ENSAYO DE PLACAS VIRALES

Materiales:

30ml de cultivo exponencial de células SF9 a 5×105 células/ml

6 placas de pocillos (2 cada una)

1 botella de Gel de Agarosa al 4%

1 botella de SF-900 (1.3X)

1 frasco estéril

0,5ml de sobrenadante de baculovirus

100ml de SFM

1. En condiciones estériles, dispensar 2 ml de suspensión celular por pocillo.

2. Dejar que las células se depositen en el fondo de la placa e incubar, tapadas, a temperatura ambiente durante 1h.

3. Colocar el frasco de gel de agarosa en el baño de agua a 70oC. Colocar el frasco vacío y el SF-900 (1,3X) en el baño de 40oC.

4. Después de 1h de incubación de las placas a RT, observar las monocapas bajo el microscopio invertido para confirmar la fijación de las células y el 50% de confluencia.

5. Producir una dilución en serie de ocho logs del sobrenadante viral cosechado mediante la dilución secuencial de 0,5 ml de la dilución anterior en 4,5 ml de medio SFM en tubos desechables de 12 ml. Deberá concluir con 8 tubos que contengan cada uno una dilución de 10-1 a 10-8 del stock de virus original.

7. Retire secuencialmente el sobrenadante de cada pozo, deséchelo y reemplácelo inmediatamente con 1ml de la dilución de virus respectiva a cada pozo duplicado. Incubar durante 1h aRT.

8. Mover las botellas de los baños de agua a la campana estéril cuando la agarosa tenga líquido (20 a 30 min).Dispensar rápidamente 30 ml del medio SF-900 (1.3X) y 10 ml del agarosegel al 4% a la botella vacía y mezclar suavemente. Vuelva a colocar el frasco de la superposición de placas en el baño de agua a 40oC hasta su uso.

9. Después de esta segunda incubación de 1h, devuelva la botella de agarosa diluida y las placas de 6 pocillos a la campana.

10.Secuencialmente (de mayor a menor dilución) retire el virus de los pocillos y reemplácelo con 2ml de la agarosa diluida. Trabajar rápidamente para evitar la desecación de la monocapa.Una pipeta Pasteur conectada a una bomba de vacío elimina fácilmente los restos de inóculo.

11.Dejar que el gel se endurezca de 10 a 20 min antes de moverlo.

12.Incubar a 27oC en una incubadora humidificada de 4 a 10 días.

13.El virus recombinante produce placas lechosas/grises de ligero contraste visibles sin tinción ni otros métodos de detección.

14.Monitorear las placas diariamente hasta que el número de placas contadas no cambie durante dos días consecutivos.

15.Para determinar el título del inóculo empleado, un rango óptimo para contar es de 3 a 20 placas por pozo de una placa de 6 pozos. El título (ufc/ml) puede calcularse mediante la siguiente fórmula:

16. Superposición de la agarosa con el colorante Natural Red:

Preparar una solución de agarosa al 0,5% en SFM

Añadir una solución de Natural Red hasta una concentración final de 50mg/ml (diluir 3,33mg/ml de stock 1:66,6).

Superponer 1ml de la solución colorante a cada pocillo (en una placa de 6 pocillos).