Plasmid-vermittelte AmpC β-Lactamase CITM- und DHAM-Gene unter gramnegativen klinischen Isolaten

Hintergrund

Die Arzneimittelresistenz unter einigen der gramnegativen Bakterien (Enterobacterales, Acinetobacter baumannii und Pseudomonas aeruginosa) ist aufgetaucht und weltweit verbreitet. In der Familie der Enterobacterales sind Escherichia coli und Klebsiella spp. häufig isolierte Organismen, die bemerkenswerte Resistenzeigenschaften aufweisen. β-Lactame sind die am häufigsten verschriebenen Medikamente gegen diese widerspenstigen Stämme und machen allein etwa zwei Drittel der jüngsten klinischen Verschreibungen aus.1 Diese Gruppe umfasst vier große chemische Klassen: Penicilline, Cephalosporine, Carbapeneme und Monobactame, wobei Carbapeneme als letztes Mittel in der empirischen Therapie gegen pathogene Stämme von grampositiven, gramnegativen und anaeroben Bakterien eingesetzt werden.2

Resistenz gegen β-Lactame ist auf die Produktion von β-Lactamasen zurückzuführen, jenen hydrolytischen Enzymen, die in der Lage sind, die Antibiotika zu inaktivieren, bevor sie die an der Zytoplasmamembran befindlichen Penicillin-bindenden Proteine (PBPs) erreichen.3 Zu den wichtigsten β-Lactamase-Familien gehören Plasmid-vermittelte Extended-Spectrum-β-Lactamasen (ESBLs), AmpC, Cephalosporinasen und Carbapenemasen. Alle Klassen wurden weltweit nachgewiesen, wobei sich einige von ihnen auf bestimmte Länder konzentrieren.1

Die Gene, die für AmpC-β-Lactamase kodieren, haben sich weit verbreitet und sind in bakteriellen Plasmiden weit verbreitet. Die erste plasmidkodierte AmpC-Variante wurde erstmals 1989 aus Klebsiella pneumoniae, das in Südkorea isoliert wurde, identifiziert. Sie wurde aufgrund ihres phänotypischen Merkmals, das mit Cephamycinase assoziiert ist, CMY-1 genannt und war notorisch resistent gegen Cefoxitin.4,5 In kurzer Zeit wurden viele Familien von plasmidvermittelten AmpC-Varianten entdeckt, vor allem bei Isolaten von K. pneumoniae und E. coli. Bakterien, die plasmidvermittelte AmpC-Genotypen besaßen, wurden auf der Grundlage der Homologie in der Nukleinsäuresequenz zugeordnet und bildeten eine größere Anzahl von Bakteriengattungen, die als Quelle für diese Plasmide und eine Reihe von AmpC-Familien dienten.6 Bis heute wurden weltweit folgende AmpC-Familien gemeldet: zwei Familien von CMY-β-Lactamasen (CMY-1 und CMY-2), die aus Aeromonas hydrophila bzw. Citrobacter freundii isoliert wurden; Enzyme vom FOX- und MOX-Typ, die aus Aeromonas spp.Die ACC-Familie stammt aus H. alvei, die LAT-Familie der Cephalosporinasen wurde aus C. freundii isoliert, die MIR- und ACT-Familien stammen aus Enterobacter spp. und die DHA-Familie wurde aus Morganella morganii isoliert.4,6,7 Die Mehrzahl der plasmidkodierten AmpC-Gene findet sich in Isolaten von E. coli und K. pneumoniae bei nosokomialen Infektionen, während die Resistenz bei anderen gramnegativen Bakterien wie E. cloacae, C. freundii, S. marcescens und M. morganii durch chromosomal vermittelte AmpC-β-Laktamasen übertragen wird, was die Resistenz gegen Breitspektrum-Cephalosporine verstärkt.8 Die ESBL-produzierenden Organismen, die häufig durch Koexpression mit AmpC-β-Laktamasen gekennzeichnet sind, stellen eine ernsthafte Bedrohung für die Diagnose und Behandlung von Krankheitserregern dar.

Außerdem sind AmpC-β-Laktamase-Gene, insbesondere MOXM, CITM, DHAM, EBCM, FOXM und ACCM, für die Entwicklung einer Breitspektrum-Resistenz gegen die meisten β-Laktame (außer Cefepime und Carbapeneme) verantwortlich. Darüber hinaus kann der Erwerb dieser Gene in den Bakterien die Resistenz weiter verstärken, da Inhibitoren von Enzymen der Klasse A (einschließlich Clavulansäure, Sulbactam und Tazobactam) und p-Chlormercuribenzoat nicht gegen AmpC-β-Lactamasen wirksam sind, obwohl einige von ihnen durch Tazobactam oder Sulbactam gehemmt werden können.6

