Genes CITM y DHAM de la AmpC β-Lactamasa mediada por plásmidos entre aislados clínicos Gram-Negativos

Antecedentes

La resistencia a los fármacos entre algunas de las bacterias Gram-negativas (Enterobacterales, Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa) ha surgido y se ha extendido por todo el mundo. Dentro de la familia Enterobacterales, Escherichia coli y Klebsiella spp. son organismos frecuentemente aislados que presentan notables propiedades de resistencia a los fármacos. Los β-lactámicos son los fármacos comúnmente prescritos contra estas cepas recalcitrantes, y por sí solos constituyen alrededor de dos tercios de las prescripciones clínicas recientes.1 Este grupo contiene cuatro clases químicas principales: penicilinas, cefalosporinas, carbapenems y monobactámicos, en los que los carbapenems se utilizan como fármacos de último recurso en la terapia empírica contra cepas patógenas de bacterias Gram-positivas, Gram-negativas y anaerobias.2

La resistencia a los β-lactámicos se atribuye a la producción de β-lactamasas, aquellas enzimas hidrolíticas que son capaces de inactivar los antibióticos antes de que lleguen a las proteínas de unión a la penicilina (PBP) localizadas en la membrana citoplasmática.3 Las principales familias de β-lactamasas incluyen las β-lactamasas de espectro extendido mediadas por plásmidos (ESBLs), AmpC, cefalosporinasas y carbapenemasas. Todas las clases se han detectado en todo el mundo y algunas de ellas se concentran en países específicos.1

Los genes que codifican la β-lactamasa AmpC se han extendido ampliamente y se detectan en plásmidos bacterianos. La primera variante de AmpC codificada en un plásmido se identificó por primera vez en 1989 en una Klebsiella pneumoniae aislada en Corea del Sur. Se denominó CMY-1 por su rasgo fenotípico asociado a la cefamicinasa y era notoriamente resistente a la cefoxitina.4,5 En poco tiempo se detectaron muchas familias de variantes de AmpC mediadas por plásmidos, predominantemente de los aislados de K. pneumoniae y E. coli. Las bacterias que poseían genotipos AmpC mediados por plásmidos se atribuyeron sobre la base de la homología en la secuencia de ácidos nucleicos, formando un mayor número de géneros bacterianos que actuaron como fuente de estos plásmidos y una serie de familias AmpC.6 Hasta la fecha, se han notificado en todo el mundo las siguientes familias de AmpC: dos familias de β-lactamasas CMY (CMY-1 y CMY-2) aisladas de Aeromonas hydrophila y Citrobacter freundii, respectivamente; las enzimas de tipo FOX y MOX aisladas de Aeromonas spp.la familia ACC derivada de H. alvei; la familia LAT de cefalosporinasas aisladas de C. freundii; las familias MIR y ACT originadas en Enterobacter spp. y la familia DHA aislada de Morganella morganii.4,6,7 La mayoría de los genes AmpC codificados por plásmidos se encuentran en aislados de E. coli y K. pneumoniae en infecciones nosocomiales, mientras que la resistencia entre otras bacterias Gram negativas como E. cloacae, C. freundii, S. marcescens y M. morganii la confieren las β-lactamasas AmpC mediadas por cromosomas, aumentando así la resistencia a las cefalosporinas de amplio espectro.8 Los organismos que producen BLEE, a menudo caracterizados por la coexpresión con las AmpC β-lactamasas, suponen una grave amenaza en el diagnóstico y el tratamiento de los patógenos.

Además, los genes de las AmpC β-lactamasas, especialmente MOXM, CITM, DHAM, EBCM, FOXM y ACCM, son responsables del desarrollo de la resistencia de amplio espectro a la mayoría de las β-lactamasas (distintas de la cefepima y los carbapenems). Además, la adquisición de estos genes en las bacterias puede aumentar aún más la resistencia porque los inhibidores de las enzimas de clase A (incluidos el ácido clavulánico, el sulbactam y el tazobactam) y el p-cloromercuribenzoato no son eficaces contra las β-lactamasas AmpC, aunque algunas de ellas pueden ser inhibidas por el tazobactam o el sulbactam.6

