Ribosomen-Engineering offenbart die Bedeutung der 5S rRNA-Autonomie für den Ribosomenaufbau

Plasmidkonstruktion

Alle Plasmide wurden durch Gibson-Assemblierung50 konstruiert, wobei die Plasmid-Rückgrate durch inverse PCR oder Restriktionsnuklease-Verdau vorbereitet und die Inserts durch PCR erzeugt oder von Integrated DNA Technologies chemisch synthetisiert wurden. Die rRNA-kodierenden Plasmide wurden zunächst in E. coli POP2136-Zellen elektroporiert (die Genotypen aller in dieser Studie verwendeten Stämme sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt), und die Transformanten wurden auf LB-Platten gewonnen, die mit den entsprechenden Antibiotika ergänzt waren; die Platten wurden bei 30 °C bebrütet, um die Expression der rRNA-Gene zu verhindern, die durch den Lambda-PL-Promotor kontrolliert werden31. Alle anderen Plasmide wurden in den E. coli-Stamm JM109 transformiert und vermehrt und bei 37 °C in LB-Medien gezüchtet, die bei Bedarf mit 100 μg/ml Ampicillin (Amp), 50 μg/ml Kanamycin (Kan) oder 50 μg/ml Spectinomycin (Spc) ergänzt wurden.

Konstruktion des ptRNA100-Plasmids

Das Plasmidrückgrat, einschließlich des pA15-Replikationsursprungs und des Spc-Resistenzgens, wurde mittels PCR aus dem ptRNA67-Plasmid51 mit den Primern NA1 und NA2 amplifiziert (alle Primer sind in der ergänzenden Tabelle 4 aufgeführt). Das tRNA-Gencluster (das tRNAGlu, tRNAAla, tRNAIle, tRNATrp und tRNAAsp kodiert) wurde unter der Kontrolle des Ptac-Promotors und des T1-Terminators als gBlock (Integrated DNA Technology) synthetisiert. Das pTRNA100-Plasmid wurde durch Gibson-Assembly erzeugt. Die Struktur des Plasmids wurde durch Restriktionsverdau verifiziert und das Vorhandensein des plasmidgeborenen tRNA-Clusters wurde durch PCR-Amplifikation mit den Primern NA3 und NA4 und durch Sequenzierung bestätigt.

Konstruktion der Plasmide pDH42, pDH39 und pCH84

Die Konstrukte, die das hybride 23S-cp5S rRNA-Gen tragen, wurden auf der Grundlage des Plasmids pAM55229 erzeugt, das das E. coli rrnB rRNA-Operon beherbergt. Das 5S rRNA-Gen wurde durch inverse PCR unter Verwendung der Primer NA17 und NA18, die die Xho1-Restriktionsstelle beherbergen, den Verdau des PCR-Produkts durch Xho1 und DNA-Ligation deletiert. Die Ery-Resistenzmutation A2058G wurde dann durch ortsgerichtete Mutagenese mit dem QuikChange Lightning Multi Site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies) und Primer NA7 in das 23S rRNA-Gen eingeführt. Das resultierende Plasmid, pAM552Δ5S, wurde verwendet, um die cp5S rRNA-Gene mit Linkern an drei verschiedenen Stellen innerhalb des 23S rRNA-Gens einzuführen.

Die Vorbereitung der cp5S rDNA-Sequenz für die Integration in die 23S rDNA erfolgte in einer einzigen PCR-Reaktion, bei der die Primerpaare NA8/NA9 (für DH39- und DH42-Konstrukte) oder NA26 und NA27 (für CH84-Konstrukt) (jeweils 100 nM), die das cp5S rDNA-Insert enthielten, wurden mit Primerpaaren (jeweils 250 nM) kombiniert, die zufällige Sequenzlinker mit einer Größe von 0 bis 3 nt an den „linken“ und „rechten“ 23S-cp5S-Verbindungen einführen, wie folgt: NA10-NA13 und NA14-NA17 für DH39; NA18-NA21 und NA22-NA25 für DH42; NA28-NA31 und NA32-NA35 für CH84.

