Genética de la miastenia grave: un estudio de asociación de casos y controles en la población helénica
On noviembre 7, 2021 by adminAbstract
La miastenia grave (MG) es una enfermedad autoinmune heterogénea caracterizada por la producción de autoanticuerpos contra proteínas de la membrana postsináptica, en la unión neuromuscular. La contribución de los factores genéticos a la susceptibilidad a la MG se ha evaluado a través de estudios familiares y de gemelos; sin embargo, el trasfondo genético preciso de la enfermedad sigue siendo esquivo. Hemos llevado a cabo un estudio de asociación de casos y controles en 101 pacientes de MG no emparentados de origen helénico y 101 voluntarios sanos para evaluar la implicación de variantes genéticas comunes en la susceptibilidad a la MG. Nos centramos en tres genes candidatos que han sido claramente asociados con varias enfermedades autoinmunes, con el objetivo de investigar su posible implicación en la patogénesis de la MG. Se trata del factor regulador del interferón 5 (IRF-5), la proteína 3 inducida por el TNFα (TNFAIP3), también conocida como A20, y la interleucina-10 (IL-10), moléculas clave en la regulación de la función inmunitaria. Se reveló una tendencia estadística de asociación () entre los polimorfismos de nucleótido único (SNP) del promotor de la IL-10 y los subgrupos de pacientes con MG de inicio temprano y tardío. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en el resto de las variantes examinadas. Hasta donde sabemos, este es el primer intento mundial de abordar la posible asociación entre las variantes genéticas comunes de IRF-5 y TNFAIP3 y la base genética de la MG.
1. Introducción
La miastenia gravis (MG) es una enfermedad autoinmune órgano-específica causada por autoanticuerpos dirigidos contra proteínas de la membrana postsináptica que conducen a un deterioro de la transmisión neuromuscular. Clínicamente, la MG se caracteriza por una debilidad muscular y una fatiga rápida que se agrava con el ejercicio y se alivia con el descanso. El principal autoantígeno, en el 80-90% de los pacientes con MG, es el receptor de acetilcolina muscular (AChR), un canal pentamérico que media la transducción sináptica en la unión neuromuscular . En varios de los pacientes con MG restantes, se detectan autoanticuerpos contra la tirosina quinasa específica del músculo (MuSK) o contra la proteína 4 relacionada con las lipoproteínas (LRP4). Tanto MuSK como LRP4 forman un complejo receptor que se une al proteoglicano de la matriz extracelular agrina, lo que da lugar a la agrupación de AChR, crítica para la función de la unión neuromuscular.
Aunque la MG es una enfermedad que afecta a ambos sexos, a todas las edades y en todas las razas , la evidencia de varios estudios epidemiológicos ha mostrado una distribución bimodal de la tasa de incidencia dependiente del sexo y de la edad, con un pico en la segunda y tercera décadas de la vida, observado principalmente en las mujeres, y el segundo en la sexta y séptima décadas de la vida que ocurre principalmente en los hombres . Esta observación condujo a la clasificación de la MG en una fase temprana, que aparece antes de los 50 años y suele estar relacionada con la hiperplasia del timo, y en una fase tardía (>50 años), con un timo normal o atrófico.
El grado de contribución genética a la susceptibilidad a la MG se ha evaluado mediante estudios familiares y de gemelos, que reflejan la agrupación familiar de la enfermedad y, posteriormente, la herencia genética. Las altas tasas de concordancia de la MG observadas entre gemelos monocigóticos en comparación con gemelos dicigóticos sugieren fuertemente la participación de factores genéticos en la patogénesis de la MG . Además, varios estudios han informado de que los pacientes con MG pueden estar afectados por otra enfermedad autoinmune, con mayor frecuencia, trastornos tiroideos y artritis reumatoide. Este hallazgo conduce a la hipótesis de que se produce una alteración más generalizada de la función inmunológica.