Aunque se realizan esfuerzos para frenar el crecimiento y la propagación de los patógenos resistentes a los medicamentos, los estudios sobre las AmpC β-lactamasas en entornos con recursos limitados son todavía inadecuados. El paso más importante para hacer frente a la creciente resistencia a los antimicrobianos (AMR) es la detección precisa de cepas patógenas (y/o resistentes) en los laboratorios de diagnóstico. Sin embargo, los protocolos de laboratorio para la elaboración de informes de rutina no ofrecen el resultado preciso en Nepal porque las β-lactamasas AmpC son difíciles de identificar sólo mediante pruebas fenotípicas y a menudo se detectan falsamente como BLEE en los laboratorios clínicos. Los aislados de Enterobacterales que son positivos en la prueba de cribado del fenotipo de BLEE pero negativos en la prueba de confirmación suelen considerarse productores potenciales de AmpC β-lactamasas, ya sea por depresión cromosómica o por transferencia de plásmidos.9

Incluso los microbiólogos clínicos expertos no logran identificar las AmpC β-lactamasas mediadas por plásmidos, lo que sugiere la necesidad de un método más preciso y específico para su rápida detección. Sin embargo, algunos de estos procedimientos consumen muchos recursos y a menudo requieren reactivos que no son fáciles de conseguir.10 Por estas razones, las AmpC β-lactamasas no se detectan en las muestras clínicas. Por lo tanto, se ha ideado un protocolo de laboratorio más fiable y válido que consiste en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple para facilitar el diagnóstico de los genes AmpC codificados por plásmidos, que son responsables de la expresión de AmpC β-lactamasas en diversas infecciones clínicas.11

La mayoría de los estudios se centran en la prevalencia de las enzimas ESBL en aislados clínicos Gram-negativos en Nepal.12-16 Hay un número limitado de estudios sobre las enzimas AmpC β-lactamasas en bacterias Gram-negativas en Nepal. Un estudio realizado en el valle de Katmandú informó de que el 27,8% de los aislados de Enterobacterales eran productores de AmpC β-lactamasas utilizando el método fenotípico.17 Hasta donde sabemos, hay pocos estudios relacionados con la detección y caracterización de las enzimas AmpC β-lactamasas en bacterias Gram-negativas utilizando métodos fenotípicos y genotípicos en Nepal. Es esencial establecer métodos fenotípicos y genotípicos estándar sobre la prueba de susceptibilidad a los antibióticos para examinar los patógenos resistentes a los medicamentos en los hospitales. Este estudio se llevó a cabo para aislar e identificar los genes de β-lactamasas AmpC (blaCITM y blaDHAM) en los aislados bacterianos Gram-negativos utilizando tanto el cribado fenotípico como los métodos de confirmación.

Métodos

Diseño del estudio

Se trata de un estudio transversal basado en el hospital llevado a cabo de junio de 2017 a enero de 2018 en el Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences (ANIAS). Se recogieron un total de 1151 muestras clínicas no duplicadas que se procesaron durante el período de estudio. Las muestras incluyeron orina (n=412), sangre (n=206), punta de catéter (n=163), pus (n=132), heces (n=89), LCR (n=53), hisopo de herida (n=58) y hisopo vaginal (n=38). Las muestras se obtuvieron en un recipiente estéril, bien etiquetado y a prueba de fugas, y se procesaron lo antes posible.18 Se incluyeron en el estudio todos los pacientes visitantes sospechosos de tener infecciones bacterianas que dieron su consentimiento para participar. Se excluyeron los participantes en el estudio con información demográfica inadecuada.

Cultivo de las muestras e identificación de los aislados

Las muestras se recogieron según las directrices microbiológicas estándar para la recogida de orina, heces, pus, sangre, LCR y punta de catéter. Las muestras elegibles se inocularon además en agar sangre (BA), agar chocolate (CA) y agar MacConkey (MA). Además, las muestras de orina se inocularon en agar UTI cromogénico. Los aislados se identificaron utilizando parámetros microbiológicos estándar como el aspecto morfológico de las colonias, las reacciones de tinción y las propiedades bioquímicas.19,20