Für die Erzeugung der DH39-, DH42- und CH84-Plasmidbibliotheken wurde das pAM552Δ5S-Plasmid durch inverse PCR mit den Primerpaaren NA36/NA37, NA38/NA39 bzw. NA40/NA41 geöffnet. Die cp5S-rDNA-Inserts wurden durch Gibson-Assembly-Reaktionen in die resultierenden PCR-amplifizierten Plasmidrückgrate eingeführt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Elektroporation in E. coli POP2136-Zellen transformiert, und die Transformanten wurden auf LB/Amp-Agar-Platten gewonnen, die bei 30 °C gewachsen waren (Bedingungen, die die Expression der im Plasmid enthaltenen rRNA verhindern). Jede Bibliothek enthielt mindestens dreimal so viele Klone wie die geschätzte theoretische Vielfalt von 7225 Varianten. Die Kolonien wurden von den LB-Platten abgewaschen, die Plasmidbibliotheken wurden extrahiert und aufbewahrt.

Ersatz von ptRNA67 durch ptRNA100

Der E. coli SQ171-Stamm, dem chromosomale rRNA-Allele fehlen und der das pCSacB-Plasmid als Quelle für die rRNA-Gene und das ptRNA67-Plasmid als Quelle für die fehlenden chromosomalen tRNA-Gene trägt32,52, wurde als Ausgangs-Wirtsstamm verwendet. Um das ptRNA67-Plasmid durch ptRNA100 zu ersetzen, wurden die SQ171-Zellen zunächst mit ptRNA-Amp (zur Verfügung gestellt von Michael O’Connor, University of Missouri, Kansas City) transformiert, das der ptRNA67 ähnelt, aber Amp-Resistenz verleiht und den pBR322-Replikationsursprung enthält. Die Transformanten wurden dann vom ptRNA67-Plasmid geheilt, indem sie für etwa 100 Generationen in LB-Medium mit Amp und Kan überführt wurden. Der Verlust des ptRNA67-Plasmids wurde durch die Empfindlichkeit der Klone gegenüber Spc bei der Replikationsplattierung überprüft. Der resultierende Stamm wurde dann mit ptRNA100 transformiert und auf mit Spc und Kan supplementiertem LB-Agar ausgeplattet. Die Transformanten wurden in LB-Medien, die mit Spc und Kan ergänzt waren, für etwa 100 Generationen passagiert. Der Verlust des ptRNA-Amp-Plasmids wurde durch die Empfindlichkeit einzelner Klone gegenüber Amp verifiziert, wie durch Replica-Plating festgestellt wurde. Das Vorhandensein von ptRNA100 und das Fehlen von ptRNA67 wurden zusätzlich durch PCR und Restriktionsverdau der Gesamtplasmide, die aus dem resultierenden Klon hergestellt wurden, verifiziert.

Inaktivierung des recA-Gens in den SQ171/ptRNA100-Zellen

Das recA-Gen im Stamm SQ171/ptRNA100 wurde durch P1-Phagen-Transduktion inaktiviert. Der Spenderstamm BW25113 recA::cat wurde zunächst durch das herkömmliche Rekombinierungsverfahren52 mit einer Chloramphenicol (Chl)-Resistenzkassette aus dem pKD3-Plasmid52 hergestellt. Die Kassette wurde mit den Primern NA42 und NA43 PCR-amplifiziert. Das PCR-Fragment wurde in den Stamm BW25113 transformiert, der das Red-Rekombinase-exprimierende Plasmid pDK46 trägt. Nach Überprüfung der Integration der cat-Kassette und Aushärtung von pKD46 wurden die BW25113 recA::cat-Zellen als Spender für die Phagentransduktion verwendet. Die P1-Phagen-Transduktion wurde nach dem Standardprotokoll53 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Erholungsinkubation von 1 auf 3 Stunden verlängert wurde, bevor die Transduktanten auf mit Kan, Spc und 15 μg/ml Chl ergänzte LB/Agar-Platten plattiert wurden. Zur Exzision der cat-Kassette wurde der resultierende Stamm mit dem pZFLP-TetR-Plasmid transformiert, das für das Flippase-Enzym kodiert, und die Transformanten wurden auf LB/agar-Platten mit Kan, Spc und 2,5 μg/ml Tetracyclin (Tet) ausplattiert. Die Eliminierung des cat-Gens wurde durch PCR und durch die Chl-Empfindlichkeit der Klone bestätigt. Anschließend wurde das pZFLP-TetR-Plasmid durch Passage der Zellen für ca. 100 Generationen in LB-Medium mit Kan und Spc abgetötet, und die resultierenden Klone wurden auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Tet getestet. Der resultierende Stamm wurde SQA18 genannt (ergänzende Tabelle 1).