El complejo del antígeno leucocitario humano (HLA) es la región genómica prominente implicada en la aparición de la MG. Los alelos HLA-A1 y B8 para la clase I y DR3 para la clase II constituyen un haplotipo ancestral denominado «8.1» que se ha asociado de forma reproducible con la aparición temprana de la MG y la hiperplasia tímica. Investigaciones posteriores orientadas a la disección de este haplotipo extendido A1-B8-DR3, condujeron a la identificación del locus MYAS1, una región de 1,2 Mb que abarca 36 genes, en el límite de la clase III y la región proximal de la clase I, excluyendo así los loci de clase II y confirmando la asociación predominante del alelo B8 sobre el de DR3 .
Aparte del HLA, también se han investigado varios loci genéticos no vinculados al HLA en cuanto a su implicación en la susceptibilidad a la MG. Estos hallazgos se han derivado principalmente de estudios de genes candidatos, mientras que los genes que se comunicaron como asociados o no asociados a la MG se discuten en detalle en .
El factor regulador del interferón (IFN) 5 (IRF-5) es un miembro de la familia IRF de factores de transcripción. El IRF-5 es activado por el IFN-α/B y regula al alza un conjunto de citoquinas proinflamatorias, como la IL-6, el TNF-α y la IL-12, mientras que induce además la expresión del gen IFN. Los resultados de varios estudios, revisados en , han implicado al IRF-5 como un gen de susceptibilidad en el LES. La búsqueda de variantes comunes que influyan en los niveles de IRF-5 condujo a la identificación del SNP rs10954213 (c.*555G > A), localizado dentro de la secuencia de señal poliA+ AATAAA en la 3′ UTR. El alelo G interrumpe el sitio de poliadenilación y la transcripción se termina muy abajo, produciendo así transcritos de ARNm IRF-5 más largos y menos estables. Además, una variante de inserción-deleción de 30 pb en el marco (rs60344245) en el sexto exón del IRF-5 determina la formación de dos familias de isoformas proteicas que tienen una capacidad diferencial para iniciar la transcripción de los genes diana del IRF-5 .
La proteína 3 inducida por TNFα (TNFAIP3), también conocida como A20, es una molécula clave en la regulación de retroalimentación negativa de las respuestas dependientes de NF-κB. El efecto inhibidor de TNFAIP3 sobre la señalización de NF-κB se genera a partir de la actividad cooperativa de sus dos dominios de edición de ubiquitina: el dominio de tumor ovárico (OTU) N-terminal, responsable de la deubiquitinación de la proteína que interactúa con el receptor 1 (RIP1), una proteína adaptadora esencial de la vía de señalización inducida por TNF, y el dominio que contiene dedos de zinc C-terminal, que funciona como una ubiquitina ligasa E3 que promueve la degradación proteasomal de RIP1 .
El SNP rs13207033 (g.137965418G > A), situado en la región intergénica 6q23, aproximadamente 185 kb aguas arriba de TNFAIP3, probablemente afecta a la expresión del gen por la presencia de potenciales elementos reguladores del ADN . Otro estudio indicó que un SNP codificador no sinónimo (c.380T > G, rs2230926) que da lugar a un cambio de fenilalanina a cisteína en el residuo 127 (p.F127C), en el dominio OTU de la proteína TNFAIP3, está asociado con el LES entre los individuos de ascendencia europea .
La interleucina 10 (IL-10) es una citoquina pleiotrópica secretada por diferentes tipos de células, como las células T y las de linaje mieloide. La IL-10 se ha caracterizado por ser una citocina antiinflamatoria debido a sus efectos estimulantes sobre las células TH2 y a la supresión simultánea de las células TH1 . Además, la IL-10 induce la proliferación y diferenciación de los linfocitos B activados, lo que conduce a una mayor activación de la respuesta humoral. En la MG autoinmune experimental (EAMG), la administración de IL-10 provocó el aumento de los niveles de anticuerpos anti-AChR, lo que sugiere un papel potenciador de la enfermedad de la IL-10 .