Prueba de susceptibilidad a los antibióticos

Todos los aislados Gram negativos identificados se sometieron además a una prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos in vitro utilizando el método de difusión en disco de Kirby-Bauer modificado.21 En primer lugar, los inóculos se hicieron transfiriendo las colonias bacterianas del agar nutritivo a una solución salina normal estéril. La turbidez de los inóculos se fijó en equivalencia con el estándar de 0,5 McFarland, según las directrices del CLSI. El cultivo de alfombra de los inóculos de prueba también se preparó en agar Muller-Hinton (MHA). Los discos de antibióticos (HiMedia India Pvt. Ltd, Bengaluru, India) se utilizaron en las siguientes proporciones amoxicilina (10 μg), azitromicina (10 μg), amikacina (30 μg), aztreonam (30 μg), cefoxitina (30 μg), ceftazidima (30 μg), ciprofloxacina (5 μg), imipenem (10 μg), piperacilina/tazobactam (100/10 μg), ertapenem (10 μg), meropenem (10 μg), cotrimoxazol (25 μg) y cefepima (30 μg). La placa inoculada se incubó aeróbicamente a 37°C hasta 18 horas. Tras una incubación suficiente, se midieron las zonas de inhibición (ZOI) alrededor de los discos y el resultado se clasificó como sensible, intermedio o resistente.21 Los aislados que mostraban resistencia a tres o más antibióticos de diferentes clases se interpretaron como multirresistentes.22

Cribado de AmpC β-Lactamasas

Los aislados se sometieron en primer lugar a un cribado para la posible producción de AmpC β-Lactamasas según las directrices del CLSI, 2019.23 Para el cribado, se sometieron ceftazidima o cefotaxima o cefoxitina o ceftriaxona, cada una de 30 µg, en las pruebas de AST y los organismos resistentes a esos antibióticos (que mostraban una zona de inhibición de diámetro ≤ 18 mm) se cribaron como posibles productores de AmpC y se sometieron a más pruebas confirmatorias.

Confirmación para AmpC β-Lactamasas

Los productores positivos de AmpC β-lactamasas se confirmaron mediante la prueba de disco de AmpC y la prueba confirmatoria basada en inhibidores (prueba del ácido borónico).

En la prueba del ácido borónico, el cultivo de alfombra del organismo de prueba se realizó en placa MHA tomando soluciones de 0,5 McFarland. Se colocaron dos discos de cefoxitina (30µg), uno de los cuales se añadió con ácido fenilbórico (400 µg), sobre el cultivo en alfombra en placa MHA y se incubaron y se interpretaron los resultados. Si había un aumento de la zona de inhibición de ≥5 mm cuando se evaluaba el disco de antibiótico deseado (ceftazidima o cefotaxima) en combinación con ácido fenilbórico que durante el ensayo sin la combinación (disco de antibiótico solo), el aislado se marcaba como prueba confirmatoria positiva.

En la prueba de aproximación de discos, se colocaron discos sobre el cultivo de alfombra de E. coli ATCC 25922. Se colocó un disco de 30μg de ceftazidima en el centro de la placa, seguido de discos de 10μg de imipenem, 30μg de cefoxitina y 20/10μg de amoxicilina/clavulanato que se colocaron a una distancia de 20 mm del disco de ceftazidima. Se añadieron las colonias del organismo de prueba a un disco y luego se invirtió la placa y se incubó durante 24 horas a 37°C aeróbicamente. Cualquier hendidura o aplanamiento de la ZOI indicaba la producción de AmpC β-lactamasa por parte de los aislados.20,24

Conservación de aislados AmpC β-lactamasa positivos

Se utilizó el método de preparación de caldo de glicerol para la conservación. Los organismos se conservaron en caldo de soja tríptica (TSB) con un 40% de glicerol y se almacenaron a -20ºC.25

Extracción de ADN plasmídico crudo

Se inoculó una colonia aislada del organismo de prueba en caldo Luria Bertani (LB). El inóculo se incubó aeróbicamente utilizando un agitador de baño de agua a 37°C durante 18-24 horas. El cultivo puro así obtenido se sometió al método de lisis alcalina para extraer el ADN plasmídico. El ADN plasmídico extraído se suspendió en tampón TE y se almacenó a -20°C hasta su posterior investigación.26

