Apoenzima

5.11.3 Papel de la proteína-Interacciones entre la enzima, la coenzima y el sustrato

En todos los casos, la coenzima se une a la apoenzima sin un cambio profundo en el espectro de absorción. Esta observación sugiere que la enzima no distorsiona el anillo de corrina de su conformación de solución en estado básico. Sin embargo, no se dispone de información sobre la identidad del ligando α-axial a partir del espectro de absorción UV-visible del complejo coenzima-proteína. Los estudios han demostrado que el ligando α-axial 5,6-dimetilbenzimidazol se sustituye por una cadena lateral de histidina de la proteína respectiva en al menos tres enzimas dependientes de cobalamina: metionina sintasa,4,7 metilmalonil-CoA mutasa,8,45,46 y glutamato mutasa.47 En cambio, el ligando 5,6-benzimidazol de la cobalamina sigue ocupando la posición de ligando α-axial en AdoCbl unido a la diol deshidrasa48 y a la ribonucleótido reductasa (véase el capítulo 5.08).

Para acomodar la coordinación por la cadena lateral de histidina, el «bucle nucleotídico» de la base de 5,6-dimetilbenzimidazol, el ribofuranosilfosfodiéster, y la cadena lateral de propionamida deben girar lejos del anillo de corrina e insertarse en un bolsillo de unión dentro de la proteína. La secuencia de consenso DxHxxG se ha identificado en enzimas dependientes de la cobalamina que sustituyen el ligando α-axial por una cadena lateral de histidina.7,49,50 La histidina que se coordina con el átomo de cobalto seguramente interactúa con el residuo de aspartato a través de un enlace de hidrógeno. Más allá del papel de ligando de coordinación, la función exacta de la díada His/Asp como modulador de la actividad enzimática aún no está clara.49 Otros residuos en el sitio activo también pueden participar en una red extendida de enlaces de hidrógeno para controlar la reactividad en el centro metálico.7

Las enzimas dependientes de la adenosilcobalamina deben aumentar la tasa de homolisis del enlace CoC en al menos un factor de 1012 para alcanzar la tasa de catálisis observada.14 La labilización de la adenosilcobalamina exige el debilitamiento del enlace CoC para permitir la fisión homolítica. Aunque no es un concepto probado en las enzimas dependientes de la cobalamina, la energía suficiente para distorsionar (debilitar) el enlace CoC podría provenir fácilmente de la utilización del exceso de energía de unión que se deriva de las múltiples interacciones de enlace de hidrógeno con el cofactor de la cobalamina, incluyendo las cadenas laterales de amida que decoran el anillo de corrina.51 Las cadenas laterales de amida también son elementos importantes de reconocimiento para la unión a las proteínas de transporte de cobalamina no enzimáticas transcobalamina, haptocorrina y factor intrínseco.52 La eliminación o derivatización química de cadenas laterales amidas específicas altera la unión a la transcobalamina entre 3 y 40 veces52 y la eliminación completa de la cadena lateral c-amida permite la introducción de un doble enlace adicional en el esqueleto macrocíclico, aplanando así el anillo de corrina con el consiguiente desplazamiento al rojo del máximo de absorción.53

Además de promover la reacción deseada, las enzimas dependientes de la adenosilcobalamina realizan una segunda función importante al prevenir las reacciones secundarias no deseadas que a menudo acompañan a las reacciones radicales.54 Esta función de catálisis negativa54 exige una superficie de energía libre altamente restringida que podría visualizarse como un profundo cañón a través del cual la reacción progresa a lo largo de la superficie de energía libre. Este cañón debe tener paredes empinadas para evitar reacciones laterales y restringir el intermedio radical altamente reactivo. Al final de la secuencia de reacción, el radical intermedio se apaga mediante la recombinación del radical 5′-desoxiadenosil y la cob(II)alamina, con lo que se regenera el estado básico (estado de reposo) del cofactor adenosilcob(III)alamina. Si la enzima invierte 25 kcal mol-1 para promover la homolisis del enlace C-Co para comenzar el ciclo catalítico, esta energía debe recuperarse al final de la secuencia de reacción. La recuperación de la energía no sería posible si se produjera una secuencia indeseable de reordenamientos para producir un radical que es termodinámicamente más estable que el radical 5′-deoxiadenosilo. Por lo tanto, la enzima debe evitar que el radical alquilo se reordene a un intermedio de baja energía, o que migre a través del andamio proteico para formar un radical estable que no pueda participar en la catálisis.55

