Regulierung der Cholesterinsynthese

00:00:08.12Mein Name ist Russell DeBose-Boyd,
00:00:10.03und ich bin von der Abteilung für Molekulargenetik
00:00:12.01am University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas, Texas.
00:00:15.17In diesem Vortrag,
00:00:17.19werde ich über die Rückkopplungsregulierung der HMG CoA Reduktase sprechen,
00:00:20.
00:00:25.06Diese Folie zeigt also die Struktur von Cholesterin
00:00:27.06und einige der Eigenschaften dieses wichtigen Moleküls.
00:00:31.01Cholesterin ist ein Sterol,
00:00:33.10das sich durch diese Vierringstruktur auszeichnet.
00:00:36.00Diese Vierringstruktur verleiht dem Molekül Steifigkeit,
00:00:39.02was es zu einem idealen Bestandteil von Zellmembranen macht.
00:00:43.18Da Cholesterin eine große Anzahl
00:00:46.07von Kohlenstoff-Kohlenstoff- und Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen hat,
00:00:49.02ist dieses Molekül praktisch unlöslich in Wasser.
00:00:52.07Aus diesem Grund müssen Zellen in der Lage sein, Cholesterin in einem engen Bereich zu halten,
00:00:54.13so dass genügend Cholesterin vorhanden ist,
00:00:58.03so dass genügend Cholesterin für den zellulären Bedarf des Moleküls
00:01:02.13 produziert wird, aber eine toxische Überakkumulation von Cholesterin vermieden wird.
00:01:06.16Eine Überakkumulation von Cholesterin kann auf zellulärer Ebene toxisch sein.
00:01:12.11Diese Folie zeigt nun einige der wesentlichen Funktionen von Cholesterin.
00:01:15.10Cholesterin ist absolut lebensnotwendig.
00:01:17.26Wie ich bereits erwähnt habe,
00:01:19.27eine der bekanntesten Aufgaben von Cholesterin
00:01:22.26ist seine Rolle in den Zellmembranen,
00:01:25.08 wo es eine optimale Membranfluidität aufrechterhält.
00:01:29.00 Cholesterin erweist sich als eine wichtige Vorstufe
00:01:32.01für sehr wichtige Moleküle wie Steroidhormone,
00:01:34.25die helfen, Mädchen und Jungen zu unterscheiden;
00:01:38.19Gallensäuren, die bei der Verdauung und Ernährung helfen, indem sie Nahrungsfette und fettlösliche Vitamine auflösen;
00:01:47.10und schließlich ist Cholesterin reichlich im Gehirn vorhanden,
00:01:50.18, wo es in den Myelinscheiden vorkommt, die die Axone umgeben
00:01:53.17und bei synap… synaptischen Übertragungen helfen.
00:01:58.18Die Zellen in unserem Körper – Säu… Säugetierzellen –
00:02:02.01erwerben Cholesterin aus zwei Quellen.
00:02:04.21 Eine der Quellen ist auf dieser Folie dargestellt,
00:02:07.06 und zwar durch die Synthese von Cholesterin
00:02:09.19aus der Vorstufe Acetyl CoA.
00:02:13.00Die Umwandlung von Acetyl CoA in Cholesterin
00:02:15.21durch die Wirkung von mehr als 20 Enzymen.
00:02:20.22Nun, wie Sie sich vorstellen können,
00:02:22.21ist die Synthese von Cholesterin mit der Produktion mehrerer Zwischenprodukte verbunden,
00:02:26.16und diese Zwischenprodukte selbst
00:02:29.14können auch in sehr wichtige Endprodukte umgewandelt werden.
00:02:33.11 Zum Beispiel ist diese Verbindung, Farnesylpyrophosphat,
00:02:36.29ist eine Vorstufe für eine wichtige Verbindung namens Dolichol,
00:02:40.25die an der N-gebundenen Glykosylierung beteiligt ist.
00:02:43.26Es ist auch eine Vorstufe für Häm und Ubichinone,
00:02:46.10die an der Zellatmung beteiligt sind;
00:02:49.26Vitamin K, das an der Blutgerinnung beteiligt ist;
00:02:53.12und schließlich werden dieses Farnesylpyrophosphat und Geranylgeranylpyrophosphat
00:02:58.06an viele Signalproteine gebunden,
00:03:01.16kleine GTP-Proteine,
00:03:03.22die sie zu den Membranen leiten,
00:03:06.12und diese Modifikation ist absolut notwendig für die normale Zellfunktion.