Se han observado varias variantes en la secuencia de flanqueo 5′ del gen humano de la IL-10. Tres SNPs, a saber, rs45552637 (A/C), rs1800872 (T/C) y rs1800896 (A/G), localizados en las posiciones -592, -819 y -1082, respectivamente, determinan la formación de tres haplotipos (GCC, ACC y ATA). La posición de estos SNP se basa en la secuencia U16720, previamente publicada y depositada en la base de datos EMBL-EBI. Un estudio de Turner y colaboradores informó de la correlación de estos haplotipos con la producción de la proteína IL-10 in vitro . En concreto, el genotipo GCC/GCC se asoció con una alta producción de IL-10 inducida por concanavalina A, los genotipos GCC/ACC y GCC/ATA con una producción media y los genotipos ACC/ACC, ATA/ATA y ACC/ATA con una baja producción de IL-10.
En el presente estudio, se adoptó un enfoque basado en hipótesis para evaluar la implicación de ciertas variantes comunes en la susceptibilidad a la MG. Así, se llevó a cabo un estudio de casos y controles de genes candidatos, centrándose en los genes con un papel crítico en la función del sistema inmune, con el objetivo de identificar si las asociaciones previamente reportadas entre los genes mencionados y otras enfermedades autoinmunes podrían ser válidas para la MG.
2. Materiales y métodos
2.1. Población del estudio
En este estudio se inscribieron un total de 101 pacientes de MG no relacionados, todos de ascendencia helénica. Las muestras de sangre de los pacientes con MG se recogieron en el Instituto Pasteur Helénico durante el estudio diagnóstico de rutina. Sólo se incluyeron en nuestro estudio los pacientes con MG con AChR positivo. El diagnóstico de la MG se basó en la presencia de anticuerpos anti-AChR en el suero del paciente, utilizando un ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA). Excluimos intencionadamente del análisis genético a aquellos pacientes que fueron identificados como positivos para autoanticuerpos contra MuSK, con el fin de reducir la heterogeneidad del grupo de estudio. Aunque no se analizaron los sueros de los pacientes con MG en busca de autoanticuerpos anti-LRP4, la ausencia de esta prueba no plantea ningún problema de heterogeneidad en la población del estudio, debido a la rara coexistencia de anticuerpos anti-LRP4 y anti-AChR. Las principales características del grupo de MG anti-AChR (edad de inicio y sexo) se resumen en la Tabla 1. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes. El grupo de control estaba formado por 101 individuos sanos emparejados por etnia y sexo.
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| SD: desviación estándar. | ||||||||||||||||||||||||||||
2.2. Genotipificación
El ADN genómico de cada individuo se extrajo de una muestra de sangre venosa periférica utilizando el kit QIAamp Blood Midi (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se realizaron con el kit KAPA2G Fast HotStart ReadyMix (KAPABIOSYSTEMS, Woburn, MA, USA). Las secuencias de los cebadores se presentan en los materiales suplementarios como Tabla Suplementaria 1 (véase la Tabla 1 en el Material Suplementario disponible en línea en http://dx.doi.org/10.1155/2012/484919), mientras que las condiciones de reacción están disponibles bajo petición.
La amplificación por PCR y el análisis de electroforesis en gel de agarosa se utilizaron para genotipar la variante de inserción/deleción de 30 pb de IRF5.
Se utilizó el ensayo de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) basado en la PCR para la detección del SNP rs2230926 (T > G) en TNFAIP3. Los fragmentos amplificados de 549 pb se digirieron con la enzima de restricción Fnu4HI (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.) y luego se analizaron mediante separación electroforética en un gel de agarosa al 2% p/v. El alelo G crea un sitio de restricción Fnu4HI, lo que da lugar a la digestión de los amplicones en fragmentos de 319 y 230 pb.
La identificación de los genotipos de los SNPs del promotor de la IL-10 se realizó mediante secuenciación directa del ADN por Sanger. Se amplificó por PCR un fragmento de 585 pb que incluía las tres variantes. Los productos de la PCR se purificaron mediante el kit de purificación de PCR PureLink (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) basado en una columna. La secuencia del fragmento de 585 pb se determinó utilizando el kit BigDye Terminator v3.0 en un secuenciador de ADN de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.). Los cebadores utilizados fueron los mismos que para la amplificación de esta región.
