Zugänglichkeit und Architektur des Chromatins

Abbildung 3: Chromosomen-Konformationsverfahren. Verschiedene Schritte von 3C, 4C, 5C, ChIA-PET und Hi-C.

Chromatin Conformation Capture (3C)

3C verwendet Formaldehyd-Vernetzung, um die dreidimensionale Chromatinstruktur zu fixieren, gefolgt von Restriktionsenzymverdau. Die herausgeschnittenen DNA-Fragmente werden dann mittels qPCR und Sequenzierung analysiert, um festzustellen, wo entfernte DNA-Regionen miteinander verbunden sind. Dieser Ansatz zur Analyse der 3D-Chromatinstruktur und der Interaktionen in vivo wurde erstmals 2002 entwickelt (Dekker et al., 2002) und ist seitdem zur Grundlage für eine Vielzahl verwandter Techniken geworden, die entwickelt wurden, um einen größeren Umfang, Durchsatz oder eine höhere Spezifität zu erreichen.

Circularized Chromosome Conformation Capture (4C)

4C ermöglicht die Identifizierung bisher unbekannter DNA-Regionen, die mit einem interessierenden Locus interagieren, was 4C ideal für die Entdeckung neuartiger Interaktionen innerhalb einer bestimmten Region macht (Dekker et al., 2006).

4C hilfreiche Hinweise:

• Wählen Sie die richtigen Restriktionsenzyme. Häufigere Cutters (d.h. vier bp Erkennungsstellen) sind besser für lokale Interaktionen zwischen der Region von Interesse und nahe gelegenen Sequenzen auf demselben Chromosom (van der Werken et al., 2012).
• Optimieren Sie die Vernetzung. Niedrige Formaldehydkonzentrationen fördern unerwünschte Selbstligationen der interessierenden Region, verhindern aber auch DNA-„Haarbälle“, die das Schneiden durch Restriktionsenzyme behindern. Hohe Formaldehydkonzentrationen verringern die Selbstligationsereignisse, erhöhen aber die Haarballen. Die optimale Formaldehydkonzentration sollte für die jeweilige Versuchssituation gewählt werden, um diese Überlegungen auszugleichen. Eine Behandlung mit 1 % Formaldehyd für 10 Minuten ist ein guter Ausgangspunkt für die meisten Experimente (van der Werken et al., 2012).

Carbon Copy Chromosome Conformation Capture (5C)

5C erzeugt eine Bibliothek aller Ligationsprodukte von DNA-Regionen, die mit den Zielloci assoziiert sind, die dann mittels NGS analysiert werden. 5C ist ideal, wenn sehr detaillierte Informationen über alle Interaktionen in einer bestimmten Region benötigt werden, z. B. wenn eine detaillierte Interaktionsmatrix eines bestimmten Chromosoms erstellt werden soll. Allerdings ist 5C nicht wirklich genomweit, da jeder 5C-Primer einzeln entworfen werden muss, so dass es am besten für eine bestimmte Region geeignet ist (Dotsie und Dekker, 2007).

5C hilfreiche Hinweise:

• Wählen Sie das richtige Restriktionsenzym. Die Wahl eines Enzyms, das unter Ihren spezifischen Versuchsbedingungen effizient funktioniert, ist von entscheidender Bedeutung. BamHI wird zum Beispiel für die meisten Experimente nicht empfohlen, da es unter 3C-Bedingungen ineffizient ist (Dotsie et al., 2007).
• Optimieren Sie das Primer-Design. Bei 5C werden zwei Primer verwendet: ein Vorwärts-5C-Primer, der stromaufwärts der Ligationsstelle bindet, und ein Rückwärtsprimer, der unmittelbar stromabwärts bindet. Die Primerlänge sollte so angepasst werden, dass die Annealing-Temperatur bei etwa 65 °C liegt, damit die Primer exakt an die Restriktionsfragmente annealing. Stellen Sie sicher, dass die 5C-Primer mit einem Phosphat am 5′-Ende für die Ligation synthetisiert werden.
• Verwenden Sie eine Kontrollvorlage. Damit werden Unterschiede in der Primereffizienz kontrolliert. Es wird eine Kontrollbibliothek empfohlen, die aus der gesamten untersuchten Genomregion erstellt wurde. Wird diese Bibliothek nicht erstellt, sollten sich die Forscher darüber im Klaren sein, dass die Interaktionshäufigkeiten weniger präzise sind.