Obwohl Anstrengungen unternommen werden, um das Wachstum und die Ausbreitung arzneimittelresistenter Erreger einzudämmen, sind die Studien zu AmpC-β-Laktamasen in ressourcenbegrenzten Umgebungen noch immer unzureichend. Der wichtigste Schritt bei der Bewältigung der zunehmenden antimikrobiellen Resistenz (AMR) ist der präzise Nachweis von pathogenen (und/oder resistenten) Stämmen in diagnostischen Labors. Dennoch liefern die Laborprotokolle für die Routineberichterstattung in Nepal keine präzisen Ergebnisse, da AmpC-β-Laktamasen durch phänotypische Tests allein nur schwer zu identifizieren sind und in klinischen Labors oft fälschlicherweise als ESBLs erkannt werden. Enterobacterales-Isolate, die im Screening-Test des ESBL-Phänotyps positiv, im Bestätigungstest jedoch negativ sind, werden in der Regel als potenzielle AmpC β-Laktamasen-Produzenten betrachtet, die entweder durch eine chromosomale Depression oder einen Plasmid-Transfer übertragen werden.9

Selbst erfahrene klinische Mikrobiologen sind nicht in der Lage, plasmidvermittelte AmpC β-Laktamasen zu identifizieren, was auf einen Bedarf an präziseren und spezifischeren Methoden für den sofortigen Nachweis hinweist. Einige dieser Verfahren sind jedoch ressourcenintensiv und erfordern häufig Reagenzien, die nicht leicht erhältlich sind.10 Aus diesen Gründen bleiben AmpC-β-Lactamasen in klinischen Proben unentdeckt. Daher wurde ein zuverlässigeres und valideres Laborprotokoll entwickelt, das aus der Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) besteht, um die Diagnose von plasmidkodierten AmpC-Genen zu erleichtern, die für die Expression von AmpC-β-Lactamasen bei verschiedenen klinischen Infektionen verantwortlich sind.11

Die meisten Studien konzentrieren sich auf die Prävalenz von ESBL-Enzymen in gramnegativen klinischen Isolaten in Nepal.12-16 Es gibt nur eine begrenzte Anzahl von Studien über AmpC-β-Lactamasen-Enzyme in gramnegativen Bakterien in Nepal. Eine Studie, die im Kathmandutal durchgeführt wurde, berichtete, dass 27,8 % der Enterobacterales-Isolate AmpC-β-Laktamasen produzierten, wobei die phänotypische Methode verwendet wurde.17 Unseres Wissens gibt es nur wenige Studien zum Nachweis und zur Charakterisierung von AmpC-β-Laktamasen-Enzymen in gramnegativen Bakterien, die sowohl phänotypische als auch genotypische Methoden in Nepal verwenden. Es ist wichtig, phänotypische und genotypische Standardmethoden für Antibiotika-Empfindlichkeitstests einzuführen, um arzneimittelresistente Erreger in Krankenhäusern zu untersuchen. Diese Studie wurde durchgeführt, um die AmpC-β-Laktamasen-Gene (blaCITM und blaDHAM) in gramnegativen bakteriellen Isolaten zu isolieren und zu identifizieren, wobei sowohl phänotypische Screening- als auch Bestätigungsmethoden verwendet wurden.

Methoden

Studiendesign

Dies ist eine krankenhausbasierte Querschnittsstudie, die von Juni 2017 bis Januar 2018 am Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences (ANIAS) durchgeführt wurde. Insgesamt wurden 1151 nicht-duplizierte klinische Proben gesammelt und während des Studienzeitraums verarbeitet. Die Proben umfassten Urin (n=412), Blut (n=206), Katheterspitzen (n=163), Eiter (n=132), Stuhl (n=89), Liquor (n=53), Wundabstriche (n=58) und Vaginalabstriche (n=38). Die Proben wurden in einem sterilen, gut beschrifteten und auslaufsicheren Behälter entnommen und so schnell wie möglich verarbeitet.18 Alle Patienten, die zu Besuch kamen und bei denen der Verdacht auf bakterielle Infektionen bestand und die ihr Einverständnis zur Teilnahme an der Studie gaben, wurden in die Studie aufgenommen. Studienteilnehmer mit unzureichenden demografischen Angaben wurden ausgeschlossen.

Kultur der Proben und Identifizierung der Isolate

Proben wurden gemäß den mikrobiologischen Standardrichtlinien für die Entnahme von Urin, Stuhl, Eiter, Blut, Liquor und Katheterspitzen entnommen. Die in Frage kommenden Proben wurden dann auf Blutagar (BA), Schokoladenagar (CA) und MacConkey-Agar (MA) beimpft. Darüber hinaus wurden Urinproben auf chromogenem UTI-Agar beimpft. Die Isolate wurden anhand von mikrobiologischen Standardparametern wie morphologischem Aussehen der Kolonien, Färbereaktionen und biochemischen Eigenschaften identifiziert.19,20

Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung

Alle identifizierten gramnegativen Isolate wurden außerdem in vitro mit der modifizierten Kirby-Bauer-Diskusdiffusionsmethode auf ihre antimikrobielle Empfindlichkeit getestet.21 Zunächst wurden Inokulums hergestellt, indem Bakterienkolonien von Nährstoffagar in sterile normale Kochsalzlösung übertragen wurden. Die Trübung der Inokulum wurde entsprechend den CLSI-Richtlinien auf 0,5 McFarland-Standard eingestellt. Die Teppichkultur der Testinokulum wurde ebenfalls auf Muller-Hinton-Agar (MHA) hergestellt. Antibiotikaplättchen (HiMedia India Pvt. Ltd, Bengaluru, Indien) wurden in den folgenden Verhältnissen verwendet: Amoxicillin (10 μg), Azithromycin (10 μg), Amikacin (30 μg), Aztreonam (30 μg), Cefoxitin (30 μg), Ceftazidim (30 μg), Ciprofloxacin (5 μg), Imipenem (10 μg), Piperacillin/Tazobactam (100/10 μg), Ertapenem (10 μg), Meropenem (10 μg), Cotrimoxazol (25 μg) und Cefepime (30 μg). Die angeimpfte Platte wurde bei 37 °C bis zu 18 Stunden aerob bebrütet. Nach ausreichender Bebrütung wurden die Hemmzonen (ZOI) um die Platten gemessen und das Ergebnis als empfindlich, intermediär oder resistent eingestuft.21 Isolate, die eine Resistenz gegen drei oder mehr Antibiotika verschiedener Klassen aufwiesen, wurden als multiresistent interpretiert.22

Screening auf AmpC β-Laktamasen

Die Isolate wurden zunächst auf eine mögliche AmpC β-Laktamasen-Produktion gemäß den CLSI-Richtlinien 2019 untersucht.23 Für das Screening wurden Ceftazidim oder Cefotaxim oder Cefoxitin oder Ceftriaxon in einer Dosierung von jeweils 30 µg im AST-Test untersucht und Organismen, die gegen diese Antibiotika resistent waren (mit einer Hemmzone mit einem Durchmesser von ≤ 18 mm), wurden als potenzielle AmpC-Produzenten eingestuft und weiteren Bestätigungstests unterzogen.

Bestätigung für AmpC β-Laktamasen

Screening-positive AmpC β-Laktamasen-Produzenten wurden durch einen AmpC-Disk-Test und einen inhibitorbasierten Bestätigungstest (Boronsäuretest) bestätigt.

Im Boronsäuretest wurde die Teppichkultur des Testorganismus auf einer MHA-Platte mit 0,5 McFarland-Lösungen angelegt. Zwei Cefoxitin-Scheiben (30 µg), von denen eine mit Phenylborsäure (400 µg) versetzt war, wurden auf die Teppichkultur auf der MHA-Platte gelegt und bebrütet, und die Ergebnisse wurden ausgewertet. Wenn sich die Hemmzone um ≥5 mm vergrößerte, wenn die gewünschte Antibiotika-Scheibe (Ceftazidim oder Cefotaxim) in Kombination mit Phenylborsäure untersucht wurde, als beim Test ohne die Kombination (Antibiotika-Scheibe allein), wurde das Isolat als positiver Bestätigungstest gekennzeichnet.

Im Scheibenannäherungstest wurden Scheiben auf die Teppichkultur von E. coli ATCC 25922 gelegt. Eine 30μg Ceftazidim-Scheibe wurde in der Mitte der Platte platziert, gefolgt von 10μg Imipenem-, 30μg Cefoxitin- und 20/10μg Amoxicillin/Clavulanat-Scheiben, die in einem Abstand von 20 mm von der Ceftazidim-Scheibe platziert wurden. Die Kolonien des Testorganismus wurden auf eine Scheibe gegeben, dann wurde die Platte umgedreht und 24 Stunden lang bei 37°C aerob bebrütet. Jede Vertiefung oder Abflachung des ZOI deutete auf die Produktion von AmpC β-Lactamase durch die Isolate hin.20,24

Konservierung von AmpC β-Lactamase-positiven Isolaten

Zur Konservierung wurde die Methode der Glycerin-Stammpräparation verwendet. Die Organismen wurden in Tryptic Soy Broth (TSB) mit 40 % Glycerin konserviert und bei -20 ºC gelagert.25

Crude Plasmid-DNA-Extraktion

Eine isolierte Kolonie des Testorganismus wurde in Luria Bertani (LB)-Bouillon geimpft. Das Inokulum wurde in einem Wasserbadschüttler bei 37°C für 18-24 Stunden aerob bebrütet. Die so erhaltene Reinkultur wurde einer alkalischen Lysemethode unterzogen, um die Plasmid-DNA zu extrahieren. Die extrahierte Plasmid-DNA wurde dann in TE-Puffer suspendiert und bis zur weiteren Untersuchung bei -20°C gelagert.26