Amplificación de los genes de las β-lactamasas AmpC (blaCITM y blaDHAM) por PCR

Los genes de las β-lactamasas AmpC (blaCITM y blaDHAM) se amplificaron por PCR utilizando la preparación de ADN plasmídico como plantilla. Los cebadores utilizados para el gen blaCITM fueron CLR5-F (5ʹ TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA -3ʹ) y CLR5-R (5ʹ-. TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC -3ʹ) como cebadores directos e inversos respectivamente, mientras que los cebadores para el gen blaDHAM fueron la secuencia directa DHAM para (5ʹ AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG -3ʹ) y la secuencia inversa DHAM_rev (3ʹ CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC -5ʹ).11 El volumen de la reacción se fijó en 25µL añadiendo 12,5µL de la mezcla maestra 1X (5× HOT FIREPol Blend Master Mix Ready to Load, Solis BioDyne, Estonia), 0,5µL de cada uno de los cebadores directo e inverso y 4µL de plantilla de ADN y ddH2O 7,5µL. La amplificación por PCR optimizada de ambos genes fue de 94ºC durante 3 minutos para la desnaturalización inicial; 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos; 25 ciclos de recocido a 62ºC durante 30 segundos; 35 ciclos de extensión a 72º durante 1 minuto; y extensión final a 72ºC durante 7 minutos.11,27

Purificación del ADN

El ADN del plásmido se purificó por el método de precipitación con etanol. En este método, el pellet de ADN se enjuagó con etanol al 70% helado y se dejó secar durante 10 minutos para facilitar la evaporación del alcohol. El pellet de ADN se suspendió en una solución tampón que contenía Tris, EDTA y RNasas para eliminar las impurezas restantes.

Detección de los productos de la PCR mediante electroforesis en gel

Los productos amplificados se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% teñido con 0,1µl de bromuro de etidio. Tras la preparación del gel, se añadieron 2µl de una escalera de ADN de 100 pb en el primer pozo como marcador, 2µl de control negativo en otro pozo, 2µl de control positivo en otro pozo y 2µl de productos de PCR en los pozos restantes. Finalmente, el gel se visualizó bajo el transiluminador UV.28

Control de calidad

Se adoptó un procedimiento aséptico estándar para los procedimientos de este estudio. Todos los lotes de los medios de cultivo y los reactivos químicos se procesaron con técnicas asépticas siguiendo las directrices del CLSI. En el LAP, el control de calidad se mantuvo utilizando las cepas de control de E. coli ATCC 25922. Durante la PCR, el control de calidad se aseguró mediante el uso de aislados de Klebsiella portadores de los dos genes en cuestión, mientras que los controles en blanco o negativos se prepararon sin la aplicación de ácidos nucleicos. Todos estos controles se utilizaron en cada lote del ensayo de PCR.

Análisis estadístico

Los datos se introdujeron y analizaron mediante el software SPSS versión 24.0. Se exploraron las asociaciones mediante pruebas de Chi-cuadrado con un intervalo de confianza (IC) del 95% entre las variables demográficas, como el sexo y la edad de los sujetos.

Resultados

Carácter demográfico y clínico de los pacientes incluidos

Entre los 1151 pacientes incluidos, el 54,2% (624/1151) eran hombres y el 45,8% (527/1151) eran mujeres. De los 253 crecimientos bacterianos, el 47,8% (121/253) eran de varones y el 52,2% (132/253) de mujeres. Del total (253) crecimientos bacterianos, el 26,1% (66/253) procedían de muestras de orina, seguidas de las puntas de catéter (17,4%; 44/253), sangre (16,2%; 41/253), pus (11,9%; 30/253) e hisopos de heridas (10,7%; 27/253). En cuanto a la distribución por edades de los pacientes, el mayor crecimiento de patógenos bacterianos se encontró en el grupo de edad de 16 a 45 años (39,5%; 100/253), seguido por el de 46 a 60 años (30,1%; 76/253), el de >60 años (24,1%; 61/253) y el de 0 a 15 años (6,3%; 16/253), respectivamente (Tabla 1).

