Ensayos de luciferasa

Entender cómo un promotor o elemento de respuesta puede controlar la expresión de un gen es más fácil cuando se estudia con un gen reportero. Las enzimas luciferasas son ideales para los ensayos reporteros con una detección simple basada en la luz y una alta sensibilidad que puede cuantificar incluso pequeños cambios en la expresión. Aunque los ensayos reporteros se utilizan a menudo para evaluar los cambios en la actividad del promotor, también pueden utilizarse para investigar la transducción de señales, la función de las proteínas, la regulación de los miARN e incluso la medición en tiempo real de los procesos en los organismos vivos.

La base de un ensayo reportero es el vector, que lleva el gen reportero, y los reactivos de detección que proporcionan un sustrato para convertir la actividad de la enzima luciferasa en una señal luminosa. Los reactivos de detección de doble luciferasa apagan la primera señal del reportero antes de leer la segunda para permitir que se midan dos reporteros secuencialmente a partir de la misma muestra. El segundo reportero se incluye a menudo como control interno para obtener datos más precisos.

Una vez seleccionado el vector reportero y clonado cualquier elemento (si es necesario), el vector se introduce en células cultivadas, normalmente utilizando métodos basados en la transfección, se expresa y se detecta la actividad con reactivos líticos (punto final) o reactivos de células vivas para medir los cambios en las mismas células a lo largo del tiempo. Los ensayos de luciferasa pueden multiplexarse con otros ensayos para evaluar la apoptosis, el metabolismo, etc. La medición de los ensayos de luciferasa se realiza normalmente utilizando un luminómetro basado en placas.