Woher weiß ich, ob der Antikörper kreuzreagieren wird?

Kreuzreaktivität tritt auf, wenn ein Antikörper, der gegen ein bestimmtes Antigen gebildet wurde, zwei Antigene erkennt, die ähnliche strukturelle Regionen aufweisen.

Was ist Kreuzreaktivität?

Ein Antikörper hat eine spezifische Aminosäuresequenz (die Fab-Region), die seine Affinität für ein bestimmtes Antigen bestimmt. Kreuzreaktivität zwischen Antigenen tritt auf, wenn ein Antikörper, der gegen ein bestimmtes Antigen gebildet wurde, eine konkurrierende hohe Affinität zu einem anderen Antigen aufweist. Dies ist häufig der Fall, wenn zwei Antigene ähnliche strukturelle Regionen aufweisen, die der Antikörper erkennt.

Kreuzreaktivität kann die Ergebnisse eines Experiments verfälschen und damit die wissenschaftliche Reproduzierbarkeit beeinträchtigen. Daher ist das Testen eines Antikörpers auf Kreuzreaktivität mit eng verwandten Proteinen ein wichtiges Validierungsexperiment.

Wie überprüfe ich Kreuzreaktivität?

Kreuzreaktivität ist nicht immer eine negative Eigenschaft. Manchmal kann sie den Nutzen eines Antikörpers verbessern. Beispielsweise ermöglicht die Kreuzreaktivität eines Antikörpers für ein Zielmolekül über verschiedene Spezies hinweg die Verwendung desselben Antikörpers in mehreren Modellorganismen.

Kreuzreaktivität über verschiedene Spezies hinweg tritt häufig bei Antikörpern auf, die von menschlichen Antigenen stammen. Viele humane Antikörper im Proteintech-Katalog haben eine signifikante Kreuzreaktivität mit den homologen Proteinen in nicht-menschlichen Modellen, wie Maus, Ratte, Affe oder Zebrafisch.

Basierend auf der Homologie einer Proteinsequenz und Veröffentlichungen, die unsere Antikörper in nicht-menschlichen Organismen verwenden, können viele Antikörper von Proteintech nicht nur für menschliche Proben, sondern auch für eine Vielzahl von Organismen verwendet werden. Die Homologie kann mit Hilfe eines paarweisen Sequenzabgleichs von Immunogen und Zielantigen über die NCBI-BLAST-Website geprüft werden, und weitere Informationen können auf der Universal Protein Resource Website UniProt eingesehen werden.

Was ist die „richtige Zahl“ für die Homologie zur Vorhersage der Kreuzreaktivität?

Wenn das Immunogen und die Sequenz des potenziell kreuzreaktiven Proteins eine Sequenzhomologie von 75 % aufweisen, wird nach unserer Erfahrung eine Kreuzreaktion vorhergesagt. Wenn Ihre Probe nicht vom Menschen stammt, wird ein polyklonaler Antikörper empfohlen, da eine Mischung von Epitopen erkannt wird.

Kreuzreagiert mein Antikörper mit anderen Spezies?

Es hängt vom Ausmaß der Proteinsequenzähnlichkeit zwischen dem Immunogen und der potenziell kreuzreaktiven Proteinsequenz ab.

Wie vermeidet man Kreuzreaktivität im Western Blot?

Wenn möglich, wird empfohlen, den für den ersten verwendeten Antikörper spezifischen sekundären Antikörper zu verwenden; wenn der primäre Antikörper beispielsweise von der Maus stammt, sollte der sekundäre Antikörper Anti-Maus-IgG-HRP sein. Wenn der sekundäre Antikörper polyklonal ist und gegen das gesamte IgG-Molekül erzeugt wurde, dann ist der Kaninchen-Antikörper, der den primären Maus-Antikörper erkennt, wegen der Erkennung der gemeinsamen Kappa-Leichtketten-Region möglicherweise nicht die beste Wahl.

Kreuzreaktivität bei Immunfärbeexperimenten vermeiden

Kreuzreaktivität kann bei Immunfärbeexperimenten mit Gewebeproben auftreten; daher ist es üblich, Fragmente und nicht ganze IgGs als primäre Immunglobuline zu verwenden (z. B. bei der Arbeit mit Maus-Antikörpern auf Mausgewebe). Außerdem sollte man bei Mehrfachfärbungen, um Kreuzreaktionen auszuschließen, versuchen, verschiedene sekundäre Antikörper zu verwenden, z. B. 568 Kaninchen-Anti-Ziege mit einem 488 Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper, die recht häufig und leicht zu finden sind.

Was versteht man unter Kreuzadsorption und Kreuzreaktivität bei sekundären Antikörpern?

Kreuzadsorption bei sekundären Antikörpern sind polyklonale Antikörper, die mit einem zusätzlichen Reinigungsschritt hergestellt werden, um die Mitglieder herauszufiltern, die an andere Immunglobulinarten (IgG) binden. Dieser Prozess kann die Kreuzreaktivität zwischen den Spezies verringern und die Spezifität erhöhen. Je nach Versuchsaufbau gibt es kreuzadsorbierte und hochgradig kreuzadsorbierte Sekundärantikörpersorten.

1. Polyklonale vs. monoklonale Antikörper

2. Auswahl sekundärer Antikörper

3. Protein- oder Peptidantigen? Vorteile und Nachteile