Einführung der 23S-cp5S-Bibliotheken in SQA18-Zellen

Die aus POP2136-Zellen extrahierten Plasmidbibliotheken wurden durch Elektroporation in SQA18-Zellen transformiert. Nach einer 2-stündigen Erholungsphase bei 37 °C wurden die Transformanten auf LB/Amp-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Kolonien wurden von den Agarplatten abgewaschen, und 0,01 A600 (~106 Zellen) wurden in ein Volumen von 2 ml LB-Medium gegeben, das mit 150 μg/mL Ery und 0,25 % Saccharose ergänzt war. Nach einer Wachstumszeit von 16 Stunden wurden die Zellen auf Agarplatten mit Amp, 1 mg/ml Ery und 5 % Saccharose ausplattiert. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 37 °C bebrütet. Lebensfähige Kolonien erschienen mit den Bibliotheken DH42 und CH84, aber nicht mit der Bibliothek DH39. Einige der Kolonien, die auf den Platten erschienen, wurden mittels Kolonie-PCR auf das Vorhandensein von 23S-cp5S rDNA unter Verwendung der Primerpaare NA44/NA45 für das DH42-Konstrukt und der Primer NA46/NA47 für das CH84-Konstrukt getestet. Die Abwesenheit des wt 5S rRNA-Gens wurde durch Kolonie-PCR unter Verwendung der Primer NA48 und NA49 überprüft.

Auswahl der bevorzugten 23S-cp5S rRNA-Linker

Die gesamte DH42-Plasmidbibliothek, die aus den POP2136-Zellen isoliert wurde, wurde in SQA18-Zellen transformiert und wie oben beschrieben auf LB/Amp-Platten ausgeplattet. Die Kolonien (~50.000) wurden von der Platte abgewaschen und das gesamte Plasmid wurde aus ~109 Zellen extrahiert und als Vorselektionsbibliothek verwendet.

Anschließend wurden etwa 109 Zellen dem Plasmidaustauschverfahren unterzogen. Dazu wurden sie in ein Volumen von 20 ml LB-Medium gegeben, das mit 150 μg/mL Ery und 0,25 % Saccharose ergänzt war. Nach einer Wachstumszeit von 4 Stunden wurden die Zellen auf Agarplatten mit Amp, 1 mg/ml Ery und 5 % Saccharose plattiert. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 37 °C bebrütet. Die Kolonien (~50.000) wurden von der Platte abgewaschen. Das aus diesen Zellen extrahierte Gesamtplasmid stellte die Nachselektionsbibliothek dar.

Die cp5S rDNA, flankiert von 23S rDNA-Sequenzen und Linkern, wurde aus den Plasmidpräparationen der Vor- und Nachselektionsbibliothek mit den Primern NA50 und NA51 PCR-amplifiziert. Die PCR-Bibliotheken wurden einer Sequenzierung der nächsten Generation unterzogen.

Der Fold-Enrichment-Faktor für jede Linker-Kombination wurde nach dem folgenden Verfahren berechnet. Nach dem Trimmen des Adapters wurde die gesamte Sequenz der cp5S rRNA mit Ausnahme der letzten 4 Nukleotide an jedem Ende eliminiert, um die Anzahl der falschen Sequenzvarianten zu reduzieren, die aufgrund von Sequenzierungsfehlern innerhalb der 5S-kodierenden Sequenz auftraten. Die sich daraus ergebenden Sequenzmotive wurden in den Vor- und Nachselektionsbibliotheken gezählt und die Häufigkeit des Anteils jeder Linkervariante wurde berechnet.

