Aplicaciones emergentes de las esporas bacterianas en la nanobiotecnología

Las cubiertas de las esporas están compuestas por proteínas, tienen matrices ordenadas de subunidades protoméricas, exhiben autoensamblaje y tienen propiedades protectoras . Como formas de vida metabólicamente inactivas, las esporas pueden sobrevivir indefinidamente en un estado desecado, y de hecho se ha documentado que han sobrevivido intactas durante millones de años . La espora puede resistir temperaturas de hasta 90ºC y la exposición a sustancias químicas nocivas. La mayoría de las bacterias formadoras de esporas (aunque no todas) pertenecen a dos géneros principales: Bacillus y Clostridium. Los Clostridios formadores de esporas, a diferencia de Bacillus, sólo se diferencian en condiciones anaeróbicas, lo que hace que Bacillus sea el género más susceptible de ser estudiado.

Las especies de Bacillus producen una única espora o endospora (a diferencia de las exosporas de los hongos), dentro de la célula bacteriana, mediante un proceso de diferenciación que requiere la acción coordinada de cientos de genes de desarrollo. Las esporas maduras suelen tener una longitud de entre 0,8 y 1,2 μm y una forma esférica o elipsoidal (véase la figura 1A). El único cromosoma bacteriano está condensado en el centro de la espora, conocido como núcleo. El núcleo de la espora está rodeado de capas de membrana lipídica y peptidoglicano modificado, pero la estructura más importante es la cubierta de la espora. Esta cubierta proteinácea laminada proporciona a la espora resistencia a los disolventes orgánicos y a la lisozima. En Bacillus subtilis hay hasta 25 proteínas de recubrimiento diferentes en dos capas de recubrimiento distintas (Figura 1B), la capa interna y la externa, pero en otras especies hay pruebas de que el recubrimiento es menos complejo y en algunos casos puede consistir en sólo unos pocos tipos de proteínas. La estructura y el ensamblaje de la cubierta de las esporas se está convirtiendo en un sistema modelo para comprender los complejos procesos de ensamblaje morfogenético, similar a los estudios clásicos sobre el ensamblaje del fago T4. La capa externa, electrónicamente densa, de la cubierta de B. subtilis está compuesta por 5 polipéptidos principales, CotA (65 kDa), CotB (59 kDa), CotG (24 kDa), CotC (11 kDa) y CotF (8 kDa). CotA es una oxidasa de cobre múltiple y puede acumularse en formas multiméricas (observadas microscópicamente) dentro de las células esporulantes en algunos mutantes defectuosos de la cubierta. Es de suponer que la oligomerización y el autoensamblaje de CotA preceden a la deposición en la superficie de la cubierta de la espora. También se ha demostrado que las proteínas CotG y CotB interactúan covalentemente y, además, CotG y también CotC tienen secuencias de aminoácidos extremadamente inusuales que contienen múltiples repeticiones (>13) de 12-13 aminoácidos ricos en lisinas y tirosinas. Además, muchas de las proteínas de la cubierta de la espora tienen perfiles inusuales, es decir, formas multiméricas y masas moleculares aberrantes, cuando se examinan por SDS-PAGE. Recientemente, se ha demostrado que la capa de la espora es realmente flexible y puede expandirse y contraerse, y esta característica es crítica para la formación de esporas cuando la espora se deshidrata y, del mismo modo, para la germinación cuando la espora se rehidrata. Este aspecto de una estructura autoensamblada es particularmente interesante y podría ofrecer una serie de aplicaciones futuras en la administración de fármacos, la nanofabricación y los revestimientos superficiales.

Endosporas bacterianas. El panel A muestra endosporas de B. subtilis, una de las cuales sigue retenida dentro de la «célula madre» con forma de varilla. En B. subtilis, las esporas miden aproximadamente 1,2 μm de longitud y son elipsoidales. Las esporas liberadas tienen una cubierta protectora transparente conocida como capa de la espora y está formada por hasta 25 componentes protoméricos diferentes ensamblados en capas discretas. El panel B muestra un fraccionamiento típico por SDS-PAGE (12,5%) de las proteínas de la cubierta de las esporas solubilizadas, revelando las especies predominantes.