Amplifikation der AmpC β-Lactamase-Gene (blaCITM und blaDHAM) durch PCR

Die AmpC β-Lactamase-Gene (blaCITM und blaDHAM) wurden durch PCR unter Verwendung der Plasmid-DNA-Präparation als Vorlage amplifiziert. Die für das blaCITM-Gen verwendeten Primer waren CLR5-F (5ʹ TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA -3ʹ) und CLR5-R (5ʹ- TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC -3ʹ) als Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer, während die Primer für das blaDHAM-Gen die Vorwärtssequenz DHAM für (5ʹ AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG -3ʹ) und die Rückwärtssequenz DHAM_rev (3ʹ CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC -5ʹ) waren.11 Das Reaktionsvolumen wurde auf 25 µL eingestellt, indem 12,5 µL des 1X-Mastermixes (5× HOT FIREPol Blend Master Mix Ready to Load, Solis BioDyne, Estland), jeweils 0,5 µL der Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 4 µL der DNA-Vorlage sowie 7,5 µL ddH2O hinzugefügt wurden. Die optimierte PCR-Amplifikation beider Gene erfolgte bei 94 ºC für 3 Minuten zur anfänglichen Denaturierung; 35 Zyklen Denaturierung bei 94 ºC für 30 Sekunden; 25 Zyklen Annealing bei 62 ºC für 30 Sekunden; 35 Zyklen Verlängerung bei 72 ºC für 1 Minute; und abschließende Verlängerung bei 72 ºC für 7 Minuten.11,27

Reinigung der DNA

Die Plasmid-DNA wurde durch Ethanolfällung gereinigt. Bei dieser Methode wurde das DNA-Pellet mit eiskaltem 70%igem Ethanol gespült und 10 Minuten lang getrocknet, was die Verdampfung des Alkohols erleichtert. Das DNA-Pellet wurde in einer Pufferlösung suspendiert, die Tris, EDTA und RNasen enthielt, um die verbleibenden Verunreinigungen auszuspülen.

Detektion der PCR-Produkte durch Gelelektrophorese

Die amplifizierten Produkte wurden durch Gelelektrophorese in einem 1,5%igen Agarosegel, das mit 0,1µl Ethidiumbromid gefärbt war, sichtbar gemacht. Nach der Gelpräparation wurden 2µl der 100bp-DNA-Leiter als Marker in die erste Vertiefung gegeben, 2µl der Negativkontrolle in eine weitere Vertiefung, 2µl der Positivkontrolle in eine weitere Vertiefung und 2µl der PCR-Produkte in die restlichen Vertiefungen. Schließlich wurde das Gel unter UV-Transilluminator sichtbar gemacht.28

Qualitätskontrolle

Für die Verfahren in dieser Studie wurde ein aseptisches Standardverfahren angewandt. Alle Chargen der Kulturmedien und chemischen Reagenzien wurden mit aseptischen Techniken gemäß den CLSI-Richtlinien verarbeitet. Bei der AST wurde die Qualitätskontrolle durch die Verwendung von Kontrollstämmen von E. coli ATCC 25922 gewährleistet. Bei der PCR wurde die Qualitätskontrolle durch die Verwendung von Klebsiella-Isolaten sichergestellt, die beide fraglichen Gene tragen, während Leerwert- oder Negativkontrollen ohne die Anwendung von Nukleinsäuren hergestellt wurden. Alle diese Kontrollen wurden in jeder Charge des PCR-Tests verwendet.

Statistische Analyse

Die Daten wurden mit der SPSS-Software Version 24.0 eingegeben und analysiert. Die Assoziationen wurden mit Hilfe von Chi-Quadrat-Tests mit 95 % Konfidenzintervall (CI) zwischen demografischen Variablen wie Geschlecht und Alter der Probanden untersucht.

Ergebnisse

Demografische und klinische Merkmale der eingeschriebenen Patienten

Unter den 1151 eingeschriebenen Patienten waren 54,2 % (624/1151) männlich und 45,8 % (527/1151) weiblich. Von den 253 bakteriellen Keimen waren 47,8 % (121/253) männlich und 52,2 % (132/253) weiblich. Von den insgesamt 253 Keimen stammten 26,1% (66/253) aus Urinproben, gefolgt von Katheterspitzen (17,4%; 44/253), Blut (16,2%; 41/253), Eiter (11,9%; 30/253) und Wundabstrichen (10,7%; 27/253). Bei der altersmäßigen Verteilung der Patienten wurde das höchste Wachstum der bakteriellen Erreger in der Altersgruppe 16-45 Jahre (39,5%; 100/253) festgestellt, gefolgt von 46-60 Jahre (30,1%; 76/253), >60 Jahre (24,1%; 61/253) und 0-15 Jahre (6,3%; 16/253) (Tabelle 1).