Ambos SNPs, rs10954213 (A/G) en el 3′ UTR de IRF5 y rs13207033 (G/A) localizado en una región intergénica de 6q23, se genotipificaron mediante PCR en tiempo real y análisis de curva de fusión de alta resolución (HRM) en un ciclador en tiempo real RotorGene Q (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). La amplificación del fragmento que contiene el SNP de interés se llevó a cabo utilizando el kit de PCR Type-it HRM (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania), según las instrucciones del fabricante. Durante la HRM, la temperatura aumenta de 65 a 95°C, con una tasa de calentamiento de 0,1°C/2 seg, lo que conduce a la desnaturalización de los productos de la PCR y a la generación de curvas de fusión, características para cada genotipo. Dado que un solo cambio de par de bases provoca un cambio significativo en la temperatura de fusión (), la genotipificación se basa en el análisis de los perfiles de fusión: los homocigotos para el alelo A presentan perfiles de fusión similares y con una menor , en comparación con los homocigotos G/G, mientras que los heterocigotos se diferencian por un cambio en la forma de la curva de fusión.
En todos los procesos de genotipificación se incluyeron meticulosamente controles de plantilla. Las muestras de control negativo y positivo se identificaron inicialmente mediante la secuenciación del ADN y, posteriormente, se utilizaron en todos los métodos de genotipado. Cada muestra se analizó por duplicado, excepto las analizadas por PCR-RFLP y secuenciación de ADN.
2.3. Análisis estadístico
Las diferencias en la distribución de genotipos y las frecuencias alélicas entre los casos y los controles se calcularon mediante el análisis o la prueba exacta de Fisher. los valores inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
3. Resultados
Las distribuciones de genotipos de todas las variantes fueron coherentes con el equilibrio de Hardy-Weinberg tanto en los grupos de pacientes como de controles de MG (datos no mostrados).
Las frecuencias alélicas y genotípicas de la variante IRF-5 rs60344245 mostraron una distribución afín en los grupos examinados de 101 pacientes de MG y 100 controles (). En cuanto al SNP IRF-5 rs10954213, se encontró que el genotipo A/G era algo más frecuente en los pacientes con MG que en los controles (54,8% frente a 45,5%), pero el análisis no reveló ninguna diferencia significativa (). Las frecuencias alélicas y genotípicas de ambas variantes del IRF-5 se muestran en la Tabla 2.
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| *El análisis no tuvo éxito en un subconjunto de muestras. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
La frecuencia del genotipo TNFAIP3 rs13207033 G/G mostró un aumento en los controles sanos (44,6%) en comparación con los pacientes con MG (33,3%). Sin embargo, el análisis estadístico no indicó ninguna diferencia significativa entre los dos grupos (). En el caso del SNP codificador rs2230926, los genotipos se distribuyen de forma similar en los 73 pacientes con MG y en los 81 controles examinados, como se deduce del valor . Las frecuencias genotípicas de la variante rs2230926, tanto en los pacientes como en los controles de la MG, coinciden con las derivadas de las muestras de ascendencia europea (CEU) que forman parte del proyecto internacional HapMap. Además, nuestro grupo de estudio exhibió frecuencias de genotipo rs13207033 que son comparables a las frecuencias reportadas en poblaciones europeas, en la base de datos dbSNP. Los resultados del genotipo de las dos variantes del TNFAIP3 se resumen en la Tabla 3.
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| *El análisis no tuvo éxito en un subconjunto de muestras. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
La edad de inicio de la enfermedad también se evaluó dividiendo a los pacientes con MG en pacientes de inicio temprano y tardío. No se detectaron diferencias significativas en la distribución de genotipos entre los dos subgrupos y el grupo de control (datos no mostrados).