Ingeniería de la cubierta de las esporas bacterianas

Recientemente se ha informado de una estrategia de ingeniería de las esporas de Bacillus subtilis para mostrar antígenos heterólogos en la superficie de la espora, que se ilustra en la figura 2. Un sistema de visualización basado en esporas ofrece varias ventajas con respecto a los sistemas basados en el uso de células bacterianas, entre las que se incluyen la robustez de la espora bacteriana que permite el almacenamiento en forma desecada, la facilidad de producción, la seguridad y una plataforma tecnológica respaldada por amplias herramientas para la manipulación genética.

Distribución en la superficie de la espora utilizando proteínas de la cubierta de la espora. La espora de B. subtilis se compone de un núcleo interno (amarillo) rodeado por una corteza similar al peptidoglicano (en rojo) y una cubierta proteinácea subdividida en una parte interna (verde) y otra externa (negra). La proteína de fusión, compuesta por una parte portadora (azul) y otra pasajera (púrpura) está expuesta en la superficie de la espora.

En contraste con la gran cantidad de información disponible sobre cómo la expresión de los genes controla la diferenciación de una célula en crecimiento en una espora latente, poco se sabe sobre los mecanismos de incorporación de proteínas a la capa, la naturaleza de los componentes estructurales que forman la parte más externa de la capa y si existen motivos de anclaje. Los primeros intentos de exponer proteínas heterólogas en la superficie de la espora se han centrado en dos componentes de la cubierta, CotB y CotC. En el caso de CotB se sabe que esta proteína de la capa de la espora está localizada en la superficie, mientras que para CotC, en relación con otras proteínas de la capa, esta especie tiene una alta abundancia relativa . La observación de que ambos componentes de la cubierta eran prescindibles para la formación de una espora aparentemente normal, así como para su germinación, fue una característica positiva adicional para elegir a CotB y CotC como potenciales proteínas portadoras.

Inicialmente se seleccionaron dos antígenos como proteínas modelo para mostrar en la superficie de la espora: i) el fragmento C-terminal no tóxico de 459 aminoácidos de la toxina tetánica (TTFC), un péptido bien caracterizado y altamente inmunogénico de 51.8 kDa, codificado por el gen tetC de Clostridium tetani; y ii) la subunidad B de 103 aminoácidos de la toxina termolábil de las cepas enterotoxigénicas de Escherichia coli (LTB), un péptido de 12 kDa, codificado por el gen eltB.

CotB como proteína portadora

Al igual que otros componentes de la capa, CotB se ha asociado a la capa externa sobre la base de pruebas genéticas y sólo recientemente un análisis inmunocitofluorimétrico realizado en esporas intactas ha demostrado que CotB es accesible a los anticuerpos específicos de CotB y, por lo tanto, que es muy probable que esté expuesto en la superficie de la espora .

El gen estructural de CotB, cotB, está bajo el doble control transcripcional de σK y de la proteína de unión al ADN GerE. Como consecuencia, cotB se transcribe sólo en el compartimento de la célula madre de la célula esporulante . Una vez sintetizado en el citoplasma de la célula madre, CotB se ensambla alrededor de la espora en formación de una manera que depende de alguna manera de CotE, CotG y CotH. Por lo tanto, CotB y la proteína heteróloga eventualmente fusionada a ella, no sufren un paso de translocación de la pared celular, típico de los sistemas de visualización en otras bacterias.

CotB tiene una mitad C-terminal fuertemente hidrofílica formada por tres repeticiones de 27 aminoácidos ricos en residuos de serina, lisina y glutamina. Los residuos de serina representan más del 50% de la mitad C-terminal de CotB. Se ha sugerido que los residuos de lisina en las repeticiones de CotB representan sitios de reticulación intra o intermolecular, por analogía con las proteínas del tejido conectivo colágeno y elastina . La proteína CotB tiene una masa molecular deducida de 46 kDa, pero migra en SDS-PAGE como un polipéptido de 59 kDa. Recientemente, la discrepancia entre el peso molecular medido y el deducido se ha explicado demostrando que CotB se sintetiza inicialmente como una especie de 46 kDa, y se convierte en un homodímero de 59 kDa, que conserva los extremos N- y C-terminal predichos a partir de la secuencia de nucleótidos de cotB.

