Enterococci

2.4.3.2 Atividades hidrolíticas dos enterocococos

Enterococos são conhecidos por produzir três tipos de enzimas que contribuem para a sua patogenicidade oportunista: hialuronidase, gelatinase e serine protease. A hialuronidase, codificada pelo gene hyl cromossômico, degrada o principal constituinte da matriz extracelular das células hospedeiras, o ácido hialurônico, facilitando a invasão dos tecidos e a disseminação de toxinas .

Gelatinase, codificada pelo gene cromossômico gelE, é uma metaloprotease de zinco ativa na gelatina, mas também no colágeno, caseína, hemoglobina, β-insulina e outros peptídeos biologicamente ativos . Esta enzima também contribui para o processo de formação do biofilme, o que pode facilitar a colonização e persistência dos tecidos nos locais de infecção , . A protease serina, codificada pelo gene sprE, localizada a montante do gelE e co-transcrição com este último, também participa na patogênese por degradação dos tecidos hospedeiros .

Enterococci contribuem para o desenvolvimento de sabores de queijo durante a maturação devido às suas atividades proteolíticas e lipolíticas e sua capacidade de produzir ácidos graxos voláteis ou de cadeia longa, diacetil, acetoína e outros compostos voláteis . De acordo com , E. faecium está envolvido no desenvolvimento do sabor, aroma, cor e textura. Por isso, contribui para o perfil sensorial geral de certos queijos. Estas qualidades também fazem dele uma flora de escolha para outros produtos fermentados, como vegetais ou carnes .

Embora as actividades proteolíticas das bactérias lácticas estejam bem descritas na literatura sobre produtos fermentados, as dos enterococos são menos conhecidas . Elas são bastante baixas em produtos lácteos, exceto por algumas cepas de E. faecalis . De acordo com , dentro deste gênero, o nível de atividade proteolítica depende da espécie e da cepa dentro da mesma espécie. As proteases melhor descritas são capazes de hidrolisar caseína, mas também β-lactoglobulina e α-lactalbumina . Muitos estudos mostram que os queijos produzidos a partir de leite inoculado com E. faecalis têm maior actividade proteolítica do que os queijos produzidos sem estas enzimas. O trabalho sobre o crescimento de 24 cepas de E. faecium e 60 cepas de E. faecalis em leite desnatado a 37°C, mostra que as atividades proteolíticas do E. faecalis são muito superiores às do E. faecium. Estes resultados são confirmados por e em produtos lácteos e por enterococos isolados de ovo inteiro líquido pasteurizado e responsáveis pela sua deterioração.

A degradação subsequente dos aminoácidos é considerada como tendo um grande impacto no desenvolvimento do aroma dos queijos. As atividades proteolíticas também podem ser responsáveis pela formação de aminas biogênicas pelos enterococos dos aminoácidos que eles (ou outros tipos de bactérias) liberam. A Figura 2.6 mostra as diferentes aminas biogénicas potencialmente formadas nos alimentos em deterioração.

Figure 2.6. Formação de aminas biogénicas em matrizes alimentares em resposta a actividades metabólicas microbiológicas. As setas cinzentas representam as reacções de descarboxilação que levam directamente à formação de aminas biogénicas, as linhas pontilhadas indicam as aminas biogénicas produzidas através de vias metabólicas que diferem das reacções de descarboxilação de uma etapa.

(Figura tirada de , adaptada de acordo com )

Histamina, tiramina, feniletilamina e cadaverina são produzidas por uma única reacção de descarboxilação em uma única etapa a partir de seus respectivos precursores histidina, tirosina, fenilalanina e lisina. A produção destas aminas biogénicas, seguida da sua secreção, requer (1) sistemas activos de transporte dos aminoácidos precursores, (2) descarboxilações e (3) sistemas de excreção de aminas resultantes destas descarboxilações. O transporte geralmente envolve uma proteína que troca o aminoácido precursor com a amina resultante da sua descarboxilação. Uma vez na célula, o aminoácido sofre uma descarboxilação catalisada por uma descarboxilase específica (carboxilases EC 4.1.1.1.) na presença de fosfato piramidoxal. As descarboxilases mais estudadas são a histidina descarboxilase (HDC), tirosina descarboxilase (TDC) e lisina descarboxilase (LDC), respectivamente codificadas pelos genes hdcA, tdcA e cadA. Posteriormente são organizados em óperas com outros genes envolvidos em outras etapas do processo de produção de aminas biogênicas, como o transporte e a maturação. A especificidade destas descarboxilases tem sido debatida há muito tempo e está agora bem estabelecido que uma descarboxilase pode descarboxilar vários substratos. Por exemplo, o Enterococcus TDC pode descarboxilato de fenilalanina e tirosina para produzir feniletilamina e tiramina, respectivamente . Putrescina, agmatina, espermidina e espermidina são sintetizadas por diferentes vias catalisadas por grupos de genes que podem ser específicos da espécie ou cepa porque são potencialmente adquiridos por transferência horizontal .