Tabelle 1 Demographische und klinische Merkmale der Patienten, die das Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences besuchen

Verteilung der Bakterienisolate in klinischen Proben

Unter insgesamt 1151 klinischen Proben, 22 % (253/1151) zeigten Wachstum auf Nährböden. Von den 253 bakteriellen Isolaten waren die meisten (89,3 %; 226/253) gramnegative Bakterien. Unter den Bakterien war E. coli (28,5 %; 72/253) der vorherrschende Organismus, gefolgt von Pseudomonas aeruginosa (16,2 %; 41/253), Acinetobacter baumannii (15,8 %; 40/253), Gram-positiven Bakterien (10,7 %; 27/253), Klebsiella pneumoniae (9,9 %; 25/253) und Klebsiella oxytoca (4.7%; 12/253) (Abbildung 1)

Abbildung 1 Verteilung der bakteriellen Gattungen in kulturpositiven klinischen Proben (n=253).

Antibiotika-Empfindlichkeitsmuster von isolierten gramnegativen Bakterien

Von 226 gramnegativen Bakterienisolaten wurden 66.8% (151/226) waren resistent gegen Cefoxitin, gefolgt von Ceftazidim (58,4%; 132/226), Ciprofloxacin (53,5%; 121/226) und Cefepime (51.8%; 117/226), während die Isolate am empfindlichsten auf Meropenem (69%; 156/226), Ertapenem (68,6%; 155/226), Imipenem (66,8%; 151/226), Amikacin (61,1%; 138/226), Piperacillin/Tazobactam (56,6%; 128/226) und Azithromycin (53.1%; 120/226) (Tabelle 2).

Tabelle 2 Antibiotika-Empfindlichkeitsmuster gramnegativer Bakterienisolate (n=226)

Multidrug Resistance (MDR) Pattern in the Isolates

Von 226 Isolaten, 46.9% (106/226) der Isolate waren MDR. Der höchste Prozentsatz an MDR wurde bei E. coli (31,1%; 33/106) gefunden, gefolgt von P. aeruginosa (20,8%; 22/106), A. baumannii (18,9%; 20/106), K. pneumoniae (9,4%; 10/106) und K. oxytoca (4,7%; 5/106) (Abbildung 2). Bei den einzelnen Arten wurde der höchste Prozentsatz an Multiresistenz bei C. freundii (100 %; 8/8) festgestellt, gefolgt von P. aeruginosa (53,6 %; 22/41), C. koseri (50 %; 2/4), A. baumannii (50 %; 20/40) und E. coli (45,8 %; 33/72) (Abbildung 2).

Abbildung 2 Verteilung der MDR-Bakterien und Gesamt-MDR in % und MDR innerhalb jeder Spezies.

AmpC-Nachweis durch verschiedene Tests

Von 226 gramnegativen Isolaten zeigten 50 % (113/226) Resistenz gegen Cefoxitin. AmpC-β-Lactamase produzierende Isolate wurden durch zwei verschiedene Bestätigungstests, Disk-Tests und Boronsäure-Tests, bestätigt. Von den einundneunzig Isolaten zeigten 91,2 % (83/91) ein positives Ergebnis in beiden Tests und 8,8 % (8/91) Isolate zeigten nur im Boronsäuretest ein positives Ergebnis, das durch mindestens einen Test bestätigt wurde, und wurden als AmpC β-Lactamase-Produzenten betrachtet.

Prävalenz von blaCITM- und blaDHAM-Genen in AmpC β-Lactamase produzierenden gramnegativen Isolaten

Im PCR-Test wurden 90,1% (82/91) und 87,91% (80/91) der Isolate positiv auf blaCITM und blaDHAM getestet. Die amplifizierten blaCITM- und blaDHAM-Gene wurden mit einer Amplikongröße von 465bp bzw. 405bp nachgewiesen (Abbildungen 3 und 4).

Abbildung 3 Agarosegel-Elektrophorese (1,5%) zur Auftrennung der PCR-Produkte. Spur 2, Positivkontrolle; Spur 3, 5 und 7 sind CITM-positiv; Spur 4 und 6, CITM-negativ; und Spur 8, Negativkontrolle.

Abbildung 4 Agarose-Gelelektrophorese (1,5%) zur Auftrennung der PCR-Produkte. Lane 2, positive Kontrolle; Lane 3, 4, 6 und 7 sind Dham-positiv; Lane 5, Dham-negativ; und Lane 8, negative Kontrolle.

Verteilung der AmpC β-Lactamase-, blaCITM- und blaDHAM-Gene unter gramnegativen Isolaten und ihre Beziehung zu Geschlecht, Alter, klinischen Proben und klinischen Isolaten

Von 91 AmpC-Produzenten stammten 50,6% (46/91) der Isolate von weiblichen und 49,4% (45/91) von männlichen Patienten. Ebenso wurde ein gleicher Prozentsatz (50 %; 41/82) der blaCITM-Gene in Proben beider Geschlechter gefunden, während 51,3 % (41/80) und 48,7 % (39/80) der blaDHAM-Gene in den Proben von männlichen bzw. weiblichen Patienten nachgewiesen wurden. Es gab keinen signifikanten Zusammenhang zwischen dem Geschlecht des Patienten und der Produktion von AmpC-Enzymen und AmpC-Genen (Tabelle 3).