La estrategia para obtener esporas recombinantes de B. subtilis que expresan CotB-TTFC o CotB-LTB en su superficie se basó en (i) el uso del gen cotB y su promotor para la construcción de fusiones traslacionales y (ii) la integración cromosómica de las fusiones de los genes cotB-tetC y cotB-eltB en la secuencia codificante del gen no esencial amyE (Figura 3A) . La colocación de las proteínas de fusión bajo las señales transcripcionales y traslacionales de cotB aseguró el momento correcto de expresión durante la esporulación, mientras que su integración cromosómica garantizó la estabilidad genética de la construcción. Debido a la falta de información sobre el ensamblaje de la capa de CotB y sobre los requisitos de los motivos de anclaje, los intentos iniciales se realizaron posicionando la proteína pasajera en el C-terminal, en el N-terminal o en el centro de CotB (Fig. 3B).

Sistema de visualización en superficie de esporas en B. subtilis . (A) Vista esquemática de la integración de fusiones génicas en el cromosoma. Las barras rojas representan la fusión de genes, las barras grises y verdes representan respectivamente el gen no esencial amyE de B. subtilis utilizado como sitio de integración y el gen de la cloranfenicol acetil transferasa (cat) utilizado como marcador seleccionable. (B) Representación esquemática de las proteínas de fusión utilizando CotB de longitud completa (380 aminoácidos) o CotBΔ105 (275 aminoácidos) o CotC (66 aminoácidos) como proteínas portadoras (todas en azul). Las tres repeticiones de 27 aminoácidos del CotB completo y la parte que queda en el CotBΔ105 están en negro. Las barras de color púrpura representan la parte heteróloga de las fusiones (TTFC o LTB).

Cuando se fusionaron TTFC y LTB con el extremo C-terminal de CotB, las proteínas quiméricas no se ensamblaron correctamente en la superficie de la espora (Isticato y Ricca, sin publicar). Estos fallos iniciales se atribuyeron a una posible inestabilidad de las construcciones, ya sea a nivel del ADN (secuencias repetitivas de ADN) o a nivel de la proteína. Para evitar estos problemas, TTFC y LTB se fusionaron al extremo C-terminal de una forma de CotB eliminada de las tres repeticiones de 27 aminoácidos, CotBΔ105-TTFC (Fig. 3A). En contraste con la versión de longitud completa, la proteína quimérica CotBΔ105-TTFC se ensambló correctamente y se expuso en la superficie de la espora . Un dot blot cuantitativo mostró que cada espora recombinante exponía una cantidad de proteína de fusión CotBΔ105-TTFC igual a 0,00022 pg lo que permite concluir que 1,5 × 103 moléculas quiméricas están presentes en la superficie de cada espora recombinante .

A diferencia de CotBΔ105-TTFC, CotBΔ105-LTB no se ensambló correctamente. La cepa que expresaba esta quimera mostraba eficiencias de esporulación y germinación reducidas y sus esporas no eran resistentes a la lisozima. Estas observaciones, junto con el análisis SDS-PAGE de las proteínas de la cubierta liberadas, sugirieron que la presencia de CotBΔ105-LTB alteraba fuertemente la capa de la cubierta de las esporas. Un análisis in-silico mostró cierta homología entre el producto quimérico (en la región de fusión) y LytF, una endopeptidasa asociada a la pared celular producida por B. subtilis durante el crecimiento vegetativo, planteando así la posibilidad de que el producto quimérico pudiera interferir en la formación adecuada de la capa al degradar algunos componentes de la misma (Mauriello y Ricca, datos no mostrados).

Además de la fusión en el extremo C-terminal descrita anteriormente, la proteína pasajera modelo TTFC se ha fusionado también en el N-terminal y en el centro de CotB (Fig. 3B). En ambos casos se utilizó la forma CotBΔ105 de CotB para evitar los problemas experimentados con la fusión C-terminal (ver arriba). Tanto la fusión N-terminal como la fusión sándwich originaron productos quiméricos que se ensamblaron correctamente en la estructura de la cubierta tanto desde el punto de vista cualitativo como cuantitativo . Al menos en el caso de CotB, se pudo concluir entonces que cuando la proteína pasajera está expuesta no afecta a la visualización en la superficie de la espora.