Zubereitung der gesamten zellulären RNA

Nachtkulturen der E. coli-Stämme POP2136 oder SQA18 wurden bei 30 °C bzw. 37 °C in LB/Amp-Medium gezüchtet. Die Kulturen wurden im Verhältnis 1:100 in 2 ml frischem Medium verdünnt und bei 37 °C auf A600 ~ 0,5 gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (5000 × g, 1 min) geerntet und in 100 μl Lysepuffer resuspendiert. Nach anschließender Zugabe von 400 μl Extraktionspuffer (50 mM Bis-Tris pH 6,5, 400 mM NaCl, 5 mM EDTA) und 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Gesamt-RNA durch Phenol/Chloroform-Extraktion gewonnen. Die RNA wurde mit Ethanol ausgefällt, das RNA-Pellet wurde mit 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen, in RNase-freiem Wasser gelöst, eingefroren und bei -80 °C gelagert.

Sucrosegradientenanalyse der Ribosomen und Polysomen

Über Nacht wurden E. coli-Kulturen in 50 ml LB/Amp-Medium verdünnt und auf A600 ~ 0,5 angezüchtet. Chl wurde bis zu einer Endkonzentration von 125 μg/ml zugegeben, und nach 5 min Inkubation wurden die Zellen durch Zentrifugation (5000 × g, 10 min, 4 °C) geerntet. Die Zellpellets wurden in eiskaltem Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml Lysozym, 0,25 % Natriumdeoxycholat und 2 U RQ1 RNase-free DNase I) resuspendiert. Die Zellen wurden durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen lysiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation (20.000 × g, 15 min, 4 °C) geklärt und 20 A260 Einheiten Lysat wurden auf 12 mL eines linearen 10-40%igen Saccharosegradienten in Puffer 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 2 mM β-Mercaptoethanol aufgetragen. Die Gradienten wurden bei 39.000 rpm in einem SW41-Rotor (Beckman) zentrifugiert (3 h, 4 °C). Die Gradienten wurden mit einem Fraktionator (BioComp) fraktioniert, wobei die Absorption bei 254 nm aufgezeichnet wurde. Die Fraktionen, die den 50S-Untereinheiten, den 70S-Ribosomen und den Polysomen entsprechen, wurden zusammen gepoolt. Die RNA wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung isoliert.

Isolierung von 70S-Ribosomen und ribosomalen Untereinheiten

Für die Isolierung von Tight-Couple-Ribosomen54 wurden E. coli-Kulturen über Nacht in 1 L LB/Amp-Medium verdünnt und auf A600 ~ 0,5 gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (5.000 g, 15 min, 4 °C) geerntet, in Puffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0, 6 mM β-Mercaptoethanol, 10 U/ml RQ1 RNase-freie DNase I) resuspendiert und mit einer französischen Presse bei 10.000 psi lysiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation im JA25-50-Rotor (Beckman) bei 13.000 U/min für 30 min bei 4 °C geklärt und die Überstände wurden auf 10 ml 1,1 M Saccharosekissen geladen, die in einem Puffer mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0 und 6 mM β-Mercaptoethanol in 35 ml Quick-Seal-Zentrifugenröhrchen (Beckman) vorbereitet wurden. Die Ribosomen wurden durch Zentrifugation für 16 Stunden bei 36.000 rpm (4 °C) in einem Ti70-Rotor (Beckman) pelletiert. Das Ribosomenpellet wurde in Puffer B (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 6 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl und 6 mM β-Mercaptoethanol) resuspendiert und 100 A260-Einheiten wurden auf einen in Puffer B vorbereiteten 10-40%igen Saccharosegradienten in den Röhrchen eines SW27-Rotors (Beckman) geladen. Die Gradienten wurden 21 Stunden lang bei 20.000 U/min (4 °C) in einem SW27-Rotor zentrifugiert, mit einem Gradientenfraktionator (BioComp) fraktioniert und die Fraktionen, die 70S-Ribosomen und 50S ribosomale Untereinheiten enthielten, wurden separat gepoolt. Das Material wurde mit 2 ml Vivaspin-Konzentratoren (Sartorius) mit Cellulosetriacetat-Membran konzentriert und in Ribosomen-Lagerpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-Mercaptoethanol) zurückgewonnen. Aliquots von Ribosomen und ribosomalen Untereinheiten wurden tiefgefroren und bei -80 °C gelagert. Bei Bedarf wurde die rRNA durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung isoliert.

