ISH: In-situ-Hybridisierungsprotokoll

Probenlagerung

RNA-Konservierung
Die Konservierung von RNA wird durch das Vorhandensein des Enzyms RNase erschwert. Dieses Enzym befindet sich auf Glaswaren, in Reagenzien und auf dem Personal und dessen Kleidung. RNase zerstört schnell jegliche RNA in der Zelle oder der RNA-Sonde selbst, so dass die Benutzer sicherstellen müssen, dass sie sterile Techniken, Handschuhe und Lösungen verwenden, um eine RNase-Kontamination der Sonde oder der Gewebe-RNA zu verhindern.

Allgemeine Probenlagerung bei Verwendung von Gefrierschnitten
Für beste Ergebnisse bei älteren Objektträgern sollten diese nicht trocken bei Raumtemperatur gelagert werden. Lagern Sie sie stattdessen in 100 %igem Ethanol bei -20 °C oder in einer mit Frischhaltefolie abgedeckten Plastikbox bei -20 °C oder -80 °C. Auf diese Weise bleiben die Objektträger mehrere Jahre lang haltbar.

Wahl der Sonde

RNA-Sonden

RNA-Sonden sollten 250-1.500 Basen lang sein; Sonden mit einer Länge von etwa 800 Basen weisen die höchste Empfindlichkeit und Spezifität auf. Die Transkriptionsvorlagen sollten die Transkription sowohl der Sonden-RNA (Antisense-Strang) als auch der Negativkontroll-RNA (Sense-Strang) ermöglichen. Klonen Sie dazu in einen Vektor mit opponierbaren Promotoren. Zirkuläre Vorlagen müssen vor der Herstellung einer Sonde linearisiert werden, obwohl auch PCR-Vorlagen verwendet werden können.

DNA-Sonden

DNA-Sonden bieten eine hohe Empfindlichkeit für die In-situ-Hybridisierung. Sie hybridisieren im Vergleich zu RNA-Sonden nicht so stark an die mRNA-Zielmoleküle, so dass in den Waschvorgängen nach der Hybridisierung kein Formaldehyd verwendet werden sollte.

Die Spezifität der Sonden ist wichtig. Wenn die genaue Nukleotidsequenz der mRNA oder DNA in der Zelle bekannt ist, kann eine präzise komplementäre Sonde entworfen werden. Wenn >5 % der Basenpaare nicht komplementär sind, wird die Sonde nur lose mit der Zielsequenz hybridisieren. Dies bedeutet, dass die Sonde während der Wasch- und Detektionsschritte eher ausgewaschen wird und möglicherweise nicht korrekt detektiert werden kann.

Digoxigenin (DIG)-markierte RNA-Sonde in situ Hybridisierungsprotokoll

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung DIG-markierter einzelsträngiger RNA-Sonden zum Nachweis der Expression des interessierenden Gens in in Paraffin eingebetteten Schnitten.

1) Entparaffinierung

Für gefrorene Schnitte, beginnen Sie mit Schritt 2. Bei formaldehydfixierten, in Paraffin eingebetteten Schnitten fahren Sie mit diesem Schritt fort.

Bevor Sie fortfahren, müssen die Objektträger deparaffiniert und rehydriert werden. Eine unvollständige Entfernung des Paraffins kann zu einer schlechten Färbung der Schnitte führen.

Die Objektträger in ein Gestell legen und die folgenden Waschvorgänge durchführen:

• Xylol: 2×3 min
• Xylol 1:1 mit 100% Ethanol: 3 min
• 100% Ethanol: 2×3 min
• 95% Ethanol: 3 min
• 70 % Ethanol: 3 min
• 50 % Ethanol: 3 min
• Spülen mit kaltem Leitungswasser

Die Objektträger bis zum Antigenabruf im Leitungswasser lassen. Ab diesem Zeitpunkt dürfen die Objektträger nicht mehr trocknen, da dies zu unspezifischer Antikörperbindung und starker Hintergrundfärbung führt.

2) Antigenrückgewinnung

Mit 20 µg/mL Proteinase K in vorgewärmtem 50 mM Tris für 10-20 min bei 37°C verdauen. Die Inkubationszeit und die Proteinase-K-Konzentration müssen möglicherweise optimiert werden.

Wir empfehlen, ein Proteinase-K-Titrationsexperiment durchzuführen, um die optimalen Bedingungen zu ermitteln. Ein unzureichender Aufschluss verringert das Hybridisierungssignal, ein zu starker Aufschluss führt zu einer schlechten Gewebemorphologie, was die Lokalisierung des Hybridisierungssignals sehr schwierig macht. Die optimale Proteinase-K-Konzentration hängt vom Gewebetyp, der Dauer der Fixierung und der Größe des Gewebes ab.

3) Objektträger 5x in destilliertem Wasser spülen.
4) Objektträger 20 Sekunden lang in eiskalte 20%ige (v/v) Essigsäure tauchen. Dadurch werden die Zellen permeabilisiert, um den Zugang zur Sonde und zum Antikörper zu ermöglichen.
5) Dehydrieren Sie die Objektträger, indem Sie sie ca. 1 Minute pro Waschgang in 70 %igem, 95 %igem und 100 %igem Ethanol waschen und dann an der Luft trocknen lassen.
6) Geben Sie 100 µl der Hybridisierungslösung auf jeden Objektträger.