CotC como proteína portadora

CotC es un componente de 12 kDa, soluble en álcali, de la capa de la espora de B. subtilis, previamente identificado por genética inversa y luego asociado a la capa externa de la capa basándose en pruebas genéticas . CotC se consideró inicialmente como candidato a portador debido a su relativa abundancia en la capa (Figura 1B). Junto con CotG y CotD, CotC representa alrededor del 50% del total de las proteínas de la capa solubilizadas. Estas cantidades relativamente elevadas podrían permitir el ensamblaje de un número significativo de quimeras basadas en CotC en la cubierta, asegurando así un despliegue heterólogo eficiente. La expresión del gen cotC está bajo el control del factor σ específico de la célula madre σK y de los reguladores transcripcionales GerE y SpoIIID. Como en el caso de CotB, CotC también se transcribe en la célula madre y su ensamblaje en la cubierta no requiere la translocación de la membrana. El producto primario del gen cotC es un polipéptido de 66 aminoácidos extremadamente rico en residuos de tirosina (30,3%) y lisina (28,8%) . Sin embargo, recientemente se ha demostrado que CotC se ensambla en al menos cuatro formas proteicas distintas, cuyo tamaño oscila entre 12 y 30 kDa . Dos de ellas, con masas moleculares de 12 y 21 kDa y que corresponden muy probablemente a una forma monomérica y homodimérica de CotC respectivamente, se ensamblan en la espora en formación justo después de su síntesis ocho horas después del inicio de la esporulación. Las otras dos formas, 12,5 y 30 kDa, son probablemente productos de modificaciones postraduccionales de las otras dos formas, que se producen directamente en la superficie de la cubierta durante la maduración de la espora.

En el caso de CotC sólo se han construido hasta ahora fusiones C-terminales (Figura 3B). Tanto las fusiones génicas CotC-TTFC como CotC-LTB se obtuvieron clonando tetC o eltB en marco con el último codón de cotC bajo el control transcripcional y traslacional de la región promotora de cotC. A continuación, la fusión genética se integró en el cromosoma de B. subtilis en el locus amyE mediante recombinación cruzada doble (Figura 3A). Estas dos proteínas quiméricas se ensamblaron en la cubierta de las esporas recombinantes sin mayor efecto en la estructura y/o función de la espora, ya que parecían idénticas a las esporas de tipo salvaje en términos de eficiencia de esporulación y germinación y propiedades de resistencia. El Western blot, el análisis citofluorimétrico y, en el caso de CotC-TTFC, la microscopía de inmunofluorescencia (Figura 4) mostraron que ambas quimeras basadas en CotC se mostraban en la superficie de las esporas recombinantes. Una determinación cuantitativa de las proteínas recombinantes expuestas en las esporas de B. subtilis reveló que ca. 9,7 × 102 y 2,7 × 103 moléculas de CotC-TTFC y CotC-LTB, respectivamente, se extrajeron de cada espora.

Detección de la presencia de CotC-LTB y CotC-TTFC mediante microscopía de inmunofluorescencia. La esporulación de las cepas de B. subtilis se indujo mediante el método de resuspensión, y se tomaron muestras 6 h después del inicio de la esporulación y se analizaron mediante microscopía de inmunofluorescencia como se ha descrito previamente . Las muestras se marcaron con un anticuerpo anti-LTB de ratón seguido de un conjugado IgG-TRITC de ratón (fluoresceína roja, paneles A & B), o con un anticuerpo anti-TTFC de conejo seguido de un conjugado IgG-FITC de conejo (fluoresceína verde, paneles C & D). Paneles A & C, esporas de tipo salvaje; Panel B, esporas isogénicas que expresan CotC-LTB); Panel D, esporas isogénicas que expresan CotC-TTFC.

Aunque CotC parece más abundante que CotB dentro de la cubierta, los sistemas basados en CotC y en CotBΔ105 exponen cantidades comparables de proteínas heterólogas. Este resultado fue algo inesperado, ya que CotC parece ser mucho más abundante que CotB en la cubierta. Una posible explicación proviene del reciente hallazgo de que el extremo C-terminal de CotC no sólo es esencial para la interacción con otras moléculas de CotC, sino también con otros componentes de la cubierta (Isticato y Ricca, manuscrito en preparación) y, por lo tanto, muestra que el uso de CotC como portador aún debe ser optimizado.

Estabilidad de las proteínas visualizadas en esporas

Una de las principales razones para proponer el uso de la espora bacteriana como sistema de visualización favorable es su bien documentada estabilidad. Las esporas pueden almacenarse simplemente a temperatura ambiente durante mucho tiempo sin que se reduzcan sus propiedades de resistencia y estabilidad. Esto sería una propiedad extremadamente útil para una variedad de aplicaciones biotecnológicas. Por ejemplo, si la proteína pasajera es un antígeno, la espora recombinante podría convertirse en una vacuna oral estable al calor ideal para su uso en los países en desarrollo, donde la estabilidad al calor es lo más preocupante debido a la mala distribución y almacenamiento.