Tabelle 3 Verteilung von AmpC β-Lactamase-, CITM- und DHAM-Genen unter gramnegativen Bakterienisolaten und ihre Beziehung zu Geschlecht, Alter und klinischen Proben

Die höchste Anzahl von AmpC β-Lactamase-Produzenten (40.7%; 37/91) und die höchste Prävalenz von Isolaten, die blaCITM (40,2%; 33/82) und blaDHAM (41,2%; 33/80) produzieren, wurden aus der Altersgruppe (46-60) Jahre gewonnen, gefolgt von (16-45) Jahren (30,8%; 28/91), (29,3%;24/82) bzw. 31,3%; 25/80). Es bestand ein signifikanter Zusammenhang zwischen der AmpC-β-Lactamase-Enzymproduktion und der Altersgruppe (p=0,01), während andere Faktoren, einschließlich des Erwerbs der blaCITM- und blaDHAM-Gene, keinen signifikanten Zusammenhang mit dem Alter der Patienten aufwiesen (Tabelle 3).

Unter den klinischen Proben wurde die höchste Anzahl von AmpC β-Lactamase-produzierenden Isolaten (20,9%; 19/91) aus Blut und Katheterspitzen nachgewiesen, gefolgt von Urin (18,7%; 17/91), Eiter (13,3%; 12/91) und Wundabstrichen (9,9%; 9/91). Ebenso wurden die meisten blaCITM- und blaDHAM-produzierenden Isolate in Katheterspitzen (21,9%; 18/82); (22,5%; 18/80) nachgewiesen, gefolgt von Blut (19,5%; 16/82); (21,3%; 17/80), Urin (17,0%; 14/82); (17,5%; 14/80) und Eiter (13,4%; 11/82); (8,8%; 7/80). Es bestand kein signifikanter Zusammenhang zwischen den klinischen Proben, der AmpC β-Lactamase-Produktion und den Genen: blaCITM und blaDHAM (Tabelle 3).

Verteilung von AmpC β-Lactamasen und Erwerb von blaCITM- und blaDHAM-Genen in verschiedenen gramnegativen Bakterien

Die höchste Prävalenz von AmpC β-Lactamase-Enzymen wurde bei E. coli (28,6%; 26/91), gefolgt von P. aeruginosa (26,4%; 24/91), A. baumannii (13,2%; 12/91) und K. pneumoniae (10,9%; 10/91). Die höchste Prävalenz der blaCITM- und blaDHAM-Gene wurde bei E. coli (30,6 %; 25/82) (31,3 %; 25/80) festgestellt, gefolgt von P. aeruginosa (25,7 %; 21/82), (22,5 %; 18/80), A. baumannii (12,2 %; 10/82), (12,4 %; 10/80) und K. pneumoniae (10,9 %; 9/82) bzw. (12,4 %; 10/80) (Tabelle 3).

Diskussion

Die zunehmende Inzidenz antimikrobieller Resistenzen ist nach wie vor eines der größten Probleme der öffentlichen Gesundheit in Entwicklungsländern wie Nepal29 , das zu verlängerten Krankenhausaufenthalten, erhöhten Behandlungskosten, eingeschränkten therapeutischen Möglichkeiten und erhöhter Morbidität und Mortalität geführt hat.29,30 Die Produktion von β-Laktamasen ist der wichtigste Abwehrmechanismus gegen β-Laktam-Antibiotika. Diese Studie wurde durchgeführt, um das Vorhandensein von β-Laktamasen der Bernsteinklasse C (AmpC) in gramnegativen Organismen zu untersuchen, die aus klinischen Proben stammen, die am ANIAS, Kathmandu, Nepal, gewonnen wurden. In dieser Studie wurde außerdem die Prävalenz von AmpC-β-Laktamase-Genen (blaCITM und blaDHAM) mittels PCR-Assay untersucht. Wir fanden eine hohe Prävalenz dieser Enzyme und Gene, obwohl die Prävalenz dieser Enzyme von einer geografischen Region zur anderen, innerhalb und zwischen den Ländern variierte.