Für die Isolierung der 50S-Untereinheiten aus den 70S-Ribosomen wurden 130 pmol Ribosomen wie oben beschrieben hergestellt, aber durch Pelletieren konzentriert und im Ribosomen-Lagerpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-Mercaptoethanol) hergestellt, wurden in Puffer D (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 0,5 mM EDTA, 6 mM β-Mercaptoethanol) verdünnt, um eine Endkonzentration von 1,5 mM MgCl2 zu erreichen. Die ribosomalen Untereinheiten wurden durch Zentrifugation in 10-40%igen Saccharosegradienten getrennt, die in Puffer D hergestellt wurden und 1,5 mM MgCl2 enthielten. Die Gradienten wurden 16 Stunden lang bei 27.000 U/min (4 °C) in einem SW27-Rotor (Beckman) zentrifugiert, fraktioniert, konzentriert und im Ribosomen-Lagerpuffer wiedergewonnen, wie oben beschrieben. Aliquots wurden eingefroren und bei -80 °C gelagert.

LC-MS/MS-Analyse ribosomaler Proteine

Die Proteinzusammensetzung von 70S-Ribosomen und 50S-Ribosomen-Untereinheiten von wt und mutierten tight-couple, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurde mit quantitativer Massenspektrometrie55 bestimmt. Ribosomenpräparate wurden in einem molaren Verhältnis von 1:1 mit SILAC-markierten wt-Ribosomen gemischt, die massenmarkiertes Arginin (Arg6: 6HN4O2 und Lysin (Lys4: C6H104N2O2) enthalten (Silantes GmbH, Deutschland). Ribosomale Proteine wurden mit Trypsin (Sigma) oder Lys-C-Protease (Wako, USA) verdaut. Die resultierenden Peptide wurden fraktioniert und mittels LC-MS/MS unter Verwendung von LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific) analysiert. Die Analyse der Proteinidentifizierung und -quantifizierung wurde mit Maxquant v1.5.6.056 und Perseus v1.6.2.357 durchgeführt. Die Maxquant-Suche erfolgte mit der E. coli MG1655-Protein-Sequenzdatenbank von UniProtKB (24.04.2019). Die Proteinhäufigkeit wurde für die Proteine der großen und kleinen Untereinheiten getrennt normalisiert, indem das mittlere L/M-Verhältnis auf 1 verschoben wurde.

Chemische Untersuchung der rRNA-Struktur

Die rRNA-Struktur wurde in den 70S-Ribosomen untersucht, die aus wt- oder mutierten Zellen isoliert wurden. Die Ribosomen (10 pmol) wurden in 50 μl Modifikationspuffer gegeben und durch 5-minütige Inkubation bei 42 °C aktiviert. Die Modifikationsreaktion wurde durch Zugabe von 2 μl Dimethylsulfat (Sigma), 1:10 in Ethanol verdünnt, gestartet. Die Proben wurden für 10 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Modifikationsreaktionen wurden durch Zugabe von 50 μl frisch hergestellter Stopplösung (600 mM NaOAc, 1 M β-Mercaptoethanol) und 300 μl Ethanol gestoppt. Die Proben wurden ausgefällt, in Puffer (300 mM Natriumacetat, 5 mM EDTA, pH 8,0, pH 7,0, 0,5 % SDS) resuspendiert und die RNA wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung isoliert. Primerverlängerungen wurden mit den Primern NA56-NA57 durchgeführt.

Analyse des Gehalts der mutierten rRNA

Für die Analyse des Vorhandenseins der manipulierten 23S-cp5S rRNA wurde die Gesamt-RNA aus den Saccharosegradientenfraktionen wie oben beschrieben isoliert. Der Gehalt der mutierten 23S-cp5S rRNA wurde durch Primerverlängerung mit NA58- oder NA59-Primern bestimmt. Der 5′–markierte Primer (0,5 pmol) wurde an 1 μg Gesamt-RNA in Hybridisierungspuffer (50 mM K-HEPES, pH 7,0, 100 mM KCl) durch 1-minütige Inkubation bei 90 °C und anschließende 15-minütige Abkühlung auf 42 °C angehängt und mit 2 U AMV Reverse Transkriptase (Roche) 20 Minuten lang bei 42 °C in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 8 µl verlängert. Für den NA58-Primer enthielt die Reaktion 0,25 mM ddATP und 0,2 mM dCTP, dGTP, dTTP. Für den NA59-Primer enthielt die Reaktion 0,25 mM ddCTP und 0,2 mM dATP, dGTP, dTTP. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 120 μl Stopp-Puffer (84 mM NaOAc, 0,8 mM EDTA, pH 8,0, 70 % EtOH), 15-minütige Kühlung bei -80 °C und Pelletierung der Nukleinsäuren durch Zentrifugation bei 15.000 × g für 1 h bei 4 °C beendet. Der Überstand wurde entfernt, die Pellets wurden getrocknet und in Formamid-Ladefarbstoff aufgelöst. Die cDNA-Produkte wurden in einem 12%-igen denaturierenden Polyacrylamid-Gel aufgelöst und durch Phosphorimaging sichtbar gemacht.

