Luciferase Assays

Das Verständnis dafür, wie ein Promotor oder ein Response-Element die Genexpression kontrollieren kann, ist einfacher, wenn es mit einem Reportergen untersucht wird. Luziferase-Enzyme eignen sich ideal für Reporter-Assays mit einfacher lichtbasierter Detektion und hoher Empfindlichkeit, mit der selbst kleine Veränderungen der Expression quantifiziert werden können. Reporter-Assays werden häufig zur Bewertung von Veränderungen der Promotoraktivität verwendet, können aber auch zur Untersuchung der Signaltransduktion, der Proteinfunktion, der miRNA-Regulierung und sogar zur Echtzeitmessung von Prozessen in lebenden Organismen eingesetzt werden.

Die Grundlage eines Reporter-Assays ist der Vektor, der das Reporter-Gen trägt, und die Nachweisreagenzien, die ein Substrat zur Umwandlung der Aktivität des Luciferase-Enzyms in ein Lichtsignal liefern. Dual-Luciferase-Detektionsreagenzien löschen das erste Reportersignal, bevor sie das zweite ablesen, so dass zwei Reporter nacheinander aus derselben Probe gemessen werden können. Der zweite Reporter wird häufig als interne Kontrolle verwendet, um genauere Daten zu erhalten.

Nachdem der Reportervektor ausgewählt und alle Elemente eingeklont wurden (falls erforderlich), wird der Vektor in kultivierte Zellen eingeführt, in der Regel mit Transfektionsmethoden, exprimiert und die Aktivität mit lytischen (Endpunkt-) Reagenzien oder Reagenzien für lebende Zellen nachgewiesen, um Veränderungen in denselben Zellen über einen bestimmten Zeitraum zu messen. Luciferase-Reporter-Assays können mit anderen Assays gemultiplext werden, um Apoptose, Stoffwechsel und mehr zu bewerten. Die Messung von Luciferase-Assays wird in der Regel mit einem plattenbasierten Luminometer durchgeführt.