Salzlösung (20x)

• 4 M NaCl
• 100 mM EDTA
• 200 mM Tris-HCl pH 7,5
• 100 mM NaH2PO4.2H2O

Denhardts Lösung (100x)

• 10 g Ficoll
• 10 g PVP (Polyvinylpyrrolidin)
• 10 g Rinderserumalbumin (BSA)
• 500 mL steriles dH2O

7) Inkubieren Sie die Objektträger für 1 Stunde in einer befeuchteten Hybridisierungskammer bei der gewünschten Hybridisierungstemperatur. Typische Hybridisierungstemperaturen liegen zwischen 55-62°C.
8) Verdünnen Sie die Sonden in Hybridisierungslösung in PCR-Gefäßen. Erhitzen Sie die RNA- oder DNA-Sonde in einem PCR-Block 2 Minuten lang auf 95 °C, um sie zu denaturieren. Sofort auf Eis abkühlen, um ein Re-Annealing zu verhindern.
9) Die Hybridisierungslösung abtropfen lassen. 50-100 μl der verdünnten Sonde pro Abschnitt zugeben, so dass die gesamte Probe bedeckt ist. In der befeuchteten Hybridisierungskammer bei 65 °C über Nacht inkubieren. Decken Sie die Probe mit einem Deckblatt ab, um Verdunstung zu verhindern.

In diesem Schritt hybridisiert die RNA-Sonde mit der entsprechenden mRNA bzw. die DNA-Sonde mit der entsprechenden zellulären DNA. Optimieren Sie die Hybridisierungstemperatur in Abhängigkeit von der Sequenz der verwendeten Sonde sowie dem Zell- oder Gewebetyp. Diese Temperatur sollte für jeden analysierten Gewebetyp optimiert werden.

Die optimale Hybridisierungstemperatur für Sonden hängt vom Prozentsatz der in der Zielsequenz vorhandenen Basen ab. Die Konzentration von Cytosin und Guanin in der Sequenz sind wichtige Faktoren.

10) Stringency Washes

Lösungsparameter wie Temperatur, Salz- und Detergenskonzentration können manipuliert werden, um unspezifische Wechselwirkungen zu beseitigen.

Zur Herstellung von 1 L 20x Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC)

• 175,3 g NaCl (3 M)
• 88.2 g Natriumcitrat
• 800 mL steriles dH2O
• Mit Zitronensäure auf pH 5 einstellen, auf 1 L auffüllen und autoklavieren

Waschen 1

• 50% Formamid in 2x SSC
• 3×5 min, 37-45°C

Überschüssige Sonde und Hybridisierungspuffer bei höheren Temperaturen (bis zu 65°C) kurzzeitig abwaschen. Bei zu langem Verbleib kann zu viel der hybridisierten Sonden-RNA/DNA abgewaschen werden.

Waschen 2

• 0,1-2x SSC
• 3×5 min, 25-75°C

Dieser Schritt entfernt unspezifische und/oder repetitive DNA/RNA-Hybridisierung.

Befolgen Sie die folgenden Richtlinien zur Optimierung der Temperatur und Salzkonzentration für Stringenzwaschungen:

• Für sehr kurze DNA/RNA-Sonden (0.5-3 kb) oder sehr komplexe Sonden sollte die Waschtemperatur niedriger sein (bis zu 45°C) und die Stringenz niedriger (1-2x SSC).
• Für Einzellokus- oder große Sonden sollte die Temperatur bei 65°C und die Stringenz hoch sein (unter 0.
• Die Temperatur und die Stringenz sollten bei sich wiederholenden Sonden (wie Alpha-Satelliten-Wiederholungen) am höchsten sein.

11) Zweimaliges Waschen in MABT (Maleinsäurepuffer mit Tween 20) für 30 Minuten bei Raumtemperatur. MABT ist sanfter als PBS und eignet sich besser für den Nukleinsäurenachweis.

Zur Herstellung des 5x MABT-Stammes

• 58 g Maleinsäure
• 43,5 g NaCl
• 55 g Tween-20
• 900 mL Wasser

Den pH-Wert durch Zugabe von Tris-Base auf 7,5 bringen. Es werden etwa 100 g benötigt. Das Endvolumen auf 1 l bringen.

12) Trockne die Objektträger.
13) In eine befeuchtete Kammer überführen und 200 µL Blocking-Puffer auf jeden Schnitt geben (MABT + 2% BSA, Milch oder Serum). 1-2 Stunden bei Raumtemperatur blockieren.
14) Den Blockierungspuffer abtropfen lassen. Geben Sie den Anti-Label-Antikörper in der erforderlichen Verdünnung in den Blocking-Puffer. Die empfohlene Konzentration/Verdünnung ist dem Datenblatt des Antikörpers zu entnehmen. 1-2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
15) Objektträger 5×10 min mit MABT bei Raumtemperatur waschen.
16) Objektträger 2×10 min bei Raumtemperatur mit Vorfärbepuffer (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) waschen.
17) Für den Fluoreszenznachweis fahren Sie mit Schritt 18 fort. Für andere Formen des Nachweises die Objektträger wieder in die Befeuchtungskammer stellen und die Anweisungen des Herstellers zur Farbentwicklung befolgen.

18) Spülen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser.
19) Die Objektträger 30 Minuten lang an der Luft trocknen. In 100%igem Ethanol waschen und gründlich an der Luft trocknen.
20) Mit DePeX-Einbettungslösung einbetten.