00:03:13.04Diese Folie zeigt, dass die Cholesterinsynthese
00:03:16.02in verschiedenen Geweben unterschiedlich schnell abläuft.
00:03:19.29Die Leber und die Nebennieren
00:03:23.14synthetisieren das meiste Cholesterin in unserem Körper.
00:03:25.10Und ich sollte darauf hinweisen, dass diese Studie an Mäusen durchgeführt wurde,
00:03:28.06aber ähnliche Effekte werden bei Menschen
00:03:31.07und anderen Primaten beobachtet.
00:03:33.19Die Leber… die Leber synthetisiert große Mengen an Cholesterin
00:03:36.24vor allem für die Produktion von Lipoproteinen
00:03:39.14und auch für die Gallensäuresynthese.
00:03:42.10Die Nebennieren produzieren Cholesterin
00:03:45.28vor allem für die Synthese von Steroidhormonen,
00:03:48.13während der Darm Cholesterin für…
00:03:51.27die Zellteilung synthetisiert.
00:03:54.12Eine große Anzahl von Zellen im Darm wird jeden Tag abgestoßen
00:03:57.12und müssen durch neue Zellen ersetzt werden,
00:03:59.27was eine beträchtliche Menge an Cholesterinsynthese erfordert.
00:04:03.28Ich sollte auch darauf hinweisen, dass der Darm auch eine Quelle der Lipoproteinproduktion ist.
00:04:09.21Die zweite Cholesterinquelle
00:04:12.12ist die der Lipoproteine
00:04:15.16, die von der Leber und dem Darm produziert werden.
00:04:18.06Das hier gezeigte Modell ist ein Low-Density-Lipoprotein.
00:04:23.02Es ist der wichtigste Cholesterinträger im menschlichen Plasma.
00:04:28.02Das Low-Density-Lipoprotein, oder LDL,
00:04:31.14besteht aus einem Kern, der aus freiem Cholesterin besteht.
00:04:36.19Das hydrophobe Cholesterin bildet also den Kern des LDL-Partikels.
00:04:41.19Dieses hydrophobe Cholesterin
00:04:44.01ist von einer Schale umgeben, die aus einem Phospholipid
00:04:47.02mit verschiedenen Mengen an verestertem Cholesterin
00:04:51.13 – das ist Cholesterin, an das eine Fettsäure gebunden wurde –
00:04:55.14die in die Phospholipidhülle eingelagert ist.
00:04:59.03Dieses gesamte LDL-Partikel
00:05:02.18ist von einem Protein namens Apolipoprotein B umgeben.
00:05:08.02Auf dieser Folie ist also dargestellt
00:05:10.17wie Zellen Cholesterin aus diesen beiden Quellen aufnehmen:
00:05:13.13endogene Synthese und aus LDL.
00:05:18.19LDL-Rezeptoren
00:05:21.09 – sie befinden sich auf der Oberfläche der Zellen –
00:05:23.20an LDL binden, indem sie mit diesem Apolipoprotein-B-Partikel
00:05:29.12umgeben, der die Lipoproteinhülle umgibt.
00:05:32.25Wenn das LDL-Partikel an den LDL-Rezeptor bindet,
00:05:35.27wird der gesamte Komplex in beschichtete Gruben internalisiert.
00:05:40.06Und diese beschichteten Gruben werden dann zu Lysosomen geleitet,
00:05:43.07wo das LDL-Partikel abgebaut wird und das Cholesterin
00:05:47.15– freies Cholesterin–
00:05:49.25wird nun freigesetzt und der Zelle für verschiedene Zwecke zur Verfügung gestellt.
00:05:54.18Also, noch einmal, diese zwei Quellen von zellulärem Cholesterin
00:05:58.03– entweder vom Rezeptor… LDL-Rezeptor-vermittelte Endozytose von LDL,
00:06:03.07oder durch endogene Synthese —
00:06:06.02können austauschbar verwendet werden.
00:06:09.01Wenn also zum Beispiel LDL limitierend wird,
00:06:12.00schaltet die Zelle auf endogene Synthese für ihre Cholesterinquellen um.