El análisis de la secuencia del ADN de la región promotora de la IL-10 mostró que el genotipo ACC/GCC fue el más frecuentemente observado tanto en los pacientes de MG como en los controles (23,72% y 28%, respectivamente), seguido del genotipo de baja secreción ATA/ACC, que se detectó en el 21,62% del total de MG y en el 18% de los controles (Tabla 4). Sin embargo, el presente estudio no reveló ninguna diferencia estadísticamente significativa en la distribución del genotipo de IL-10 entre la cohorte completa de pacientes con MG (es decir, MG total) y el grupo de control (). La comparación entre los subconjuntos según la edad de inicio demostró que el genotipo GCC/GCC de alta secreción de IL-10 se encuentra en una frecuencia baja en la MG de inicio temprano (4%), mientras que está sobrerrepresentado en los casos de MG de inicio tardío (20%) (Tabla 4). Se reveló una tendencia estadística de asociación () entre la distribución del fenotipo de IL-10 y los dos subgrupos de inicio temprano y tardío (Figura 1).
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| aEl análisis no tuvo éxito en un subconjunto de muestras. bOcho muestras de MG eran de edad desconocida en el momento de la aparición. |
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Distribución del fenotipo de IL-10 en los subgrupos de pacientes de MG de inicio temprano y tardío.
4. Discusión
La MG es una enfermedad autoinmune heterogénea con una clara predisposición genética. Además de los loci HLA, varias variantes comunes en los genes no vinculados a HLA se han asociado con la susceptibilidad a la MG . Muchos de estos genes asociados al riesgo están ampliamente distribuidos entre varias enfermedades autoinmunes, lo que apoya la idea de que las enfermedades autoinmunes se caracterizan por compartir vías patogenéticas. En este estudio, realizamos un estudio de asociación de casos y controles para investigar la contribución de las variantes comunes localizadas en los genes IRF-5, TNFAIP3 e IL-10 a la susceptibilidad a la MG. Estos genes se consideraron buenos candidatos debido a su papel crítico en la regulación de la respuesta inmune y a su implicación previamente conocida en el proceso autoinmune . Sólo se incluyeron en el análisis genético los pacientes con anticuerpos anti-AChR en el suero, ya que se espera que representen un subconjunto más homogéneo que el grupo más amplio de MG. Este subgrupo se dividió además en dos entidades distintas de la enfermedad: pacientes con MG de inicio temprano, que comprenden en su mayoría mujeres, y pacientes con MG de inicio tardío, que muestran una mayor proporción de hombres.
Hasta donde sabemos, este es el primer estudio, en cualquier población, que investiga la asociación entre la MG y las variantes comunes de los genes IRF-5 y TNFAIP3. Según estudios anteriores, revisados en , varias variantes en el locus IRF-5 se han asociado de forma reproducible con el LES implicando al IRF-5 como un gen de susceptibilidad en el lupus. Se ha descubierto que el SNP rs10954213 influye en la poliadenilación del ARNm y, por lo tanto, afecta a los niveles de la proteína IRF-5; los homocigotos A/A expresan niveles aproximadamente 5 veces superiores de IRF-5 inmunorreactivo en comparación con los homocigotos G/G. En cuanto a la variante rs60344245, la deleción de 30 pb (GGCCGCCTACTGCAGCCCACTCTGC/-) elimina 10 aminoácidos de la proteína IRF-5 y altera un dominio rico en prolina, ácido glutámico, serina y treonina (PEST). En la familia de proteínas IRF, dichos dominios participan en las interacciones proteicas y también provocan una rápida degradación proteolítica . A pesar de su evidente papel funcional, el presente estudio no pudo demostrar una asociación significativa de las variantes del IRF-5 rs10954213 y rs60344245 con la MG ( y , respectivamente), lo que sugiere que el IRF-5 puede no estar implicado en la patogénesis de la MG.
Además, los hallazgos recientes de los estudios GWA han revelado asociaciones significativas entre las variantes del locus humano TNFAIP3 y un amplio espectro de enfermedades autoinmunes. Un estudio GWA de pacientes con artritis reumatoide, con anticuerpos contra el péptido anticitrulinado, detectó fuertes evidencias de asociación del SNP rs13207033 con el desarrollo de AR . Del mismo modo, un estudio de Musone y colaboradores informó de la asociación del SNP codificador no sinónimo, rs2230926 con el LES . Los estudios funcionales para determinar el impacto biológico del rs2230926 demostraron que la proteína menor Cys127 muestra una menor actividad inhibidora . Sin embargo, se observó una falta de asociación entre la MG y los SNP rs13207033 () y rs2230926 () del TNFAIP3.
