Accesibilidad y arquitectura de la cromatina

Figura 3: Técnicas de conformación del cromosoma. Diversos pasos de 3C, 4C, 5C, ChIA-PET y Hi-C.

La captura de la conformación de la cromatina (3C)

3C utiliza la reticulación con formaldehído para fijar la estructura tridimensional de la cromatina en su lugar, seguida de la digestión con enzimas de restricción. A continuación, los fragmentos de ADN extraídos se analizan mediante qPCR y secuenciación para identificar dónde están conectadas las regiones de ADN distantes. Este enfoque para analizar la estructura de la cromatina en 3D y las interacciones in vivo se desarrolló por primera vez en 2002 (Dekker et al., 2002), y desde entonces se ha convertido en la base de una serie de técnicas relacionadas que se han desarrollado para lograr una mayor escala, rendimiento o especificidad.

Captura de la conformación cromosómica circularizada (4C)

4C permite identificar regiones de ADN previamente desconocidas que interactúan con un locus de interés, lo que hace que la 4C sea ideal para descubrir nuevas interacciones dentro de una región específica (Dekker et al., 2006).

4C consejos útiles:

• Elija las enzimas de restricción adecuadas. Los cortadores más frecuentes (es decir, sitios de reconocimiento de cuatro pb) son mejores para las interacciones locales entre la región de interés y las secuencias cercanas en el mismo cromosoma (van der Werken et al., 2012).
• Optimizar la reticulación. Las concentraciones de formaldehído más bajas promueven las autoligaciones indeseables de la región de interés, pero también evitan las «bolas de pelo» de ADN que dificultan el corte de la enzima de restricción. Las concentraciones altas de formaldehído reducen los eventos de autoligado pero aumentan las bolas de pelo. Se debe elegir una concentración óptima de formaldehído para la situación experimental específica para equilibrar estas consideraciones. El tratamiento con formaldehído al 1% durante 10 minutos es un buen punto de partida para la mayoría de los experimentos (van der Werken et al., 2012).

Captura de la conformación cromosómica de la copia de carbono (5C)

5C genera una biblioteca de cualquier producto de ligación de las regiones de ADN que se asocian con los loci objetivo, que luego se analizan mediante NGS. La 5C es ideal cuando se necesita un gran detalle sobre todas las interacciones en una región determinada, por ejemplo, al diagramar una matriz de interacción detallada de un cromosoma en particular. Sin embargo, la 5C no abarca verdaderamente todo el genoma, ya que cada cebador de la 5C debe diseñarse individualmente, por lo que es más adecuada para una región específica (Dotsie y Dekker, 2007).

Consejos útiles de la 5C:

• Seleccionar la enzima de restricción adecuada. Es esencial elegir una enzima que funcione eficazmente en sus condiciones experimentales específicas. Por ejemplo, la BamHI no se recomienda para la mayoría de los experimentos debido a su ineficacia en condiciones de 3C (Dotsie et al., 2007).
• Optimizar el diseño del cebador. La 5C utiliza dos cebadores: un cebador 5C delantero que se une aguas arriba del sitio de ligación, y un cebador inverso que se une inmediatamente aguas abajo. La longitud de los cebadores debe ajustarse de manera que la temperatura de recocido sea de unos 65°C para permitir que los cebadores se recoja exactamente con sus fragmentos de restricción. Asegúrese de que los cebadores 5C se sintetizan con un fosfato en el extremo 5′ para la ligación.
• Utilice una plantilla de control. Esto controlará las diferencias en la eficiencia de los cebadores. Se recomienda una biblioteca de control construida a partir de toda la región genómica en estudio. Si no se construye esta biblioteca, los investigadores deben ser conscientes de que las frecuencias de interacción serán menos precisas.

El análisis de interacción de la cromatina mediante secuenciación de etiquetas de extremo emparejado (ChIA-PET)

ChIA-PET toma aspectos de ChIP y 3C para analizar la interacción de regiones de ADN distantes a través de una proteína particular.

ChIA-PET se utiliza mejor para los experimentos de descubrimiento que implican una proteína de interés y objetivos de unión al ADN desconocidos. Los sitios de unión de factores de transcripción, por ejemplo, se estudian mejor con ChIA-PET ya que esta técnica requiere que el ADN esté unido por el factor de transcripción in vivo para que la interacción sea llamada (Fullwood et al., 2009).

Consejos útiles de ChIA-PET:

• Superponga las etiquetas PET para reducir el fondo. Como la mayoría de las tecnologías 3C, el ruido de fondo es un reto técnico. En ChIA-PET particularmente, el ruido puede dificultar la búsqueda de interacciones de largo alcance con el locus de interés. Un consejo útil para superar esto es requerir que las PETs se solapen en ambos extremos de la región para ser una interacción de largo alcance.

ChIP-loop

ChIP-loop es una mezcla de ChIP y 3C que emplea anticuerpos dirigidos a proteínas sospechosas de unirse a una región de ADN de interés. ChIP-loop es ideal para averiguar si dos regiones de ADN conocidas interactúan a través de una proteína de interés. ChIP-loop también es adecuado para confirmar las interacciones que se sospechan, pero no para descubrir otras nuevas (Horike et al., 2005).