00:06:18.02Und wenn die endogene Synthese blockiert ist,
00:06:20.05dann können die Zellen nun exogenes LDL
00:06:23.01für ihre Cholesterinquelle verwenden.
00:06:27.00So, wir haben über die essentielle Funktion von Cholesterin gesprochen.
00:06:30.10Es ist wichtig für die Zellmembranen.
00:06:32.11Es ist ein wichtiger Vorläufer der Steroidhormone
00:06:34.28und der Gallensäuren.
00:06:36.16Es gibt aber auch eine schlechte Seite des Cholesterins,
00:06:38.13und die wird auf dieser Folie dargestellt.
00:06:41.00Seit einigen Jahren wird ein erhöhter LDL-Cholesterinspiegel im Blut
00:06:46.14mit einem Risiko für koronare Herzkrankheiten
00:06:49.19und Herzinfarkte in Verbindung gebracht.
00:06:51.16So können Sie hier sehen, dass
00:06:54.27der Cholesterinspiegel im Blut
00:06:57.26wörtlich mit dem Risiko einer koronaren Herzkrankheit korreliert.
00:07:01.09Und das liegt daran, dass erhöhtes Cholesterin
00:07:04.21sich in den Arterien ablagern kann, die zum… zum Herzen führen.
00:07:08.12Und mit der Zeit führt diese Ablagerung
00:07:11.15zu einer Krankheit namens Atherosklerose,
00:07:13.09bei der diese Ablagerung von Cholesterin
00:07:15.04zur Bildung von Plaques
00:07:17.12, die letztendlich den Blutfluss zum Herzen blockieren können,
00:07:19.18 und dadurch einen Herzinfarkt verursachen.
00:07:23.06 Eines der am häufigsten verschriebenen Medikamente
00:07:28.16zur Senkung des LDL-Cholesterins
00:07:31.11ist eine Gruppe von Medikamenten, die Statine genannt werden.
00:07:33.03Hier ist die typische Kernstruktur der Statine
00:07:37.26und einige der verschiedenen Formen von Statinen
00:07:41.29die in der Klinik verwendet werden.
00:07:44.22Im Laufe der Jahre sind die Statine
00:07:47.12zu einem der… das meistverkaufte Medikament…
00:07:49.10in den Vereinigten Staaten
00:07:51.20 aufgrund ihrer Fähigkeit, den LDL-Cholesterinspiegel im Blut zu senken.
00:07:57.19Dieses Experiment zeigt also eine Zusammenfassung von mindestens vier Studien
00:08:02.23die zeigen, dass Statine tatsächlich das LDL-Cholesterin senken
00:08:06.06und dass diese Senkung zu einer geringeren Inzidenz
00:08:10.04von koronaren Herzkrankheiten führt.
00:08:12.11So, hier in den geschlossenen Kreisen sind klinische Studien
00:08:15.11in denen Patienten entweder mit einem Statin, wie in den… wie in den geschlossenen Kreisen gezeigt,
00:08:20.22oder einem Placebo behandelt wurden.
00:08:22.11Und in jeder dieser Studien führte die Statinbehandlung zu
00:08:25.17einem Rückgang des LDL-Cholesterinspiegels,
00:08:28.06und dieser Rückgang des LDL-Cholesterinspiegels
00:08:31.19 führte zu einer Verringerung der koronaren Ereignisse, d.h. der Herzinfarkte.
00:08:35.13Die Frage ist also, wie wirken Statine?
00:08:38.21Und was bewirken Statine?
00:08:40.28Wir haben also zuerst die Frage beantwortet, was Statine bewirken?
00:08:43.16So hemmen Statine das Enzym HMG CoA-Reduktase.
00:08:47.05HMG CoA-Reduktase katalysiert
00:08:50.20den geschwindigkeitsbeschränkenden Schritt bei der Synthese von Cholesterin.
00:08:53.28Es ist eigentlich der vierte Schritt im Cholesterin-Syntheseweg.
00:08:58.06So hemmen Statine kompetitiv die HMG-CoA-Reduktase
00:09:01.20durch Nachahmung des Produkts der Reduktasereaktion,
00:09:05.13Mevalonat.
00:09:07.20Diese kompetitive Hemmung der Reduktase
00:09:10.19ist der Grund für die Fähigkeit der Statine, das
00:09:14.18LDL-Cholesterin im Blut zu senken.