En conjunto, nuestros datos podrían indicar que la MG específica de un órgano podría tener un trasfondo genético diferente que llevaría a su separación de un amplio grupo de enfermedades autoinmunes sistémicas que comprenden el LES y la AR . Una explicación alternativa para la falta de asociación en nuestro estudio podría estar relacionada con la insuficiente potencia estadística debido al tamaño relativamente pequeño de las muestras. Como es sabido, las variantes comunes representan una proporción modesta del riesgo genético en relación con las enfermedades autoinmunes. En estos casos, pueden ser necesarias miles de muestras para detectar una señal de asociación que pueda distinguirse del ruido de fondo. Sin embargo, en enfermedades de baja prevalencia, como la MG, el reclutamiento de muestras de gran tamaño es muy difícil. Cabe mencionar que la unidad de diagnóstico de la MG en el Instituto Pasteur Helénico es la única unidad en Grecia que ha recibido y analizado sistemáticamente muestras de sangre desde 1983. Por lo tanto, nuestra colección de muestras de ADN de MG es actualmente la más grande de Grecia y se enriquece constantemente con nuevos casos.
Además, a pesar de la selección específica de los pacientes con antiAChR y su división en inicio temprano y tardío, una clasificación adicional según las anomalías del timo (timoma o hiperplasia) podría haber sido informativa; sin embargo, los datos histológicos no estaban disponibles.
Por último, un resultado inesperado fue la falta de asociación de los SNP del promotor de la IL-10 con la MG. Dado que se supone que estas variantes se encuentran dentro de la región promotora de la IL-10, pueden afectar a la unión de los factores de transcripción que regulan la expresión de la IL-10. Un estudio reciente de Alseth y colaboradores, realizado en la población noruega, reveló una asociación del genotipo ACC/ACC con el subgrupo de pacientes con MG con anticuerpos contra la titina, mientras que se observó un aumento estadísticamente significativo de la frecuencia ATA/ATA en los pacientes con MG de inicio temprano. En nuestro grupo de casos de MG helénica, no se detectó ninguna evidencia de asociación, cuando comparamos la distribución de genotipos entre la cohorte completa de pacientes de MG y el grupo de control (). Sin embargo, el genotipo GCC/GCC reveló una tendencia estadística de asociación con la MG, en los distintos subgrupos de pacientes con MG de inicio temprano y tardío (). Por lo tanto, otros estudios con muestras de mayor tamaño podrían revelar posibles asociaciones de la MG con la IL-10. También cabe destacar el hecho de que las frecuencias alélicas de un determinado SNP pueden variar sustancialmente entre grupos étnicos. La diferencia observada en la frecuencia del genotipo ACC/ACC entre los grupos de control noruego y heleno (3,4% frente al 15%) es un reflejo de esta condición.
En general, este ha sido el primer esfuerzo, hasta donde sabemos, para abordar la posible asociación entre las variantes genéticas comunes de IRF-5 y TNFAIP3 y la base genética de la MG, en cualquier población, mientras que se necesitan más estudios para desentrañar el, todavía en gran medida desconocido, fondo genético de la MG.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los pacientes y voluntarios de MG que participaron en nuestro estudio. Se agradece a Anna Kokla y Maria Belimezi del Instituto Pasteur Helénico su ayuda en la recogida de muestras de pacientes con MG. El presente estudio contó con el apoyo financiero de las subvenciones de la Comisión Europea Fight MG a S. J. Tzartos y GEN2PHEN (FP7-200754) a G. P. Patrinos, con la participación de fondos del proyecto Thales (Autoinmunidad) a S. J. Tzartos y K. Poulas y del proyecto de colaboración bilateral Hellas/Turquía (MuSK-mythenia gravis) a K. Poulas.
Materiales Suplementarios
El Material Suplementario incluye la Tabla Suplementaria 1 que proporciona información sobre los cebadores para la amplificación por PCR de cada variante y su secuencia flanqueante.
- Tabla Suplementaria
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