Von 1151 klinischen Proben wiesen nur 253 (21,9%) ein signifikantes Wachstum von Organismen auf. Von den insgesamt 253 Bakterien waren mehr als neunzig Prozent gramnegative Bakterien, wobei E. coli das vorherrschende Isolat unter ihnen war. Unsere Ergebnisse stimmen mit früheren Studien überein, die aus dem Everest Hospital, Baneshwor,14 dem Alka Hospital, Jawlakhel,31 dem National Public Health Laboratory, Teku,32 dem Universal College of Medical Sciences, Bhairahawa,33 dem B.P Koirala Institute of Health Sciences, Dharan,34 dem Nobel Medical College, Biratnagar,35 Neu-Delhi, Indien,36 Al-Najaf City, Irak,37 dem Shashemene Referral Hospital, Äthiopien,38 und Mexiko-Stadt, Mexiko,39 berichtet wurden. Bei den weiblichen Patienten wurde eine etwas höhere Rate an gramnegativen bakteriellen Infektionen beobachtet, was auf die höhere Prävalenz von Harnwegsinfektionen bei Frauen zurückzuführen sein könnte. Dies stimmt mit früheren Studien aus dem Model Hospital, Kathmandu,17 und Andra-Pradesh, Indien, überein.40 In Übereinstimmung mit dieser Studie wurde in einer Studie, die im indischen Bundesstaat Uttar Pradesh durchgeführt wurde, eine höhere Rate an Eiterinfektionen bei postoperativen Fällen bei Frauen (63,33%) als bei Männern (43,75%) festgestellt.41

In dieser Studie wiesen gramnegative Bakterienisolate eine höhere Resistenz gegen die folgenden Antibiotika auf: Cefoxitin, Ceftazidim, Ciprofloxacin und Cefepim, gefolgt von Cotrimoxazol, während Meropenem, Imipenem, Piperacillin-Tazobactam und Azithromycin als die empfindlichsten Antibiotika angegeben wurden. Ein vergleichbares Muster wurde in einigen früheren Befunden aus dem Chitwan Medical College, Chitwan,42 dem Padma Hospital, Pokhara, beobachtet.43 Cefoxitin und Ceftazidim mit niedrigen Empfindlichkeitsraten sind die Medikamente der ersten Wahl, die leicht von den bakteriellen Enzymen hydrolysiert werden und bei der Behandlung von Infektionen, die durch gramnegative Erreger verursacht werden, weniger nützlich sind. Ähnlich wie in unserer Studie waren Imipenem/Meropenem die empfindlichsten Medikamente in früheren Studien aus dem Model Hospital, Kathmandu,17 Madrid, Spanien,44 und Wisconsin, USA.45

Antimikrobielle Resistenz (AMR) mit zunehmender Ausbreitung von MDR ist ein globales Problem, und ihre Auswirkungen sind in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen, in denen die Belastung durch Infektionskrankheiten hoch ist, größer.30 Die Behandlung von MDR-Mikroben ist teuer und schwierig und wird durch die hohe Prävalenz nosokomialer Infektionen weiter erschwert.46 In dieser Studie wurde bei fast der Hälfte der isolierten gramnegativen Isolate (46,9 %; 106/226) eine MDR festgestellt. Eine höhere Prävalenz von MDR-Bakterien wurde in einigen anderen Studien in Kathmandu46-49 und anderen Bezirken Nepals festgestellt.15,50,51 Die Produktion von ESBL, Metallo β-Lactamase (MBL) oder AmpC β-Lactamase könnte der Grund für die geringere Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika der neueren Generation sein.52 Darüber hinaus tritt Multidrug-Resistenz aufgrund der Aggregation und Expression verschiedener Gene auf resistenten (R-)Plasmiden oder Genen auf, die für Multidrug-Efflux-Pumpen kodieren.53 Darüber hinaus sind die Gene, die für die Expression von β-Lactamase-Enzymen verantwortlich sind, ständig mit den Nicht-β-Lactam-Antibiotika wie Aminoglykosiden und Fluorchinolonen assoziiert.

In dieser Studie wurde eine höhere AmpC-Produktion bei männlichen Patienten (41,67 %) als bei weiblichen (38,98 %) festgestellt. Die Ergebnisse dieser Studie stimmen mit einigen anderen Studien aus Kano im Nordwesten Nigerias überein.54 Unsere Ergebnisse unterschieden sich jedoch von Studien, die aus Benin, Nigeria, berichtet wurden.55 In vielen Studien wurde eine höhere Prävalenz von Harnwegsinfektionen mit Multiresistenz bei Frauen festgestellt, was möglicherweise auf die höhere Prävalenz von AmpC-produzierenden Erregern bei Frauen zurückzuführen ist, da sie anfälliger für Harnwegsinfektionen sind als Männer.

Die Verwendung der Cefoxitin-Resistenz in diagnostischen Labors dient als zuverlässiges Screening-Mittel/Marker zum Nachweis der AmpC-Produktion. Darüber hinaus bietet dieser Marker einen guten negativen prädiktiven Wert.