Sin embargo, aunque la estabilidad de las esporas está bien documentada, la estabilidad de las proteínas heterólogas expuestas en la superficie de la espora sólo se ha investigado recientemente. Las esporas que expresan CotBΔ105-TTFC (véase más arriba) y las esporas parentales se almacenaron a -80°C, -20°C, +4°C y a temperatura ambiente y se analizaron a diferentes tiempos de almacenamiento de hasta 12 semanas. En todos los casos, la cantidad de proteína heteróloga presente en la superficie de las esporas recombinantes parecía idéntica entre las esporas recién preparadas y las almacenadas hasta 12 semanas (Fig. 5). Estos resultados, que indican que las proteínas heterólogas pueden exponerse de forma estable en la superficie de las esporas recombinantes, confirman el sistema basado en esporas como un enfoque de visualización muy prometedor que podría superar algunos inconvenientes de otros sistemas y que podría encontrar aplicaciones en una variedad de campos biotecnológicos diversos.

Análisis de manchas de proteínas extraídas de esporas de tipo salvaje y de esporas que exponen la quimera CotBΔ 105 -TTFC. Las esporas recién purificadas que expresan la quimera CotBΔ105-TTFC (t0) o después de 4, 8 o 12 semanas (t4, t8 y t12) de almacenamiento a temperatura ambiente se examinaron mediante dot blot de las proteínas de la cubierta de las esporas extraídas. Se indican las concentraciones del TTFC purificado (en nanogramos) y de las proteínas de la cubierta (en microgramos). Las proteínas se cargaron y reaccionaron con anticuerpos monoclonales anti-TTFC (Boeringher), y luego con anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa. Se obtuvieron señales de intensidad similar con esporas recién purificadas y con esporas almacenadas a temperatura ambiente hasta 12 semanas.

Prueba de principio para la vacunación oral utilizando el tétanos como enfermedad modelo

Se han utilizado esporas que expresan CotBΔ105-TTFC para inmunizar ratones por vía oral . La IgG sérica y la sIgA fecal mostraron una clara seroconversión a TTFC. El programa de dosificación utilizó tres conjuntos de tres dosis (1,67 × 1010) a lo largo de 5 semanas y se basó en regímenes optimizados para las inmunizaciones orales . Los títulos de IgG específicos de TTFC al cabo de 33 días (>103) sugerían que éstos se encontraban en niveles de protección y los ratones desafiados con toxina tetánica correspondiente a 10 LD50 estaban totalmente protegidos. De ocho ratones desafiados con una dosis de 20 LD50, siete sobrevivieron, lo que sugiere que éste era el umbral de protección. Se realizó un estudio similar utilizando la inmunización nasal con esporas de CotB-TTFC, pero con una dosis menor y tres inmunizaciones. En este caso, las respuestas de IgG específicas de TTFC fueron menores, pero aún así mostraron seroconversión. Estos estudios demuestran que las esporas modificadas que expresan un antígeno heterólogo pueden utilizarse para una inmunización protectora. Además, aunque las respuestas en las mucosas no son importantes para la protección contra el Clostridium tetani (un patógeno sistémico), son obviamente importantes para los patógenos de las mucosas. Serán necesarios más estudios para optimizar los regímenes de dosificación (menos dosis y menos esporas), pero estos estudios seminales han abierto el camino para el desarrollo contra patógenos específicos de las mucosas. Aunque estos estudios son alentadores y demuestran respuestas humorales, todavía no hay pruebas claras que indiquen respuestas celulares. Sin embargo, se ha demostrado que las esporas se diseminan al GALT y se encuentran en las placas de Peyer (PP) y en los ganglios linfáticos mesentéricos. El pequeño tamaño de la espora (1 μm) le permitiría ser captada por las células M y transportada a las PP donde podría interactuar con las células presentadoras de antígenos. Los estudios iniciales han demostrado que las esporas pueden germinar y persistir durante un corto período de tiempo dentro de los macrófagos intestinales, así como provocar citoquinas Th 1 in vivo, como el IFN-γ .