00:09:18.07Wie wirken die Statine also?
00:09:20.17Durch die kompetitive Hemmung der HMG-CoA-Reduktase
00:09:24.01Das führt zu einem Rückgang der Mevalonatmenge
00:09:27.09und natürlich zu einem Rückgang des Cholesterins.
00:09:30.18Dieser Cholesterinabbau führt zu einem Anstieg
00:09:33.12der Transkription des Gens
00:09:36.06das den LDL-Rezeptor kodiert.
00:09:37.25Und infolgedessen steigt die Anzahl der LDL-Rezeptoren auf der Oberfläche
00:09:41.14insbesondere der Leberzellen,
00:09:43.15und diese Zunahme der LDL-Rezeptoren führt
00:09:48.01zu einer erhöhten oder verbesserten Aufnahme von LDL im Blut.
00:09:52.25Und diese Verringerung des LDL im Blut
00:09:55.26ist verantwortlich für die Senkung der koronaren Herzkrankheit
00:09:58.20bei mit Statinen behandelten Patienten.
00:10:02.12Die klinische Wirkung von Statinen
00:10:05.26wird jedoch durch
00:10:09.06die kompensatorische Erhöhung der HMG-CoA-Reduktase
00:10:11.10, die mit einer Statintherapie einhergeht.
00:10:13.19Und das ist auf dieser Folie zu sehen.
00:10:15.13Das ist ein Immunoblot des HMG-CoA-Reduktase-Proteins
00:10:19.03in den Lebern von Mäusen, die mit einem Statin gefüttert wurden,
00:10:22.17oder sogar in kultivierten Zellen
00:10:25.00die in vitro mit Statinen behandelt wurden.
00:10:26.24Und wie Sie sehen können,
00:10:28.20verursacht die Behandlung mit Statinen eine deutliche Anreicherung
00:10:31.09der HMG-CoA-Reduktase.
00:10:33.10Und diese Anhäufung, wie ich bereits erwähnt habe,
00:10:35.24schwächt die klinischen Wirkungen der Statine ab.
00:10:38.12Unsere nächste Frage ist also, warum bewirken Statine, dass
00:10:41.27die HMG-CoA-Reduktase sich auf einem so hohen Niveau anhäuft?
00:10:44.14Das ist schätzungsweise
00:10:47.02mindestens das 200-fache.
00:10:49.29Normalerweise unterliegt die HMG-CoA-Reduktase
00:10:51.25einer enormen Rückkopplungsregelung.
00:10:55.02Und diese Rückkopplungsregulierung wird zum Teil
00:10:57.29durch Sterole vermittelt.
00:11:00.02Die Behandlung mit Statinen, wie ich bereits erwähnt habe,
00:11:02.05blockiert die Aktivität der HMG-CoA-Reduktase,
00:11:04.12und verhindert die Synthese dieser Sterolmoleküle.
00:11:07.29 Und natürlich ist diese Verhinderung der Sterolsynthese
00:11:10.26 tatsächlich für die Hochregulierung der LDL-Rezeptoren
00:11:14.17und die anschließende Senkung des LDL-Cholesterins verantwortlich.
00:11:18.09 Da die Statine
00:11:21.03 jedoch die Synthese von Sterolen blockieren,
00:11:22.18 stören sie die Rückkopplungsregulierung der Reduktase.
00:11:25.14Und infolgedessen finden drei Ereignisse statt.
00:11:27.28Erstens, wegen dieser Reduzierung von Cholesterin
00:11:31.09und anderen Produkten des Cholesterin-Syntheseweges,
00:11:35.08gibt es eine verstärkte Transkription des Reduktase-Gens,
00:11:39.07es gibt eine verstärkte Translation
00:11:41.28der Reduktase-mRNA,
00:11:43.17und schließlich eine erhöhte Stabilität
00:11:45.24des Reduktaseproteins.
00:11:47.13Diese drei Ereignisse sind also verantwortlich
00:11:49.19für die deutliche Zunahme des Reduktaseproteins
00:11:52.03, die ich Ihnen auf der vorherigen Folie gezeigt habe.