Trotz ihres breiten Spektrums haben einige der Studien die Verwendung von Cefoxitin als schlechtes Screening-Mittel für die AmpC-Produktion hervorgehoben. Dies könnte auf die Existenz alternativer Mechanismen neben der AmpC-Produktion zurückzuführen sein (einer davon ist die Mutation des Porinkanals), die zu einer falsch-positiven Interpretation (als Cefoxitin-Resistenz) führen kann.52 Unsere Studie ergab, dass ein Drittel der gramnegativen Isolate (>40%) für die AmpC-Produktion verantwortlich waren. Die Ergebnisse dieser Studie stehen im Gegensatz zu der Studie aus dem Model Hospital, Kathmandu.17 Der Unterschied könnte auf die in dieser Studie verwendete phänotypische Nachweismethode zurückzuführen sein, bei der ein Cefoxitin-Resistenztest und ein AmpC-Scheibentest mit Cefoxitin (30 µg) verwendet wurden. Als Bestätigungstest wurde der Phenylboronsäuretest mit Cefoxitin 30µg/400µg Phenylboronsäure verwendet. Boronsäurederivate erwiesen sich als reversible Inhibitoren von AmpC-β-Lactamase-Enzymen.56

In dieser Studie wurde die AmpC-Produktion bei 91 (80,53%) von 113 Isolaten beobachtet. Die AmpC-Produktionsrate in unserer Studie ist etwas höher als in anderen Studien, die aus dem Model Hospital, Kathmandu,17 dem Chitwan Medical College,57 Bharatpur, Chitwan,58 und Indien berichtet wurden.59

Um die Einschränkungen durch eine der Methoden zu kompensieren, kann die Integration beider Techniken in die Routinediagnose die Sensitivität und Spezifität der Tests in der klinischen Umgebung erhöhen.

Insgesamt 73 Gram-negative Isolate zeigten das Vorhandensein von sowohl blaCITM- als auch blaDHAM-Genen. Diese Ergebnisse stimmen mit einer früheren Studie aus Ilam, Iran, überein.27 In einer ähnlichen Studie aus Indien wurde gezeigt, dass blaCITM-Gene in E. coli häufiger vorkommen.60 In unserer Studie wurde die Prävalenz von AmpC-assoziierten Genen (blaCITM und blaDHAM) mit phänotypischen und genotypischen Methoden untersucht. Diese Studie liefert eine umfassende Analyse der gramnegativen Bakterien, die mit der Produktion von AmpC-β-Laktamase assoziiert sind, und ihrer Antibiotika-Empfindlichkeitsmuster unter klinischen Isolaten. Die Ergebnisse dieser Studie sind wichtig für die Information über die Resistenzmuster verschiedener Organismen gegenüber Cephalosporinen. Die Überwachung der Multiresistenz mit β-Laktamase, einschließlich ESBL-, MBL- und AmpC-Produktion, ist für die klinische Routinepraxis erforderlich, um die Behandlung zu optimieren und weitere Resistenzen unter β-Laktam-Antibiotika zu verhindern.13,61,62

Stärken und Grenzen

Dies ist die erste Studie, in der AmpC-β-Lactamase-Gene (blaCITM und blaDHAM) unter Verwendung sowohl phänotypischer als auch molekularer Tests bei Patienten in einem tertiären Gesundheitszentrum in Nepal untersucht wurden. Die Ergebnisse dieser Studie können in die antimikrobielle Politik für tertiäre Gesundheitszentren einfließen, einschließlich der Vorbereitung des Managements von Krankenhausinfektionen, des Behandlungsprotokolls und der Diagnoseverfahren. Es gibt einige Einschränkungen dieser Studie, darunter die Untersuchung einer begrenzten Anzahl von AmpC-β-Laktamasen, die kurze Studiendauer und die Durchführung in einem einzigen tertiären Pflegezentrum. Künftige Studien können darauf aufbauen und eine Längsschnittstudie an mehreren tertiären Versorgungszentren durchführen, in der alle β-Laktamasen wie ESBL, MBL, KPC und die wichtigsten für die Resistenz verantwortlichen Gene untersucht werden. Als erste Studie ihrer Art, die phänotypische und molekulare Methoden trianguliert, wird diese Studie eine wertvolle Referenz für zukünftige Studien über AmpC-β-Laktamasen und die Prävalenz von blaCITM- und blaDHAM-Genen in anderen Einrichtungen/Krankenhäusern in Nepal sein.

Schlussfolgerung

Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine reduzierte Empfindlichkeit gegenüber Cefoxitin bei gramnegativen Isolaten mit dem Vorhandensein von plasmidvermittelten AmpC-Genen verbunden ist. Da es keine einzige definitive Methode gibt, wird vorgeschlagen, mehrere phänotypische Nachweismethoden gleichzeitig für den präzisen Nachweis von AmpC-β-Laktamase produzierenden Bakterien zu verwenden. In dieser Studie wurden mit der PCR fast 90 % der AmpC-β-Lactamase-Gene (blaCITM und blaDHAM) unter den phänotypisch bestätigten Isolaten nachgewiesen. Die hohe Prävalenz von resistenten Genen und MDR unter gramnegativen Isolaten ist ein alarmierendes Zeichen, das dringende Interventionsmaßnahmen erfordert, um das Wachstum und die Verbreitung dieser Isolate einzudämmen.