Tabla 1 Carácter demográfico y clínico de los pacientes que acuden al Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences

Distribución de los aislados bacterianos en las muestras clínicas

En un total de 1151 muestras clínicas, el 22% (253/1151) mostraron crecimiento en los medios de cultivo. De los 253 aislados bacterianos, la mayoría (89,3%; 226/253) eran bacterias Gram negativas. Entre el crecimiento bacteriano, E. coli (28,5%; 72/253) fue el organismo predominante, seguido de Pseudomonas aeruginosa (16,2%; 41/253), Acinetobacter baumannii (15,8%; 40/253), bacterias Gram-positivas (10,7%; 27/253), Klebsiella pneumoniae (9,9%; 25/253) y Klebsiella oxytoca (4.7%; 12/253) (Figura 1)

Figura 1 Distribución de los géneros bacterianos en las muestras clínicas con cultivo positivo (n=253).

Patrón de susceptibilidad a los antibióticos de las bacterias gramnegativas aisladas

De los 226 aislados de bacterias gramnegativas, el 66.El 66,8% (151/226) fue resistente a la cefoxitina, seguido de la ceftazidima (58,4%; 132/226), la ciprofloxacina (53,5%; 121/226) y la cefepima (51.8%; 117/226), mientras que los aislados fueron más sensibles a meropenem (69%; 156/226), ertapenem (68,6%; 155/226), imipenem (66,8%; 151/226), amikacina (61,1%; 138/226), piperacilina/tazobactam (56,6%; 128/226) y azitromicina (53.1%; 120/226) (Tabla 2).

Tabla 2 Patrón de susceptibilidad a los antibióticos de los aislados de bacterias gramnegativas (n=226)

Patrón de resistencia a múltiples fármacos (MDR) en los aislados

De 226 aislados, el 46.9% (106/226) de los aislados eran MDR. El mayor porcentaje de MDR se encontró entre E. coli (31,1%; 33/106), seguido de P. aeruginosa (20,8%; 22/106), A. baumannii (18,9%; 20/106), K. pneumoniae (9,4%; 10/106) y K. oxytoca (4,7%; 5/106) respectivamente (Figura 2). En las especies individuales, el mayor porcentaje de multirresistencia se encontró entre C. freundii (100%; 8/8) seguido de P. aeruginosa (53,6% 22/41), C. koseri (50%; 2/4), A. baumannii (50%; 20/40) y E. coli (45,8% 33/72), respectivamente (Figura 2).

Figura 2 Distribución de las bacterias MDR y % global de MDR y MDR dentro de cada especie.

Detección de AmpC mediante diversas pruebas

De 226 aislados Gram negativos, el 50% (113/226) mostraron resistencia frente a cefoxitina. Los aislados productores de β-lactamasas AmpC se confirmaron mediante dos pruebas confirmatorias diferentes, las pruebas de disco y las pruebas de ácido borónico. De los noventa y un aislados, el 91,2% (83/91) mostraron un resultado positivo en ambas pruebas y el 8,8% (8/91) de los aislados mostraron un resultado positivo sólo en la prueba de ácido borónico confirmado por al menos una prueba y fueron considerados como productores de AmpC β-lactamasas.

Prevalencia de los genes blaCITM y blaDHAM en aislados gramnegativos productores de AmpC

En el ensayo de PCR, el 90,1% (82/91) y el 87,91% (80/91) de los aislados resultaron positivos para blaCITM y blaDHAM. Respectivamente, se detectaron los genes blaCITM y blaDHAM amplificados con su tamaño de amplicón 465bp y 405bp (Figuras 3 y 4).

Figura 3 Electroforesis en gel de agarosa (1,5%) utilizada para la separación de los productos de la PCR. Carril 2, control positivo; los carriles 3, 5 y 7 son CITM positivos; los carriles 4 y 6, CITM negativos; y el carril 8. control negativo.

Figura 4 Electroforesis en gel de agarosa (1,5%) utilizada para la separación de los productos de la PCR. Carril 2, control positivo; los carriles 3, 4, 6 y 7 son Dham positivos; el carril 5, Dham negativo; y el carril 8, control negativo.

Distribución de los genes AmpC β-Lactamasa, blaCITM y blaDHAM entre los aislados gramnegativos y su relación con el sexo, la edad, las muestras clínicas y los aislados clínicos

De los 91 productores de AmpC, el 50,6% (46/91) de los aislados procedían de mujeres y el 49,4% (45/91) de hombres. Del mismo modo, se obtuvieron porcentajes iguales (50%; 41/82) de genes blaCITM de especímenes de ambos géneros, mientras que se detectaron 51,3% (41/80) y 48,7% (39/80) de genes blaDHAM en los especímenes obtenidos de pacientes masculinos y femeninos respectivamente. No hubo ninguna asociación significativa del sexo del paciente con la producción de enzimas AmpC y genes AmpC (Tabla 3).