Consejos útiles de ChIP-loop:

• Evite los bucles no nativos. El mayor problema encontrado con ChIP-loop es la formación de bucles no nativos que se forman durante la concentración del ADN antes de que se produzca la ligación. Una forma sencilla de evitarlo es elegir un protocolo que realice la precipitación después del paso de ligación (Simons et al., 2007).
• Validar las interacciones ChIP-loop. Otro reto en ChIP-loop puede ser la cuantificación precisa de los productos de ligación. Las tecnologías 3C, especialmente ChIP-loop, a menudo capturan interacciones aleatorias. Para combatir esto, considere realizar un experimento de ChIP en paralelo y utilizarlo para validar las interacciones ChIP-loop. Si una interacción ADN-proteína-ADN identificada por ChIP-loop es realmente real, entonces ambas interacciones ADN-proteína deberían aparecer también en los datos de ChIP (Simons et al., 2007).

Hi-C

Hi-C amplifica productos de ligación de todo el genoma y evalúa sus frecuencias mediante secuenciación de alto rendimiento. Hi-C es una gran opción cuando se requiere una amplia cobertura de todo el genoma, y la resolución no es de gran preocupación, el mapeo de los cambios de todo el genoma en la estructura del cromosoma en las células tumorales (Lieberman-Aiden et al., 2009), por ejemplo.

Hi-C consejos útiles:

• Optimizar la amplificación de la biblioteca. La amplificación de la biblioteca Hi-C debe generar suficiente producto para el análisis, evitando al mismo tiempo los artefactos de la PCR. Para ello, debe optimizarse el número de ciclos de PCR (en el rango de 9-15 ciclos). Si no se puede producir suficiente producto (50 ng de ADN), se deben agrupar múltiples reacciones de PCR en lugar de aumentar el número de ciclos, cinco reacciones suelen ser suficientes (Belton et al., 2012).
• Longitudes de lectura de equilibrio. Como en cualquier experimento de secuencias, las lecturas de alta calidad son primordiales. La longitud de la lectura debe ser óptima para equilibrar la necesidad de lecturas largas para mapear las interacciones, pero no demasiado largas como para pasar a través de la unión de ligación en el fragmento de la pareja. Por lo tanto, las lecturas de 50 pb son óptimas en la mayoría de los casos (Belton et al., 2012).
• Elija un tamaño de recipiente adecuado. Esto es crítico para el análisis de datos. El tamaño de la bandeja debe ser inversamente proporcional al número de interacciones esperadas en una región. Utilice contenedores más pequeños para las interacciones intracromosómicas más frecuentes y contenedores más grandes para las interacciones intercromosómicas menos frecuentes (Belton et al., 2012).

Capture-C

Capture-C utiliza una combinación de 3C y tecnología de captura de oligonucleótidos (OCT), junto con la secuenciación de alto rendimiento para estudiar cientos de loci a la vez. Capture-C es ideal cuando se requiere tanto una alta resolución como una escala genómica amplia. Por ejemplo, para analizar el efecto funcional de cada SNP asociado a una enfermedad en el genoma en la estructura local de la cromatina (Hughes et al., 2014).

Consejos útiles de Capture-C:

• Elija cuidadosamente las posiciones de las sondas. Es mejor colocar las sondas cerca de los sitios de las enzimas de restricción, incluso superponiéndolas cuando sea posible (Hughes et al., 2014).
• Mantener la complejidad de las bibliotecas. Mantener la complejidad de la biblioteca es la máxima prioridad. Una biblioteca compleja significa más interacciones de alta calidad en el resultado. Por esta razón, debe evitarse cualquier cosa que pueda disminuir la complejidad de la biblioteca, como una captura de biotina Hi-C (Hughes et al., 2014).
• Vigilar las falsas interacciones en las regiones duplicadas. El proceso de mapeo puede estimular fuertes interacciones entre estas regiones (como pseudogenes) que en realidad son artefactos (Hughes et al., 2014)

Belton JM, McCord RP, Gibcus JH, Naumova N, Zhan Y y Dekker J (2012). Hi-C: una técnica integral para capturar la conformación de los genomas. Methods, 58, 268-76.

Dekker J, Rippe K, Dekker M y Kleckner N (2002). Captura de la conformación del cromosoma. Science, 295, 1306-1311.

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Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF and Kohwi-Shigematsu T (2005). Pérdida del bucle de cromatina silenciosa y deterioro de la impresión de DLX5 en el síndrome de Rett. Nat Genet, 37, 31-40.

Fullwood MJ, et al. (2009). An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome. Nature, 462, 58-64.

Lieberman-Aiden E, et al. (2009). La cartografía exhaustiva de las interacciones de largo alcance revela los principios de plegado del genoma humano. Science, 326, 289-293.

Hughes JR (agosto de 2014). Entrevista por correo electrónico.

Hughes JR, et al. (2014). Análisis de cientos de paisajes cis-regulatorios a alta resolución en un único experimento de alto rendimiento. Nat Genet, 46, 205-212.

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