In-vitro-Translation

In-vitro-Translationsreaktionen wurden im Δribosome PURExpress cell-free translation system (New England Biolabs) durchgeführt. Die DNA-Templates, die den T7-RNA-Polymerase-Promotor, die Ribosomen-Bindungsstelle und die Protein-codierende Sequenz enthalten, wurden durch PCR hergestellt. Die ermBL-Vorlage wurde mit den Primern NA52-NA55 hergestellt. Die GFP-Vorlage wurde aus dem sf-gfp-Gen des Plasmids pY71-sfGFP58 unter Verwendung der Primer NA31 und NA32 hergestellt. Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) wurde von der mit dem PURExpress-Kit gelieferten Plasmidvorlage exprimiert.

Die Translationsreaktion zur Expression von GFP wurde in einem Gesamtvolumen von 10 μl durchgeführt und enthielt 2 μl der PURExpress-Kit-Lösung A, 1.2 μl der Faktormischung, 1 μl Aminosäuremischung (jeweils 3 mM), 1 μl tRNA (20 μg/ml), 16 U RiboLock RNase-Inhibitor (ThermoFisher), 10 ng GFP-Template und 12 pmol wt- oder mutierte Ribosomen. Die Proben wurden in die Vertiefungen einer 384-Well-Gewebekulturplatte mit schwarzer Wand und klarem Boden (BD Biosciences) gegeben und mit dem Deckel abgedeckt. Die Reaktionen wurden bei 37 °C in einem Mikroplatten-Lesegerät (Tecan) inkubiert, wobei die GFP-Fluoreszenz alle 10 Minuten bei λexc = 488 nm und λem = 520 nm über einen Zeitraum von 4 Stunden aufgezeichnet wurde.

Nach der Expression von DHFR wurde -L-Methionin in das Protein in voller Größe eingebaut. Die Translation erfolgte in 10 μl-Reaktionen, die wie oben beschrieben zusammengesetzt wurden, aber mit 5 μCi -L-Methionin (1175 Ci/mmol) ergänzt wurden, unter Verwendung von 50 ng der DNA-Vorlage und 6 pmol wt- oder mutierten Ribosomen. Die Reaktionen wurden bei 37 °C inkubiert. Alle 12 Minuten wurden 1 μl Aliquots entnommen, mit 3 μl SDS-haltigem Gelladefarbstoff gemischt und auf Eis gelagert, bis der Reaktionsverlauf abgeschlossen war. Die Proteinprodukte wurden durch SDS-Gelelektrophorese in 16,5%igen Bis-Tris-Gelen (Biorad) unter Verwendung von NuPAGE MES/SDS-Laufpuffer (Invitrogen) analysiert. Die Gele wurden angefärbt, getrocknet und über Nacht einem Phosphorimager-Screening unterzogen. Radioaktive Banden wurden durch Phosphorimaging sichtbar gemacht.