Chromatin-Interaktionsanalyse durch Paired-End-Tag-Sequenzierung (ChIA-PET)

ChIA-PET nutzt Aspekte von ChIP und 3C, um das Zusammenspiel entfernter DNA-Regionen durch ein bestimmtes Protein zu analysieren.

ChIA-PET wird am besten für Entdeckungsexperimente verwendet, bei denen ein Protein von Interesse und unbekannte DNA-Bindungsstellen beteiligt sind. Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen lassen sich beispielsweise am besten mit ChIA-PET untersuchen, da bei dieser Technik die DNA vom Transkriptionsfaktor in vivo gebunden werden muss, damit die Interaktion benannt werden kann (Fullwood et al., 2009).

ChIA-PET hilfreiche Hinweise:

• Überlappen Sie PET-Tags, um den Hintergrund zu reduzieren. Wie bei den meisten 3C-Technologien stellt das Hintergrundrauschen eine technische Herausforderung dar. Insbesondere bei ChIA-PET kann das Rauschen die Suche nach weitreichenden Wechselwirkungen mit dem interessierenden Ort erschweren. Ein nützlicher Tipp zur Überwindung dieses Problems besteht darin, dass sich die PETs an beiden Enden der Region überlappen müssen, damit es sich um eine weitreichende Interaktion handelt.

ChIP-Schleife

ChIP-Schleife ist eine Mischung aus ChIP und 3C, bei der Antikörper eingesetzt werden, die auf Proteine abzielen, von denen vermutet wird, dass sie eine DNA-Region von Interesse binden. ChIP-loop ist ideal, um herauszufinden, ob zwei bekannte DNA-Regionen über ein Protein von Interesse interagieren. ChIP-Loop eignet sich auch gut zur Bestätigung vermuteter Interaktionen, nicht aber zur Entdeckung neuer Interaktionen (Horike et al., 2005).

Hilfreiche Hinweise zu ChIP-Loop:

• Vermeiden Sie nicht-native Schleifen. Das größte Problem bei ChIP-Schleifen ist die Bildung von nicht-nativen Schleifen, die sich während der DNA-Konzentration vor der Ligation bilden. Eine einfache Möglichkeit, dies zu vermeiden, besteht darin, ein Protokoll zu wählen, das die Ausfällung nach dem Ligationsschritt durchführt (Simons et al., 2007).
• Validierung von ChIP-Schleifen-Interaktionen. Eine weitere Herausforderung bei ChIP-Schleifen kann die genaue Quantifizierung der Ligationsprodukte sein. 3C-Technologien, insbesondere ChIP-Loop, erfassen oft zufällige Interaktionen. Um dem entgegenzuwirken, sollten Sie ein paralleles ChIP-Experiment durchführen und es zur Validierung der ChIP-Loop-Interaktionen verwenden. Wenn eine durch ChIP-Loop identifizierte DNA-Protein-DNA-Interaktion tatsächlich real ist, sollten beide DNA-Protein-Interaktionen auch in den ChIP-Daten erscheinen (Simons et al., 2007).

Hi-C

Hi-C amplifiziert Ligationsprodukte aus dem gesamten Genom und bewertet ihre Häufigkeit durch Hochdurchsatz-Sequenzierung. Hi-C ist eine gute Wahl, wenn eine breite Abdeckung des gesamten Genoms erforderlich ist und die Auflösung keine große Rolle spielt, z. B. bei der Kartierung genomweiter Veränderungen der Chromosomenstruktur in Tumorzellen (Lieberman-Aiden et al., 2009).