Tabla 3 Distribución de los genes AmpC β-Lactamasa, CITM y DHAM entre los aislados bacterianos Gram-Negativos y su relación con el género, la edad y los especímenes clínicos

El mayor número de productores de AmpC β-Lactamasa (40.7%; 37/91) y la prevalencia de aislados productores de blaCITM (40,2%; 33/82) y blaDHAM (41,2%; 33/80) se obtuvieron del grupo de edad (46-60) años, seguido de (16-45) años (30,8%; 28/91), (29,3%;24/82) y 31,3%; 25/80) respectivamente. Hubo una asociación significativa entre la producción de la enzima β-lactamasa AmpC y el grupo de edad (p=0,01) mientras que otros factores, incluyendo la adquisición de los genes blaCITM y blaDHAM, no tuvieron una asociación significativa con la edad del paciente (Tabla 3).

Entre las muestras clínicas, el mayor número de aislados productores de β-lactamasas AmpC (20,9%; 19/91) se detectaron a partir de sangre y puntas de catéter, seguidos de orina (18,7%; 17/91), pus (13,3%; 12/91) e hisopos de heridas (9,9%; 9/91). Del mismo modo, el mayor número de aislados productores de blaCITM y blaDHAM se detectó en las puntas de catéter (21,9%; 18/82); (22,5%; 18/80), seguidos de la sangre (19,5%; 16/82); (21,3%; 17/80) la orina (17,0%; 14/82); (17,5%; 14/80) y el pus (13,4%; 11/82); (8,8%; 7/80), respectivamente. No hubo asociación significativa entre las muestras clínicas, la producción de β-lactamasas AmpC y los genes: blaCITM y blaDHAM (Tabla 3).

Distribución de las β-lactamasas AmpC y adquisición de los genes blaCITM y blaDHAM en varias bacterias Gram-Negativas

La mayor prevalencia de las enzimas β-lactamasas AmpC se encontró en E. coli (28,6%; 26/91), seguida de P. aeruginosa (26,4%; 24/91), A. baumannii (13,2%; 12/91) y K. pneumoniae (10,9%; 10/91). La mayor prevalencia de los genes blaCITM y blaDHAM se detectó en E. coli (30,6%; 25/82) (31,3%; 25/80) seguido de P. aeruginosa (25,7%; 21/82), (22,5%; 18/80) A. baumannii (12,2%; 10/82), (12,4%; 10/80) y K. pneumoniae (10,9%; 9/82), (12,4%; 10/80), respectivamente (Tabla 3).

Discusión

La creciente incidencia de la resistencia a los antimicrobianos sigue siendo uno de los principales problemas de salud pública en los países en desarrollo como Nepal29 que ha conducido a la prolongación de la estancia hospitalaria, el aumento de los costes de tratamiento, la limitación de las opciones terapéuticas y el aumento de la morbilidad y la mortalidad29,30. La producción de β-lactamasas es el principal mecanismo de defensa contra los antibióticos β-lactámicos. Este estudio se llevó a cabo para explorar la presencia de β-lactamasas de clase C (AmpC) en organismos Gram-negativos derivados de muestras clínicas obtenidas en ANIAS, Katmandú, Nepal. Este estudio evaluó además la prevalencia de los genes de β-lactamasas AmpC (blaCITM y blaDHAM) mediante un ensayo de PCR. Se encontró una alta prevalencia de estas enzimas y genes, aunque la prevalencia de dichas enzimas varió de una región geográfica a otra, dentro y entre los países.

