ISH: protocolo de hibridación in situ

Conservación de muestras

Conservación del ARN
La conservación del ARN es difícil debido a la presencia de la enzima RNasa. Esta enzima se encuentra en el material de vidrio, en los reactivos y en los operadores y su ropa. La RNasa destruye rápidamente cualquier ARN en la célula o en la propia sonda de ARN, por lo que los usuarios deben asegurarse de utilizar técnicas, guantes y soluciones estériles para evitar la contaminación por RNasa de la sonda o del ARN tisular.

Almacenamiento general de las muestras cuando se utilizan secciones congeladas
Para obtener los mejores resultados en portaobjetos antiguos, no almacene los portaobjetos en seco a temperatura ambiente. En su lugar, consérvelos en etanol al 100% a -20°C, o en una caja de plástico cubierta con papel de sarán a -20°C o -80°C. Este tipo de almacenamiento conserva los portaobjetos durante varios años.

Elección de la sonda

Sondas de ARN

Las sondas de ARN deben tener una longitud de entre 250 y 1.500 bases; las sondas de aproximadamente 800 bases presentan la mayor sensibilidad y especificidad. Las plantillas de transcripción deben permitir la transcripción de los ARN de la sonda (cadena antisentido) y del control negativo (cadena sentido). Para ello, clone en un vector con promotores opuestos. Las plantillas circulares deben linealizarse antes de hacer una sonda, aunque también pueden utilizarse plantillas de PCR.

Sondas de ADN

Las sondas de ADN proporcionan una alta sensibilidad para la hibridación in situ. No hibridan tan fuertemente con las moléculas de ARNm objetivo en comparación con las sondas de ARN, por lo que no debe utilizarse formaldehído en los lavados posteriores a la hibridación.

La especificidad de la sonda es importante. Si se conoce la secuencia exacta de nucleótidos del ARNm o del ADN en la célula, se puede diseñar una sonda complementaria precisa. Si el >5% de los pares de bases no son complementarios, la sonda sólo se hibridará vagamente con la secuencia objetivo. Esto significa que es más probable que la sonda sea arrastrada durante los pasos de lavado y detección y puede no ser detectada correctamente.

Protocolo de hibridación in situ con sonda de ARN marcada con digoxigenina (DIG)

Este protocolo describe el uso de sondas de ARN monocatenario marcadas con DIG para detectar la expresión del gen de interés en secciones incluidas en parafina.

1) Desparafinamiento

Para secciones congeladas, comience en el paso 2. Si se utilizan secciones fijadas en parafina con formaldehído, continúe con este paso.

Antes de proceder, los portaobjetos deben ser desparafinados y rehidratados. La eliminación incompleta de la parafina puede causar una mala tinción de la sección.

Coloque los portaobjetos en una gradilla y realice los siguientes lavados:

• Xileno: 2×3 min
• Xileno 1:1 con etanol 100%: 3 min
• Etanol 100%: 2×3 min
• Etanol 95%: 3 min
• Etanol al 70%: 3 min
• Etanol al 50%: 3 min
• Enjuagar con agua fría del grifo

Mantener los portaobjetos en el agua del grifo hasta la recuperación del antígeno. A partir de este momento, los portaobjetos no pueden secarse, ya que esto provocaría una unión inespecífica del anticuerpo y una elevada tinción de fondo.

2) Recuperación del antígeno

Digerir con 20 µg/mL de proteinasa K en Tris 50 mM precalentado durante 10-20 min a 37°C. El tiempo de incubación y la concentración de proteinasa K pueden requerir optimización.

Recomendamos probar un experimento de titulación de proteinasa K para determinar las condiciones óptimas. Una digestión insuficiente reducirá la señal de hibridación y un exceso de digestión dará lugar a una mala morfología del tejido, lo que dificultará la localización de la señal de hibridación. La concentración óptima de proteinasa K variará en función del tipo de tejido, la duración de la fijación y el tamaño del tejido.

3) Enjuague los portaobjetos 5 veces en agua destilada.
4) Sumerja los portaobjetos en ácido acético al 20% (v/v) helado durante 20 segundos. Esto permeabiliza las células para permitir el acceso a la sonda y al anticuerpo.
5) Deshidratar los portaobjetos lavando durante aproximadamente 1 min por lavado en etanol al 70%, etanol al 95% y etanol al 100%, y luego secar al aire.
6) Añadir 100 µl de solución de hibridación a cada portaobjetos.

Solución salina (20x)

• 4 M NaCl
• 100 mM EDTA
• 200 mM Tris-HCl pH 7,5
• 100 mM NaH2PO4.2H2O

Solución de Denhardt (100x)

• 10 g de Ficoll
• 10 g de PVP (polivinilpirrolidina)
• 10 g de albúmina de suero bovino (BSA)

.