Cryo-EM-Analyse der 70S-Ribosomen und 50S-Untereinheiten

Cryo-EM-Gitter wurden wie folgt hergestellt. 400 M Kupfergitter, beschichtet mit Lacey-Kohlenstoff und einer 2 nm dünnen Kohlenstoffschicht (Ted Pella Inc.), wurden mit 20 mA Strom bei negativer Polarität für 60S in einem PELCO easiGlow-Glimmentladungsgerät glühentladen. Ein Vitrobot Mark IV (ThermoFisher) wurde auf 4 °C und 95 % relative Luftfeuchtigkeit voräquilibriert. Ein Aliquot der zuvor schockgefrorenen Ribosomen wurde aufgetaut, und als eine Opaleszenz festgestellt wurde, wurde die Lösung in einer Mikrozentrifuge (10 Minuten bei 16.000 × g bei 4 °C) gereinigt. Die Konzentration des gereinigten Überstands wurde von A260 abgeleitet und mit einem Nanodrop (ThermoFisher) gemessen, und die Ribosomen wurden in LPP-Puffer auf 200 nM verdünnt. Drei µl der 200 nM Ribosomenlösung wurden auf das Gitter aufgetragen; nach einer Verzögerung von 10 Sekunden wurde das Gitter für 4 Sekunden geklebt und dann in flüssiges, stickstoffgekühltes Ethan getaucht.

Daten wurden mit einem Talos-Elektronenmikroskop (ThermoFisher) gesammelt, das bei 200 KV arbeitet und mit einem K3-Direktelektronendetektor (Gatan Inc.) ausgestattet ist, der auf 0,5-1,8 μm Unterfokus zielt. Die Datenerfassung wurde mit SerialEM59 automatisiert, wobei der Strahl gekippt wurde, um mehrere Filme (z. B. eine Aufnahme in der Mitte, 6 mit Verschiebung) an jeder Tischposition zu erfassen60. Die Superresolution-Filme enthielten insgesamt 19 Bilder mit 1,5 e-/Å2 pro Bild für eine Gesamtdosis von 30 e-/Å2 auf der Probe. Insgesamt wurden 5222 Filme über 22 Stunden gesammelt. Die Filme wurden während der Datenerfassung mit IMOD61 ausgerichtet, um die Bilder zu dekomprimieren, die Verstärkungsreferenz anzuwenden, die Superauflösungsdaten auf physische Pixel von 0,87 Å auf der Probe zu binden und die Bilddrift zu korrigieren.

Frühe Schritte der 3D-Kartenerstellung aus der CTF-Bestimmung, referenzfreie Partikelauswahl (489.732 Partikel) und Stackerstellung wurden in cisTEM durchgeführt. Die Partikelausrichtung und -verfeinerung wurde in Frealign 9.11 und cisTEM62,63 durchgeführt. Um die Verarbeitung zu beschleunigen, wurden 2×-, 4×- und 8×-binned Bildstapel mit resample.exe erstellt, das Teil der FREALIGN-Distribution ist64. Das ursprüngliche Modell für die Partikelausrichtung von 70S-Karten war EMD-100365, das mit EMAN266 auf einen 8-fach gebinnten Bildstapel heruntergerechnet wurde. Zwei Runden der Modus-3-Suche mit einem hochauflösenden Cutoff von 30 Å und dann 20 Å wurden unter Verwendung des 8-fach gebinnten Stapels durchgeführt. Anschließend wurden 7 Runden der Modus-1-Verfeinerung mit dem 4fachen, eventuell nicht gebinnten Stapel durchgeführt, wobei schrittweise Auflösungsschalen hinzugefügt wurden (Grenze von 5 Å) und die Auflösung 2,94 Å erreichte. Die Strahlverschiebungsverfeinerung wurde verwendet, um die Gesamtauflösung auf 2,87 Å zu verbessern.

Zwanzig Runden 3D-Maximum-Likelihood-Klassifizierung ohne Maskierung und mit 14 Å Auflösung wurden verwendet, um 8x gebinnte Partikel schnell in 12 Klassen unterschiedlicher Zusammensetzung zu trennen, die 50S-Untereinheiten, 70S-Ribosomen ohne tRNA oder 70S-Ribosomen mit tRNAs und 30S in entweder gedrehter oder nicht gedrehter Konformation zeigen (ergänzende Abb. 3a). 50S-Partikel (133.490), leere 70S-Partikel (120.428) oder tRNA-gebundene 70S-Partikel im nicht-rotierten Zustand (55.677) wurden mit dem 1x binned stack unter Verwendung von merge_classes.exe, Teil des Frealign-Pakets, erstellt, wobei Partikel-Scores von 0 und eine Mindestbelegung von 50 % erforderlich waren. Die Substacks wurden dann mit resample.exe erneut auf 4x gebinnt, um weitere Klassifizierungsschritte zu beschleunigen.