De 1151 muestras clínicas, sólo 253 (21,9%) mostraron un crecimiento significativo de organismos. Del total (253) de crecimiento bacteriano, más del noventa por ciento eran bacterias Gram negativas, siendo E. coli el aislado más predominante entre ellas. Nuestros hallazgos coinciden con estudios anteriores realizados en el Hospital Everest de Baneshwor14 , el Hospital Alka de Jawlakhel31 , el Laboratorio Nacional de Salud Pública de Teku32 , el Colegio Universal de Ciencias Médicas de Bhairahawa33 , el Instituto B.P Koirala de Ciencias de la Salud de Dharan34 , el Colegio Médico Nobel de Biratnagar35 , Nueva Delhi (India)36 , la ciudad de Al-Najaf (Iraq)37 , el Hospital de Referencia de Shashemene (Etiopía)38 y la Ciudad de México (México)39 . Se observó una tasa ligeramente superior de infecciones bacterianas gramnegativas entre los pacientes femeninos, lo que podría deberse a una mayor prevalencia de infecciones del tracto urinario entre las mujeres. Esto coincide con estudios anteriores realizados en el Hospital Modelo de Katmandú17 y en Andra-Pradesh (India).40 En consonancia con este estudio, en un estudio realizado en el estado de Uttar Pradesh (India) se notificó una mayor tasa de infecciones por pus en los casos postoperatorios en las mujeres (63,33%) que en los hombres (43,75%).41

En este estudio, los aislados de bacterias Gram negativas mostraron una mayor resistencia a los siguientes antibióticos: cefoxitina, ceftazidima, ciprofloxacina y cefepima, seguidos de cotrimoxazol, mientras que meropenem, imipenem, piperacilina-tazobactam y azitromicina fueron los antibióticos más sensibles. Se observó un patrón comparable en algunos de los hallazgos anteriores del Colegio Médico de Chitwan, Chitwan,42 el Hospital Padma, Pokhara.43 La cefoxitina y la ceftazidima con bajas tasas de susceptibilidad son los fármacos de primera línea que son fácilmente hidrolizados por las enzimas bacterianas y son menos útiles en el tratamiento de las infecciones causadas por patógenos Gram-negativos. Al igual que en nuestro estudio, el imipenem y el meropenem fueron los fármacos más sensibles en estudios anteriores realizados en el Hospital Modelo de Katmandú17 , en Madrid (España)44 y en Wisconsin (EE.UU.)45. La resistencia a los antimicrobianos (AMR), con la creciente propagación de la MDR, es una preocupación mundial, y su impacto es mayor en los países de ingresos bajos y medios, donde la carga de las enfermedades infecciosas es elevada30. El tratamiento de los microbios MDR es caro y difícil y se ve agravado por la alta prevalencia de las infecciones nosocomiales.46 En este estudio, casi la mitad de los aislados Gram-negativos (46,9%; 106/226) resultaron ser MDR. En otros estudios realizados en Katmandú46-49 y en otros distritos de Nepal se ha informado de una mayor prevalencia de bacterias MDR.15,50,51 La producción de ESBL, β-lactamasas metálicas (MBL) o β-lactamasas AmpC podría ser la razón de la menor susceptibilidad a la nueva generación de antibióticos.52 Además, la resistencia a múltiples fármacos se produce debido a la agregación y expresión de diferentes genes en plásmidos resistentes (R) o genes que codifican bombas de eflujo de múltiples fármacos.53 Además, los genes responsables de la expresión de las enzimas β-lactamasas se asocian constantemente con los antibióticos no β-lactámicos como los aminoglucósidos y las fluoroquinolonas.

En este estudio, la producción de AmpC fue mayor entre los pacientes masculinos (41,67%) que entre los femeninos (38,98%). Los hallazgos de este estudio coinciden con otros estudios realizados en Kano, en el noroeste de Nigeria.54 Sin embargo, nuestros hallazgos difieren de los estudios realizados en Benin, Nigeria.55 Muchos estudios han informado de una mayor prevalencia de ITU con multirresistencia entre las mujeres, lo que puede deberse a una mayor prevalencia de patógenos productores de AmpC entre las mujeres, ya que son más propensas a padecer ITU que los hombres.

El uso de la resistencia a la cefoxitina en los laboratorios de diagnóstico sirve como agente/marcador de cribado fiable para detectar la producción de AmpC. Además, este marcador proporciona un buen valor predictivo negativo.