00:11:55.18Im Laufe der Jahre
00:11:57.06 hat sich mein Labor also dafür interessiert,
00:11:59.27die molekularen Mechanismen zu verstehen, die
00:12:02.22dieser erhöhten Stabilität des Proteins zugrunde liegen,
00:12:04.09und das wird das Thema des restlichen Vortrags sein.
00:12:09.16Dieses Dia zeigt also, dass Sterole
00:12:13.08den Abbau
00:12:15.26der HMG-CoA-Reduktase beschleunigen.
00:12:17.14In diesem Experiment,
00:12:19.11 haben wir die klassische Puls-Chase-Analyse
00:12:20.29 verwendet, um die Stabilität der Reduktase in Zellen
00:12:23.16zu überwachen, die in Abwesenheit oder Anwesenheit von Sterolen behandelt wurden.
00:12:26.00Was wir hier also tun, ist, dass wir normalerweise Zellen mit Radioaktivität markieren,
00:12:29.27einer kleinen Untergruppe von HMG-CoA-Reduktase-Molekülen.
00:12:33.25Wir nehmen dann diese Radioaktivität weg,
00:12:35.25und verfolgen dann die Präs…
00:12:37.25die Stabilität des Reduktase-Proteins
00:12:39.26in Abwesenheit oder Anwesenheit von Sterolen.
00:12:44.10Und wie Sie hier sehen können,
00:12:46.08wenn die Zellen in Medien
00:12:49.07gejagt werden, die keine Radioaktivität enthalten,
00:12:51.01ist die Reduktase in Abwesenheit von Sterolen
00:12:52.28mit der Zeit ziemlich stabil.
00:12:55.16Wie Sie jedoch sehen können,
00:12:57.21verursacht die Zugabe von Sterolen in das Verfolgungsmedium
00:12:59.26eine deutliche Abnahme der Reduktasespiegel.
00:13:02.20 Auch dies ist ein Hinweis auf den durch Sterole beschleunigten
00:13:06.04Abbau der HMG-CoA-Reduktase.
00:13:09.16 Um die molekularen Mechanismen
00:13:11.22für diesen Sterol-induzierten Abbau der Reduktase,
00:13:14.15müssen wir die Struktur des HMG-CoA-Reduktase-Proteins verstehen.
00:13:18.05Und die Domänenstruktur der Reduktase
00:13:20.14ist auf dieser Folie dargestellt.
00:13:22.18Die HMG-CoA-Reduktase
00:13:24.16besteht also aus zwei verschiedenen Domänen.
00:13:26.28Sie hat eine N-terminale Domäne
00:13:29.06, die das Protein in den Membranen des endoplasmatischen Retikulums,
00:13:32.14oder des ER verankert.
00:13:35.00Diese N-terminale Domäne,
00:13:36.29die wir als Membrandomäne bezeichnen,
00:13:39.04enthält acht membranüberspannende Regionen.
00:13:42.05Und ihr folgt die zweite Domäne der HMG-CoA-Reduktase,
00:13:45.07die wir die katalytische Domäne nennen.
00:13:47.24Die katalytische Domäne ragt also in das Zytosol der Zellen
00:13:51.24und enthält die gesamte enzymatische Aktivität der HMG-CoA-Reduktase.
00:13:56.03In der Tat ist eine verkürzte Version der Reduktase
00:13:59.29, die nur die katalytische Domäne
00:14:02.13enthält, kann die Synthese von Mevalonat
00:14:06.28in Zellen, denen HMG-CoA-Reduktase fehlt, vollständig retten.
00:14:10.13Die katalytische Domäne ist also sowohl notwendig als auch ausreichend
00:14:13.01für die Synthese von Mevalonat.
00:14:15.29Was dann die Frage aufwirft,
00:14:17.28warum ist dieses Protein membrangebunden?
00:14:19.26Und es stellt sich heraus, dass die Reduktase
00:14:22.02bereits in der Hefe ein membrangebundenes Protein ist.
00:14:25.18Die Funktion der Membrandomäne der Reduktase
00:14:28.26 wurde in diesem frühen Experiment
00:14:31.27 veranschaulicht, in dem die Stabilität der katalytischen Domäne
00:14:35.08 – die, wie wir uns erinnern, die gesamte enzymatische Aktivität enthält – mit der des Enzyms in voller Länge verglichen wurde.
00:14:37.26Und auch hier wurde eine einfache Puls-Chase-Analyse
00:14:42.21 verwendet, um die Stabilität dieser beiden Proteine zu überwachen.