• 500 mL de dH2O estéril

7) Incubar los portaobjetos durante 1 h en una cámara de hibridación humidificada a la temperatura de hibridación deseada. Las temperaturas típicas de hibridación oscilan entre 55-62°C.
8) Diluir las sondas en solución de hibridación en tubos PCR. Calentar a 95°C durante 2 minutos en un bloque de PCR para desnaturalizar la sonda de ARN o ADN. Enfriar inmediatamente en hielo para evitar la reconexión.
9) Escurrir la solución de hibridación. Añadir 50-100 μL de sonda diluida por sección, cubriendo toda la muestra. Incubar en la cámara de hibridación humidificada a 65°C durante la noche. Cubra la muestra con un cubreobjetos para evitar la evaporación.

Durante este paso, la sonda de ARN hibridará con el ARNm correspondiente, o la sonda de ADN hibridará con el ADN celular correspondiente. Optimice la temperatura de hibridación en función de la secuencia de la sonda utilizada, así como del tipo de célula o tejido. Esta temperatura debe optimizarse para cada tipo de tejido analizado.

La temperatura de hibridación óptima para las sondas depende del porcentaje de bases presentes en la secuencia objetivo. La concentración de citosina y guanina en la secuencia son factores importantes.

10) Lavados de rigor

Los parámetros de la solución, como la temperatura, la sal y la concentración de detergente, pueden manipularse para eliminar las interacciones no específicas.

Para preparar 1 L de citrato sódico salino 20x (SSC)

• 175,3 g de NaCl (3 M)
• 88.2 g de citrato de sodio
• 800 mL de dH2O estéril
• Ajustar a pH 5 usando ácido cítrico, llenar hasta 1 L y autoclavar

Lavar 1

• 50% de formamida en 2x SSC
• 3×5 min, 37-45°C

Lavar el exceso de sonda y tampón de hibridación con temperaturas más altas (hasta 65°C) durante períodos cortos de tiempo. Si se deja demasiado tiempo esto puede lavar demasiado de la sonda hibridada ARN/ARN.

Lavado 2

• 0,1-2x SSC
• 3×5 min, 25-75°C

Este paso elimina la hibridación no específica y/o repetitiva de ADN/ARN.

Siga estas directrices para optimizar la temperatura y la concentración de sal para los lavados de rigor:

• Para sondas de ADN/ARN muy cortas (0.5-3 kb) o sondas muy complejas, la temperatura de lavado debe ser más baja (hasta 45°C) y la rigurosidad más baja (1-2x SSC).
• Para sondas de un solo locus o grandes, la temperatura debe ser de alrededor de 65°C y la rigurosidad alta (por debajo de 0.5x SSC).
• La temperatura y la rigurosidad deben ser mayores para las sondas repetitivas (como las repeticiones de satélites alfa).

11) Lavar dos veces en MABT (tampón de ácido maleico con Tween 20) durante 30 minutos a temperatura ambiente. El MABT es más suave que el PBS y es más adecuado para la detección de ácidos nucleicos.

Para preparar 5x de stock de MABT

• 58 g de ácido maleico
• 43,5 g de NaCl
• 55 g de Tween-20
• 900 mL de agua

Llevar el pH a 7,5 añadiendo base Tris. Se necesitarán unos 100 g. Llevar el volumen final a 1 L.

12) Secar los portaobjetos.
13) Transferir a una cámara humidificada y añadir 200 µL de tampón de bloqueo a cada sección (MABT + 2% BSA, leche o suero). Bloquear durante 1-2 h a temperatura ambiente.
14) Escurrir el tampón de bloqueo. Añadir el anticuerpo anti-etiqueta a la dilución requerida en el tampón de bloqueo. Consultar la ficha técnica del anticuerpo para conocer la concentración/dilución recomendada. Incubar durante 1-2 h a temperatura ambiente.
15) Lavar los portaobjetos 5×10 min con MABT a temperatura ambiente.
16) Lavar los portaobjetos 2×10 min cada uno a temperatura ambiente con tampón de pretinción (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2).
17) Para la detección por fluorescencia, pasar al paso 18. Para otras formas de detección, devuelva los portaobjetos a la cámara humidificada y siga las instrucciones del fabricante para el desarrollo del color.

18) Enjuague los portaobjetos en agua destilada.
19) Secar al aire los portaobjetos durante 30 min. Lavar en etanol 100% y secar al aire completamente.
20) Montar utilizando la solución de montaje DePeX.