A pesar de su amplio alcance, algunos de los estudios han destacado el uso de cefoxitina como un agente de cribado pobre para la producción de AmpC. Esto podría deberse a la existencia de otros mecanismos alternativos a la AmpC (uno de ellos es la mutación del canal de la porina) que pueden dar lugar a una interpretación falsamente positiva (como resistencia a la cefoxitina).52 Nuestro estudio reveló que un tercio de los aislados Gram negativos (>40%) eran responsables de la producción de AmpC. Los resultados de este estudio contrastan con el estudio del Hospital Modelo de Katmandú.17 La diferencia puede deberse al método de detección fenotípica utilizado en este estudio, que empleó la prueba de resistencia a la cefoxitina y el método de prueba de disco de AmpC utilizando cefoxitina (30µg). La prueba confirmatoria utilizada fue la prueba del ácido fenilborónico utilizando cefoxitina 30µg/400µg de ácido fenilborónico. Los derivados del ácido borónico demostraron ser inhibidores reversibles de las enzimas β-lactamasas AmpC.56

En este estudio, se observó la producción de AmpC en 91 (80,53%) aislados de 113. La tasa de producción de AmpC en nuestro estudio es ligeramente superior a la de otros estudios realizados en el Model Hospital, Katmandú,17 el Chitwan Medical College,57 Bharatpur, Chitwan,58 y la India.59

Para compensar las limitaciones debidas a uno de los métodos, la integración de ambas técnicas en el diagnóstico de rutina puede aumentar la sensibilidad y la especificidad de las pruebas en los entornos clínicos.

Un total de 73 aislados Gram negativos mostraron la presencia de los genes blaCITM y blaDHAM. Estos hallazgos son consistentes con un estudio previo reportado en Ilam, Irán.27 En el tipo de estudio similar reportado en la India, mostró que los genes blaCITM eran más prevalentes en E. coli.60 En nuestro estudio, la prevalencia de los genes asociados a AmpC (blaCITM y blaDHAM) fue investigada por métodos fenotípicos y genotípicos. Este estudio proporciona un amplio análisis de las bacterias Gram negativas asociadas a la producción de β-lactamasas AmpC y sus patrones de susceptibilidad a los antibióticos entre los aislados clínicos. Los resultados de este estudio son importantes para informar sobre los patrones de resistencia de diversos organismos a las cefalosporinas. La vigilancia de la resistencia a múltiples fármacos con β-lactamasas, incluida la producción de ESBL, MBL y AmpC, es necesaria para una práctica clínica rutinaria con el fin de optimizar el tratamiento y prevenir una mayor resistencia entre los antibióticos β-lactámicos.13,61,62

Fortalezas y limitaciones

Este es el primer estudio que explora los genes de β-lactamasas AmpC (blaCITM y blaDHAM) utilizando tanto la prueba fenotípica como la molecular entre los pacientes que asisten a un centro de salud terciario de Nepal. Los hallazgos de este estudio pueden informar la política antimicrobiana para los centros de atención terciaria, incluyendo la preparación del manejo de las infecciones hospitalarias, el protocolo de tratamiento y el procedimiento de diagnóstico. Este estudio tiene algunas limitaciones, como la investigación de un número limitado de β-lactamasas AmpC, la corta duración del estudio y el hecho de que se haya realizado en un único centro de atención terciaria. Los estudios futuros pueden basarse en él para realizar un estudio longitudinal en múltiples centros de atención terciaria con la exploración de todas las β-lactamasas como ESBL, MBL, KPC y los principales genes responsables de la resistencia. No obstante, como primer estudio de este tipo que triangula los métodos fenotípicos y moleculares, este estudio será una valiosa referencia para futuros estudios sobre las β-lactamasas AmpC y la prevalencia de los genes blaCITM y blaDHAM en otros entornos/hospitales de Nepal.

Conclusión

Nuestros hallazgos muestran que la reducida susceptibilidad a la cefoxitina en los aislados Gram-negativos está vinculada a la presencia de genes AmpC mediados por plásmidos. Como no existe un único método definitivo, se sugiere utilizar varios métodos de detección fenotípica simultáneamente para la detección precisa de las bacterias productoras de AmpC β-lactamasas. En este estudio, la PCR detectó casi el 90% de los genes de β-lactamasas AmpC (blaCITM y blaDHAM) entre los aislados confirmados fenotípicamente. La alta prevalencia de genes resistentes y MDR entre los aislados Gram-negativos es un signo alarmante, que exige medidas urgentes de intervención para frenar el crecimiento y la propagación de estos aislados.