00:14:47.13Wie Sie in der Tafel links sehen können,
00:14:49.03erzeugt die abgeschnittene katalytische Domäne
00:14:53.14ein sehr stabiles Protein, das… wichtig,
00:14:57.08seine Degradation wird durch Sterole nicht beeinflusst.
00:14:59.20Im Gegensatz dazu ist das Protein in voller Länge – das wiederum die Membrandomäne enthält –
00:15:03.07weniger stabil, sogar in Abwesenheit von Sterolen.
00:15:06.13Und man kann sehen, dass Sterole den
00:15:09.25Abbau der HMG-CoA-Reduktase deutlich beschleunigen,
00:15:12.09was darauf hinweist, dass die Membrandomäne…
00:15:15.12die Funktion der Membrandomäne
00:15:17.25für diesen Sterol-beschleunigten oder Sterol-induzierten Abbau ist.
00:15:22.08So, was die früheren Studien andeuteten
00:15:25.12darauf hin, dass die Membrandomäne der Reduktase
00:15:28.03für den sterolbeschleunigten Abbau notwendig und ausreichend ist,
00:15:30.25und sie legen nahe, dass die Membrandomäne,
00:15:33.16entweder direkt oder indirekt,
00:15:35.16den intrazellulären Gehalt an Sterolen erfassen kann.
00:15:38.00Und die Erfassung führt vielleicht,
00:15:41.02eine Konformationsänderung in der Reduktase-Membrandomäne
00:15:43.29, die das Protein für einen schnellen Abbau anfällig macht.
00:15:48.14 Und da Statine die Cholesterinsynthese blockieren,
00:15:52.01 blockieren Statine in der Tat diesen
00:15:54.22 so genannten ER-assoziierten Abbau – oder ERAD –
00:15:57.08der HMG-CoA-Reduktase.
00:16:02.23Ein entscheidender Durchbruch in unserem Verständnis
00:16:04.23des ERAD der HMG-CoA-Reduktase
00:16:06.15wurde durch die Entdeckung eines Paares von Proteinen
00:16:08.28 – ER-Membranproteine –
00:16:10.23genannt Insig-1 und Insig-2.
00:16:14.15Diese Insig-Proteine sind für die Zwecke dieses Vortrags
00:16:16.27sehr redundant.
00:16:18.14Sie spielen redundante Rollen beim Abbau, oder ERAD,
00:16:22.06der HMG CoA-Reduktase.
00:16:24.00Sie sind identisch… sie sind etwa 85% identisch,
00:16:26.23und sie sind hochgradig hydrophobe Proteine.
00:16:29.24Die Rolle von Insigs beim ERAD der HMG-CoA-Reduktase
00:16:34.28wurde in diesem Experiment zum ersten Mal veranschaulicht.
00:16:37.19Auch hier haben wir die Puls-Chase-Analyse
00:16:40.15, um den Sterol-beschleunigten Abbau
00:16:43.29der Reduktase in Zellen
00:16:47.02 zu messen, die entweder mit Kontrollmolekülen,
00:16:51.06 sogenannten siRNAs,
00:16:53.05oder Zellen, die mit siRNAs
00:16:55.26 transfiziert wurden, die zum Knockdown der Expression
00:16:58.13von sowohl Insig-1 als auch Insig-2 führen würden.
00:17:02.07Und wie man in der linken Tafel sehen kann,
00:17:04.13in den Zellen, die mit den Kontroll-siRNAs transfiziert wurden,
00:17:08.04beschleunigen die Sterole deutlich den Abbau
00:17:12.07der HMG CoA-Reduktase.
00:17:14.13Die offenen Kreise sind also Experimente, die in Abwesenheit
00:17:17.09und die geschlossenen Kreise sind Experimente, die
00:17:20.15in Anwesenheit von Sterolen durchgeführt wurden.
00:17:22.12Und man kann leicht erkennen, dass die Ausschaltung von Insig-1 und Insig-2
00:17:26.23den durch Sterole beschleunigten Abbau vollständig aufhebt,
00:17:30.02was darauf hinweist, dass diese Proteine
00:17:32.28eine Schlüsselrolle in diesem Prozess spielen.
