al., 1998). Sin embargo, también puede ser que el Pi estabilice la enzima (Farley, 1991).

Persisten las incertidumbres sobre la biosíntesis de la ALP en los organismos superiores. Las secuencias genéticas de las isoenzimas humanas de la ALP indican que los polipéptidos nacientes tienen una secuencia señal corta de 17-21 residuos de aminoácidos (Harris, 1990) y un dominio hidrofóbico en su extremo carboxilo (Weiss et al., 1988b). La degradación intracelular de las ALP puede implicar a los proteasomas (Cai et al., 1998). Sin embargo, estas ALP se unen a la superficie externa de las membranas plasmáticas atadas al grupo de cabeza polar de una fracción de fosfatidilinositol-glicano (Whyte et al., 1988; Whyte, 1994) y pueden ser liberadas por la fosfolipasa específica de fosfatidilinositol (Fedde et al., 1988). Sin embargo, su interacción precisa con el fosfatidilinositol puede diferir entre las isoenzimas de la ALP (Seetharam et al., 1987).

La ALP libre de lípidos es la fracción que se encuentra normalmente en la circulación. Sin embargo, se desconocen los mecanismos de liberación de ALP de las superficies celulares. El proceso podría implicar una fosfatasa del tipo C o D, la acción de detergentes, la proteólisis, el fraccionamiento de la membrana o la lipólisis (Alpers et al., 1990).

En hombres y mujeres sanos, casi toda la actividad de la ALP en suero o plasma deriva de cantidades aproximadamente iguales de las isoformas ósea y hepática de la TNSALP (Millán et al., 1980). Los bebés y los niños, especialmente los recién nacidos y los adolescentes, tienen niveles más altos de la isoforma ósea en el torrente sanguíneo (McComb et al., 1979). Algunos individuos con tipos de sangre B y O que son «secretores» aumentan la pequeña cantidad de ALP intestinal en su circulación después de ingerir una comida grasa (Langman et al., 1966; McComb et al., 1979). Sin embargo, normalmente la ALP intestinal contribuye sólo en un pequeño porcentaje a la actividad total de la ALP en suero (máximo 20%) (McComb et al., 1979; Mulivor et al., 1985). La ALP placentaria suele expresarse y circular sólo durante el último trimestre del embarazo (Birkett et al., 1966). Sin embargo, varios tipos de cáncer liberan ALP placentaria o de células germinales («similar a la placentaria») (Millán, 1988) en el torrente sanguíneo. La eliminación de la ALP circulante, al igual que la de muchas otras glicoproteínas, probablemente implica su captación y degradación por el hígado (Young et al., 1984).