VIRAL PLAQUE ASSAY

Materialien:

30ml Exponentialkultur von SF9-Zellen bei 5×105 Zellen/ml

6-Wellplates (je 2)

1Flasche 4% Agarose Gel

1Flasche SF-900 (1.3X) Medium

1 sterile Flasche

0.5ml Baculovirus-Überstand

100ml SFM

1. Unter sterilen Bedingungen 2 ml Zellsuspension pro Vertiefung verteilen.

2. Zellen auf dem Boden der Platte absetzen lassen und zugedeckt bei RT für 1h inkubieren.

3. Die Flasche mit dem Agarosegel in das 70oC Wasserbad stellen. Legen Sie die leere Flasche und das SF-900 (1,3X) in das 40oC-Bad.

4. Nach 1h Inkubation der Platten bei RT, beobachten Sie Monolayer unter dem Inversmikroskop, um Zellanhaftung und 50% Konfluenz zu bestätigen.

5. Stellen Sie eine achtfache serielle Verdünnung des geernteten viralen Überstands her, indem Sie nacheinander 0,5 ml der vorherigen Verdünnung in 4,5 ml SFM-Medium in 12-mld-Einweggläsern verdünnen. Am Ende sollten Sie 8 Röhrchen haben, die jeweils eine 10-1- bis 10-8-Verdünnung des ursprünglichen Virusbestandes enthalten.

7. Entfernen Sie nacheinander den Überstand aus jeder Vertiefung, verwerfen Sie ihn und geben Sie sofort 1 ml der jeweiligen Virusverdünnung in jede doppelte Vertiefung. Inkubieren Sie für 1 Stunde bei RT.

8. Bringen Sie die Flaschen aus dem Wasserbad in die sterile Haube, wenn die Agarose flüssig ist (20 bis 30 Minuten). Geben Sie schnell 30 ml des SF-900 (1.3X) Mediums und 10 ml des 4% Agarosegels in die leere Flasche und mischen Sie vorsichtig. Stellen Sie die Flasche mit dem Plaquing Overlay bis zur Verwendung wieder in das 40oC-Wasserbad.

9. Nach dieser zweiten 1-stündigen Inkubation die Flasche mit der verdünnten Agarose und die 6-Well-Platten wieder in den Abzug stellen.

10.Nacheinander (von hoher zu niedriger Verdünnung) das Virus aus den Vertiefungen entfernen und durch 2 ml der verdünnten Agarose ersetzen. Mit einer Pasteurpipette, die an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist, lassen sich Spuren des Inokulums leicht entfernen.

11.Lassen Sie das Gel 10 bis 20 Minuten aushärten, bevor Sie es bewegen.

12.Bebrüten Sie es bei 27oC in einem befeuchteten Inkubator für 4 bis 10 Tage.

13.Das rekombinante Virus erzeugt milchig-graue Plaques mit leichtem Kontrast, die ohne Färbung oder andere Nachweismethoden sichtbar sind.

14.Die Platten täglich überwachen, bis sich die Anzahl der gezählten Plaques an zwei aufeinanderfolgenden Tagen nicht mehr ändert.

15.Den Titer des verwendeten Inokulums bestimmen; ein optimaler Bereich für die Zählung sind 3 bis 20 Plaques pro Vertiefung einer 6-Well-Platte. Der Titer (pfu/ml) kann nach folgender Formel berechnet werden:

16. Überlagerung der Agarose mit dem Farbstoff Natural Red:

Zubereitung einer 0,5%igen Agaroselösung in SFM

Zugabe der Natural Red-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 50mg/ml (3,33mg/ml Stammlösung 1:66,6 verdünnen).

Jeder Vertiefung (auf einer 6-Well-Platte) 1ml der Farbstofflösung überlagern.