00:17:35.27Unsere nächste Frage ist also,
00:17:38.02was ist der Mechanismus
00:17:39.26durch den die Insigs den ERAD der HMG CoA-Reduktase beschleunigen?
00:17:47.09Dieses Experiment…
00:17:48.21dieses Dia zeigt, dass Inhibitoren des Proteasoms, des 26S-Proteasoms,
00:17:53.21den Sterol-induzierten Abbau der HMG-CoA-Reduktase blockieren.
00:17:57.15Wie man also in diesem Experiment sehen kann…
00:18:00.18in den ersten beiden Spuren, bewirken Sterole einen deutlichen Abbau der Reduktase,
00:18:04.17und dieser Abbau wird vollständig blockiert
00:18:06.19wenn diese Zellen mit dem Proteasom-Inhibitor behandelt werden.
00:18:12.03So, mit… das erlaubt uns, ein anderes Modell zu schaffen
00:18:15.27, in dem wiederum die Membrandomäne der Reduktase
00:18:18.25 entweder direkt oder indirekt
00:18:21.22 den Gehalt an intrazellulären Sterolen erfasst,
00:18:24.15Dies veranlasst die Reduktase, an Insig zu binden,
00:18:28.12und diese Insig-Bindung führt zu Reaktionen, die bewirken, dass die Reduktase
00:18:32.06jetzt durch das 26S-Proteasom abgebaut wird.
00:18:37.22Jetzt weiß man, dass die meisten Substrate der Proteasomen
00:18:41.00ihre vorherige Ubiquitinierung benötigen.
00:18:44.05Ubiquitinierung ist ein Prozess, bei dem
00:18:46.23das kleine Protein Ubiquitin kovalent an
00:18:50.16Substratmoleküle gebunden wird.
00:18:52.08Und sobald eine Kette von Ubiquitinen
00:18:54.16an Substrate gebunden ist,
00:18:56.08wird es von den Proteasomen erkannt und abgebaut.
00:19:00.25Dies wird Polyubiquitinierung genannt,
00:19:02.25und die Polyubiquitinierung von Proteinen
00:19:05.14erfordert die Wirkung von mindestens drei verschiedenen Arten von Enzymen.
00:19:07.29Das ist auf dieser Folie dargestellt.
00:19:11.09Im ersten Schritt wird
00:19:13.15Ubiquitin aktiviert
00:19:15.20in einer ATP-abhängigen Weise durch ein Enzym namens E1,
00:19:19.11oder Ubiquitin-aktivierendes Protein.
00:19:22.15Im nächsten Schritt wird das Ubiquitin vom E1 auf das…
00:19:27.13auf ein anderes Enzym namens E2, oder Ubiquitin-konjugierendes Enzym.
00:19:32.16Im letzten Schritt verbindet sich das E2 mit einer E3,
00:19:36.24oder Ubiquitin-Ligase,
00:19:39.08, die wiederum mit dem Substrat verbunden ist,
00:19:42.09hier in grün dargestellt.
00:19:44.11Die E3 erleichtert den Transfer von Ubiquitin
00:19:47.27vom Ubiquitin-konjugierenden Enzym
00:19:50.00auf einen Lysinrest im Substratprotein,
00:19:53.08 wodurch ein ubiquitiniertes Substrat entsteht.
00:19:57.28Dieser Prozess findet nun viele Male statt,
00:20:00.02bis eine Ubiquitin-Kette auf dem Substratprotein aufgebaut ist.
00:20:06.02Das kann nun von den Proteasomen für den Abbau erkannt werden.
00:20:10.18Wenn man also bedenkt, dass diese Insig-Proteine
00:20:12.26für den Abbau der Reduktase erforderlich sind,
00:20:15.08und dass die Reduktase tatsächlich von Proteasomen abgebaut wird,
00:20:19.02ist unsere nächste Frage: Ist die Reduktase ubiquitiniert?
00:20:23.20Diese Frage wurde in diesem Experiment
00:20:26.11beantwortet, das auf dieser Folie gezeigt wird.
00:20:28.21Wir haben also in diesem Experiment Zellen
00:20:31.15in Abwesenheit und Anwesenheit von Sterolen
00:20:33.20und dem Proteasom-Inhibitor behandelt.