Der 50S-Partikel-Substack wurde mit einer Fokusmaske mit einem Radius von 55 Å um den 5S-rRNA-Teil der 23S-cp5S-Hybrid-rRNA in 6 Klassen unterteilt. Klassen mit schwacher oder fehlender uL16 und/oder bL33 und Klassen, die sich in der 5S rRNA-Position unterscheiden, wurden getrennt. Die Klassen wurden mit den ursprünglichen Ausrichtungs- und Strahlneigungsparametern bei 1x Binning rekonstruiert, und eine dieser Klassen wurde für die Strukturmodellierung verwendet, wie im folgenden Abschnitt beschrieben.

Die 70S-Partikel wurden ebenfalls untersucht. Der leere (keine tRNA) 70S-Partikel-Substapel wurde unter Verwendung der gleichen 55-Å-Fokusmaske in 12 Klassen unterteilt. Die Klassen wiesen Unterschiede in der uL16- und/oder bL33-Besetzung und der 5S rRNA-Position auf, ähnlich wie die oben beschriebenen 50S-Klassen. Im Gegensatz zu den 50S-Partikeln wiesen jedoch 3 von 12 leeren 70S-Klassen ein normal gefaltetes PTC auf.

Die Klassifizierung des tRNA-gebundenen 70S-Partikel-Substapels im klassischen Zustand in 12 Klassen mit derselben Maske ergab eine fast stöchiometrische Belegung von 16 uL, und alle Partikel wiesen ein normal gefaltetes PTC und eine starke P-tRNA-Dichte auf. Im Gegensatz dazu war die tRNA-Besetzung der A-Stelle in einigen Klassen mit schwächerer L33-Dichte schwach. Die Klassifizierung der 70S-Partikel mit einer rotierten 30S- und P/E-tRNA im Hybridzustand in 12 Klassen ergab ebenfalls unterschiedliche Besetzungen von uL16 und bL33, und sieben Klassen wiesen eine abweichende PTC auf.

Die 3,2 Å Kryo-EM-Struktur des 70S-Ribosoms, das mit den A- und P-tRNAs67 gebunden ist, wurde als Ausgangsmodell für die Strukturverfeinerung verwendet. Die Komponenten/Domänen des Ribosoms wurden mit Chimera68 in Karten eingepasst. Dabei wurden die 50S, der L1-Stiel, der L11-Stiel, der 30S-Körper und -Kopf sowie die tRNAs unabhängig voneinander angepasst. Die Modellierung der 5S rRNA und die Anpassungen des PTC und des Dekodierungszentrums erfolgten mit PyMOL69. Die Strukturmodelle wurden mittels Real-Space-Simulated-Annealing-Verfeinerung mit RS Ref 70,71 anhand der entsprechenden Karten verfeinert. Die Verfeinerungsparameter, wie die relative Gewichtung der stereochemischen Beschränkungen und der experimentelle Energieterm, wurden optimiert, um die optimale Stereochemie der Struktur, den Realraum-Korrelationskoeffizienten und den R-Faktor zu erhalten, der über die Anpassung des Modells an die Karte berichtet72. Sekundärstruktureinschränkungen, einschließlich Wasserstoffbrückenbindungseinschränkungen für ribosomale Proteine und Basenpaarungseinschränkungen für RNA-Moleküle, wurden wie beschrieben verwendet73. Die Strukturen wurden anschließend mit phenix.real_space_refine74 verfeinert, gefolgt von einer Verfeinerungsrunde in RSRef, bei der harmonische Beschränkungen angewendet wurden, um die Proteingeometrie zu erhalten70,71. Phenix wurde zur Verfeinerung der B-Faktoren der Modelle gegen ihre jeweiligen Karten ohne B-Faktor-Filterung verwendet74. Die resultierenden Strukturmodelle weisen gute stereochemische Parameter auf, die durch geringe Abweichungen von idealen Bindungslängen und -winkeln gekennzeichnet sind, und stimmen eng mit den entsprechenden Karten überein, wie hohe Korrelationskoeffizienten und niedrige R-Faktoren im realen Raum zeigen (ergänzende Tabelle 2). Die Abbildungen wurden in PyMOL69 erstellt.

Zusammenfassung des Berichts

Weitere Informationen zum Forschungsdesign sind in der Nature Research Reporting Summary verfügbar, die mit diesem Artikel verlinkt ist.