Una especie paramagnética no se forma hasta que todos los componentes de la reacción están presentes en el complejo enzima-sustrato, ya que la formación de un radical derivado de la coenzima en ausencia de sustrato podría dar lugar a reacciones secundarias no deseadas. Los experimentos de EPR con la metilmalonil-CoA mutasa46,55 confirman que la homólisis del enlace CoC sólo se produce después de la adición de sustrato, como indica la aparición de una señal de EPR similar a la del producto.46 De forma similar, los experimentos de espectrofotometría de flujo detenido con la etanolamina amoníaco liasa muestran que la firma de la cob(II)alamina aparece en el espectro visible sólo después de que la enzima y la coenzima se combinen con niveles saturantes de sustrato.56-59

La fotólisis, la termólisis y la homólisis promovida por la enzima del enlace CoC de la adeno-silcobalamina dan como resultado el par de radicales singlete formado por la cob(II)alamina y el radical 5′-deoxiadenosilo.60,61 Dado que todos estos procesos conducen a la formación del mismo par de radicales, la información procedente de la dinámica de reacción de los estudios de fotólisis puede relacionarse con los mecanismos de reacción enzimáticos propuestos. La fotohomólisis de la adenosilcobalamina comienza con una promoción electrónica π → π* en el anillo de corrina y debe implicar un estado intermedio de transferencia de carga en el camino hacia la homólisis del enlace CoC.60,61 Los estudios de fotólisis en picosegundos de la adenosilcobalamina revelan tasas de recombinación de pares de radicales geminados de 109 s-1, con eficiencias de recombinación fraccional de la jaula, Fc, de alrededor del 94%.42,62-64 Los estudios de fotólisis en nanosegundos y en onda continua de las cobalaminas confirman la recombinación eficiente de pares de radicales en la jaula geminada, con un rendimiento cuántico fotoquímico global de alrededor del 20% para la adenosilcobalamina y del 35% para la metilcobalamina.65,66 En ausencia de enzimas, una gran fracción de los pares de radicales geminados se recombina antes de que se produzca una separación difusional significativa. Para estabilizar el radical 5′-deoxiadenosilo y promover la catálisis, la enzima debe aumentar la distancia de separación de los pares de radicales, probablemente mediante un cambio conformacional. Cualquiera que sea el mecanismo, la alta tasa de recombinación geminada en el par de radicales exige que una de las funciones de la enzima sea separar los radicales o atrapar temporalmente uno de los radicales para evitar la recombinación prematura.

Aunque los pares de radicales singulares {5′-deoxiadenosil:cob(II)alamina} resultantes tienen estados electrónicos idénticos,59-61,67 la homolisis enzimática del enlace CoC no puede acceder a un estado electrónico excitado y debe comenzar con otro proceso para debilitar el enlace CoC y desplazar el equilibrio hacia la disociación (véase la Sección 5.11.2). La escisión inducida por la tensión no sólo dará lugar a la homólisis del enlace CoC, sino que este proceso también aumentará la distancia de separación del par radical si un componente de la distorsión se produce a lo largo del eje apical del cobalto. Este enfoque de fuerza bruta de estiramiento del enlace CoC puede ser el método más eficiente para lograr tanto la homólisis como una disminución neta de la tasa de recombinación de pares de radicales.

También es posible que la enzima refuerce el enlace CoC y desfavorezca la homólisis comprimiendo la interacción apical Co-α-N. Se estudiaron las propiedades termodinámicas de los análogos de adenosilcobinamida + y +.68 Se observó un enlace CoC más fuerte en + con una distancia de enlace CoN más corta en comparación con la piridina como base α-axial. El enlace CoC más fuerte conduce a un cambio significativo hacia la heterólisis como vía preferida. En este sistema modelo, la enzima en estudio, la metilmalonil-CoA mutasa, debe evitar la heterólisis del CoC o seguir una vía heterolítica.68

En la metionina sintasa, la porción de corrina de la cobalamina está intercalada entre dos dominios de un fragmento de 27 kDa, con la cola del nucleótido penetrando en un bolsillo profundo formado por residuos del dominio C-terminal.7,69,70 Esta secuencia contiene una región de hidrofobicidad moderada que está flanqueada por segmentos hidrofílicos extendidos.71 Se esperan similitudes estructurales entre los dominios que interactúan con el anillo de corrina. El dominio α/β que se une a la mitad inferior del anillo de corrina y aloja la cola extendida del nucleótido (fracción fosfodiéster y grupo 5,6-dimetilbenzimidazol) en la metionina sintasa y la metilmalonil-CoA mutasa también se espera en la glutamato mutasa (vide infra).