00:20:37.05Nach diesen Behandlungen,
00:20:39.11wird die Reduktase immunopräzipitiert
00:20:41.21und untersuchen diese Immunpräzipitate dann entweder auf die gesamte Reduktase,
00:20:43.20wie in der unteren Tafel gezeigt,
00:20:45.18oder auf ubiquitinierte Reduktase.
00:20:49.07So, wie Sie in der ersten Spur sehen können,
00:20:51.01selbst wenn die Reduktase in diesen Experimenten heruntergezogen wird,
00:20:55.11sehen wir keine Reaktivität mit Ubiquitinierung.
00:20:58.14Sterole bewirken jedoch, dass die Reduktase ubiquitiniert wird.
00:21:03.09Und diese Ubiquitinierung wird deutlich verstärkt
00:21:07.22wenn wir auch Proteasominhibitoren einbeziehen.
00:21:09.27Das zeigt uns also, dass Sterole
00:21:12.16die Reduktase ubiquitinieren,
00:21:14.20und dieses ubiquitinierte Protein wird nun von Proteasomen abgebaut,
00:21:17.18wie die Stabilität der ubiquitinierten Reduktase
00:21:21.21durch diese Proteasomeninhibitoren anzeigt.
00:21:24.27Unsere nächste Frage ist,
00:21:27.07sind Insigs für diese Sterol-induzierte Ubiquitinierung der Reduktase erforderlich?
00:21:32.16Und wieder wenden wir uns siRNAs zu.
00:21:35.08Zellen wurden entweder mit der Kontroll-siRNA
00:21:38 transfiziert.18oder siRNAs gegen Insig-1 und -2 transfiziert.
00:21:41.03Wir behandeln diese Zellen dann in Abwesenheit oder Anwesenheit von Sterolen,
00:21:43.20und testen dann auf ubiquitinierte Reduktase.
00:21:47.16 Und wie Sie in den ersten beiden Spuren sehen können,
00:21:49.10ist die Reduktase in Anwesenheit von Sterolen gut ubiquitiniert,
00:21:52.08und der Knockdown von Insig-1 und Insig-2
00:21:56.02 hebt diese Ubiquitinierung vollständig auf.
00:22:01.01Damit können wir nun weitere Lücken in unserem Modell
00:22:04.07für die Insig-vermittelte ERAD der HMG-CoA-Reduktase füllen.
00:22:09.14 Nun stellt sich heraus, dass eine Untergruppe der Insig-Moleküle
00:22:12.00 tatsächlich mit einem E3/E2-Ubiquitin-Ligase-Komplex assoziiert.
00:22:16.27Auch in Gegenwart von Sterolen,
00:22:20.15die Membrandomäne der Reduktase
00:22:23.03sensiert das Sterol,
00:22:24.25und diese Sensierung bewirkt, dass die Reduktase an Insigs bindet,
00:22:27.28und diese Insigs
00:22:31.13dann die Reduktase mit dem E3/E2-Ubiquitin-Ligase-Komplex verbinden.
00:22:36.26Diese Verbindung führt dann zur Ubiquitinierung der Reduktase
00:22:40.00an zwei Lysinresten in der Membrandomäne.
00:22:43.17Und diese Ubiquitinierung bewirkt dann, dass die Reduktase
00:22:46.17aus der ER-Membran entfernt
00:22:50.09und anschließend von Proteasomen abgebaut wird,
00:22:52.22durch einen Prozess, den wir nicht ganz…
00:22:55.07durch einen Prozess, den wir nicht ganz verstehen.
00:23:00.20Zusammengefasst habe ich Ihnen heute gesagt
00:23:03.16, dass die HMG-CoA-Reduktase das geschwindigkeitsbeschränkende Enzym
00:23:06.07des Cholesterin-Syntheseweges ist,
00:23:08.01und ein Ziel dieser cholesterinsenkenden Statin-Medikamente ist.
00:23:11.26 Die Reduktase wird durch ein sehr komplexes
00:23:15.16Rückkopplungsregulierungssystem
00:23:18.01gesteuert, das durch Cholesterin und andere Arten von Sterolen vermittelt wird.
00:23:20.18 Und dass Statine dieses Rückkopplungsregulationssystem stören,
00:23:24.03zum Teil durch die Blockierung dieser Insig-vermittelten Ubiquitinierung
00:23:27.10und ERAD der HMG CoA-Reduktase.