Enterococci são descritos como sendo capazes de causar atividades de descarboxilase responsáveis pela produção de aminas biogênicas em alimentos fermentados. Eles são mesmo reconhecidos como tendo as atividades mais fortes de tirosina e fenilalanina descarboxilase no mundo bacteriano . As bactérias lácticas da flora endógena das carnes fermentadas, como os enchidos, são reconhecidas como os principais produtores de tiraminas. Os queijos e alguns produtos de carne podem ser substratos adequados para a produção de 2-feniletilamina, tiramina, histidina ou outras aminas. Estas estirpes abrigam, portanto, genes ou óperas que codificam descarboxilases ou outras enzimas envolvidas na síntese de aminas biogénicas ou no seu catabolismo . Para os produtos do mar, a síntese de aminas biogênicas não é atribuída a enterococos . Enquanto bactérias resistentes ao calor como os enterococos, que são as principais bactérias envolvidas na produção de aminas biogênicas em produtos lácteos , são apenas parcialmente eliminadas por pasteurização, o tratamento térmico reduz o nível de aminas biogênicas. Este fenómeno pode ser devido à diminuição do nível de contaminação dos alimentos e/ou ao facto de um cofactor essencial de descarboxilação ter sido desnaturado por pasteurização.

As bactérias lácticas, apesar de não serem muito activas em relação aos lípidos, são conhecidas por participarem no aroma dos queijos, quer pela conversão de ácidos gordos de cadeia curta em cetonas ou lactonas metiladas, quer pela formação de aldeídos resultantes da oxidação dos ácidos gordos insaturados e responsáveis pelo desenvolvimento de odores e sabores rançosos, quer pela solvatação dos compostos aromáticos produzidos a partir de lípidos mas também a partir de proteínas e lactose . De acordo com , e , os enterococos têm atividades de esterase que muitas vezes são mais fortes que outras bactérias ácidas lácticas. Entre os enterococos, estas atividades também são variáveis e pesquisas mostram que eles são mais fortes em E. faecalis do que em E. faecium. Outros estudos mostram que a atividade lipolítica dos enterococos não varia de acordo com a espécie, mas com o tipo de queijo de onde a cepa se origina .

A partir de 1965, mostrou atividades de esterase expressas pelas cepas de E. faecalis e E. faecium. mostra que os enterococos eram mais ativos em triglicerídeos do que as cepas de Streptococcus e que as taxas de hidrólise diminuíram com o aumento do comprimento da cadeia de carbono dos ácidos graxos liberados (tripropionina > tributirina > tricaprina > tricaprylin). Eles destacam a falta de atividade no trioleína. mostram que os enterococos exibem baixa atividade lipolítica quando colocados em um meio de crescimento contendo leite integral. Os trabalhos mostram que a hidrólise de tributirina expressa por E. faecium e E. faecal é isolada do queijo, porém estas cepas não são ativas nos lipídios do leite. mostram que a lipase de E. faecalisis também é mais ativa na tributirina do que na tricaproína, tricaprylin e trioleína. Entretanto, de acordo com , a capacidade dos enterococos de hidrolisar os lipídios do leite é altamente variável de uma cepa para outra. Algumas cepas não mostram atividade lipolítica enquanto outras mostram alta atividade em uma ampla gama de ácidos graxos. Trabalhos realizados em substratos sintéticos (4-nitrofenilos), mostram a atividade de E. faecium nos ácidos graxos cujo comprimento de cadeia está entre 2 e 18 carbonos. Em estudos posteriores , esses mesmos autores mostram que uma esterase intracelular de E. faecium desenvolve, in vitro, uma atividade em 4-nitrofenil-acyls cujo comprimento de cadeia está entre 2 e 12 carbonos, com um ótimo na presença de 4-nitrofenil-butirato (C2) . Os trabalhos mostram que a maioria das cepas de enterococos testadas (90%, N = 129), são capazes de hidrolisar triglicéridos homogêneos contendo ácidos graxos com um comprimento de cadeia entre 4 e 18 carbonos, diminuindo a atividade com o aumento do comprimento da cadeia de carbono. Todas as estirpes testadas (100%) neste mesmo estudo mostram uma atividade nos substratos sintéticos, de 4-nitrofenillaceato (C2) a 4-nitrofenilstearato (C18), sendo a atividade também reduzida pelo aumento do comprimento da cadeia de carbono dos ácidos graxos.

Dentre os poucos estudos publicados sobre atividades hidrolíticas que podem estar envolvidas na deterioração de ovoprodutos são aqueles que mostram atividades lipolíticas expressas pelas cepas E. faecium e em particular E. faecalis isoladas de produtos de ovos inteiros líquidos pasteurizados estragados. O trabalho revela que as actividades lipásicas também são detectadas para metade das estirpes de Enterococcus derivadas das claras de ovos industriais e testadas pela sua capacidade de estragar um dos principais componentes das sobremesas da ilha flutuante, o creme de ovos creme.