Hilfreiche Hinweise zu Hi-C:

• Optimierung der Bibliotheksamplifikation. Bei der Amplifikation von Hi-C-Bibliotheken muss genügend Produkt für die Analyse erzeugt werden, wobei PCR-Artefakte zu vermeiden sind. Zu diesem Zweck sollte die PCR-Zykluszahl optimiert werden (im Bereich von 9-15 Zyklen). Wenn nicht genügend Produkt erzeugt werden kann (50 ng DNA), sollten mehrere PCR-Reaktionen gepoolt werden, anstatt die Zykluszahl zu erhöhen; fünf Reaktionen sind in der Regel ausreichend (Belton et al., 2012).
• Ausgewogene Leselängen. Wie bei jedem Sequenzexperiment sind qualitativ hochwertige Reads von größter Bedeutung. Die Leselänge muss optimal sein, um den Bedarf an langen Reads für die Kartierung von Interaktionen auszugleichen, aber nicht so lang, dass sie durch die Ligationskreuzung in das Partnerfragment gelangen. Daher sind 50 bp-Reads in den meisten Fällen optimal (Belton et al., 2012).
• Wählen Sie eine geeignete Bin-Größe. Dies ist entscheidend für die Datenanalyse. Die Bin-Größe sollte umgekehrt proportional zur Anzahl der erwarteten Interaktionen in einer Region sein. Verwenden Sie kleinere Bins für häufigere intra-chromosomale Interaktionen und größere Bins für weniger häufige inter-chromosomale Interaktionen (Belton et al., 2012).

Capture-C

Capture-C verwendet eine Kombination aus 3C- und Oligonukleotid-Capture-Technologie (OCT) zusammen mit Hochdurchsatz-Sequenzierung, um Hunderte von Loci auf einmal zu untersuchen. Capture-C ist ideal, wenn sowohl eine hohe Auflösung als auch ein genomweiter Maßstab erforderlich sind. Zum Beispiel bei der Analyse der funktionellen Auswirkungen jedes krankheitsassoziierten SNP im Genom auf die lokale Chromatinstruktur (Hughes et al., 2014).

Hilfreiche Hinweise zu Capture-C:

• Wählen Sie die Sondenpositionen sorgfältig aus. Es ist am besten, die Sonden nahe an den Restriktionsenzymstellen zu positionieren, sogar überlappend, wenn möglich (Hughes et al., 2014).
• Bibliotheken komplex halten. Die Aufrechterhaltung der Komplexität der Bibliothek hat oberste Priorität. Eine komplexe Bibliothek bedeutet mehr hochwertige Interaktionen in der Ausgabe. Aus diesem Grund sollte alles vermieden werden, was die Komplexität der Bibliothek verringern könnte, wie z. B. ein Hi-C-Biotin-Capture (Hughes et al., 2014).
• Achten Sie auf falsche Interaktionen in duplizierten Regionen. Der Kartierungsprozess kann starke Interaktionen zwischen diesen Regionen (wie Pseudogene) hervorrufen, die eigentlich Artefakte sind (Hughes et al., 2014)

Belton JM, McCord RP, Gibcus JH, Naumova N, Zhan Y und Dekker J (2012). Hi-C: eine umfassende Technik zur Erfassung der Konformation von Genomen. Methods, 58, 268-76.

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Dostie J und Dekker J (2007). Kartierung von Netzwerken physikalischer Interaktionen zwischen genomischen Elementen mit Hilfe der 5C-Technologie. Nat Protoc, 2, 988-1002.

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Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF and Kohwi-Shigematsu T (2005). Verlust der Silent-Chromatin-Schleife und gestörtes Imprinting von DLX5 beim Rett-Syndrom. Nat Genet, 37, 31-40.

Fullwood MJ, et al. (2009). Ein Östrogenrezeptor-alpha-gebundenes menschliches Chromatin-Interaktom. Nature, 462, 58-64.

Lieberman-Aiden E, et al. (2009). Umfassende Kartierung weitreichender Interaktionen enthüllt Faltprinzipien des menschlichen Genoms. Science, 326, 289-293.

Hughes JR (August 2014). E-Mail-Interview.

Hughes JR, et al. (2014). Analyse von Hunderten von cis-regulatorischen Landschaften mit hoher Auflösung in einem einzigen Hochdurchsatz-Experiment. Nat Genet, 46, 205-212.

Simonis M, Kooren J and de Laat W (2007). An evaluation of 3C-based methods to capture DNA interactions. Nat Methods, 11, 895-901.

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