Enterokokken

2.4.3.2 Hydrolytische Aktivitäten von Enterokokken

Enterokokken produzieren bekanntlich drei Arten von Enzymen, die zu ihrer opportunistischen Pathogenität beitragen: Hyaluronidase, Gelatinase und Serinprotease . Die Hyaluronidase, die durch das chromosomale hyl-Gen kodiert wird, baut den Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix der Wirtszellen, die Hyaluronsäure, ab und erleichtert so die Invasion in das Gewebe und die Verbreitung von Toxinen.

Gelatinase, die durch das chromosomale gelE-Gen kodiert wird, ist eine Zinkmetalloprotease, die auf Gelatine, aber auch auf Kollagen, Kasein, Hämoglobin, β-Insulin und andere biologisch aktive Peptide wirkt. Dieses Enzym trägt auch zum Prozess der Biofilmbildung bei, der die Besiedlung von Gewebe und die Persistenz an Infektionsstellen erleichtern kann. Die Serinprotease, die von dem Gen sprE kodiert wird, das stromaufwärts von gelE liegt und mit diesem kotranskribiert wird, ist ebenfalls an der Pathogenese beteiligt, indem sie Wirtsgewebe abbaut.

Enterokokken tragen aufgrund ihrer proteolytischen und lipolytischen Aktivitäten und ihrer Fähigkeit, flüchtige oder langkettige Fettsäuren, Diacetyl, Acetoin und andere flüchtige Verbindungen zu produzieren, zur Entwicklung von Käsearomen während der Reifung bei. Demnach ist E. faecium an der Entwicklung von Geschmack, Aroma, Farbe und Textur beteiligt. Es trägt daher zum allgemeinen sensorischen Profil bestimmter Käsesorten bei. Diese Eigenschaften machen es auch zu einer bevorzugten Flora für andere fermentierte Produkte wie Gemüse oder Fleisch.

Während die proteolytischen Aktivitäten von Milchsäurebakterien in der Literatur über fermentierte Produkte gut beschrieben sind, sind die von Enterokokken weniger bekannt. Sie sind in Milchprodukten eher gering, mit Ausnahme einiger Stämme von E. faecalis . Innerhalb dieser Gattung hängt das Ausmaß der proteolytischen Aktivität von der Spezies und dem Stamm innerhalb derselben Spezies ab. Die am besten beschriebenen Proteasen sind in der Lage, Kasein, aber auch β-Lactoglobulin und α-Lactalbumin zu hydrolysieren. Viele Studien zeigen, dass Käse, der aus mit E. faecalis beimpfter Milch hergestellt wird, höhere proteolytische Aktivitäten aufweist als Käse, der ohne diese Enzyme hergestellt wird. Arbeiten über das Wachstum von 24 Stämmen von E. faecium und 60 Stämmen von E. faecalis in Magermilch bei 37°C zeigen, dass die proteolytischen Aktivitäten von E. faecalis viel höher sind als die von E. faecium. Diese Ergebnisse werden bestätigt durch und durch in Milchprodukten und durch auf Enterokokken, die aus pasteurisiertem flüssigem Vollei isoliert wurden und für deren Verderb verantwortlich sind.

Der anschließende Abbau von Aminosäuren wird als ein wichtiger Einfluss auf die Entwicklung des Aromas von Käse angesehen. Proteolytische Aktivitäten können auch für die Bildung von biogenen Aminen durch Enterokokken aus den von ihnen (oder anderen Bakterientypen) freigesetzten Aminosäuren verantwortlich sein. Abbildung 2.6 zeigt die verschiedenen biogenen Amine, die in verdorbenen Lebensmitteln gebildet werden können.

Abbildung 2.6. Bildung von biogenen Aminen in Lebensmittelmatrices als Reaktion auf mikrobiologische Stoffwechselaktivitäten. Die grauen Pfeile stellen die Decarboxylierungsreaktionen dar, die direkt zur Bildung von biogenen Aminen führen, die gestrichelten Linien zeigen die biogenen Amine an, die über Stoffwechselwege gebildet werden, die sich von den einstufigen Decarboxylierungsreaktionen unterscheiden.

(Abbildung entnommen aus , angepasst nach )

Histamin, Tyramin, Phenylethylamin und Kadaverin werden durch eine einstufige Decarboxylierungsreaktion aus ihren jeweiligen Vorläufern Histidin, Tyrosin, Phenylalanin und Lysin hergestellt. Die Herstellung dieser biogenen Amine und ihre anschließende Ausscheidung erfordern (1) aktive Transportsysteme für die Vorläuferaminosäuren, (2) Decarboxylierungen und (3) Aminausscheidungssysteme, die aus diesen Decarboxylierungen resultieren. Am Transport ist im Allgemeinen ein Protein beteiligt, das die Vorläuferaminosäure mit dem aus der Decarboxylierung resultierenden Amin austauscht. In der Zelle angekommen, wird die Aminosäure in Gegenwart von Pyridoxalphosphat einer Decarboxylierung unterzogen, die von einer spezifischen Decarboxylase (Carboxy-Lyasen EC 4.1.1.1.) katalysiert wird. Die am meisten untersuchten Decarboxylasen sind die Histidin-Decarboxylase (HDC), die Tyrosin-Decarboxylase (TDC) und die Lysin-Decarboxylase (LDC), die jeweils von den Genen hdcA, tdcA und cadA kodiert werden. Sie sind später in Operons mit anderen Genen organisiert, die an anderen Phasen des Produktionsprozesses biogener Amine beteiligt sind, wie z. B. dem Transport und der Reifung. Die Spezifität dieser Decarboxylasen ist seit langem umstritten, und es ist inzwischen gut belegt, dass eine Decarboxylase mehrere Substrate decarboxylieren kann. So kann Enterococcus TDC beispielsweise Phenylalanin und Tyrosin decarboxylieren, um Phenylethylamin bzw. Tyramin zu bilden. Putrescin, Agmatin, Spermidin und Spermin werden durch verschiedene Wege synthetisiert, die durch Gruppen von Genen katalysiert werden, die für die Spezies oder den Stamm spezifisch sein können, da sie möglicherweise durch horizontalen Transfer erworben werden.

Enterokokken sind in der Lage, Decarboxylase-Aktivitäten zu verursachen, die für die Produktion biogener Amine in fermentierten Lebensmitteln verantwortlich sind. Ihnen werden sogar die stärksten Tyrosin- und Phenylalanin-Decarboxylase-Aktivitäten in der bakteriellen Welt zugeschrieben. Milchsäurebakterien in der endogenen Flora von fermentiertem Fleisch, wie z. B. Wurstwaren, gelten als die wichtigsten Tyraminproduzenten. Käse und einige Fleischprodukte können geeignete Substrate für die Produktion von 2-Phenylethylamin, Tyramin, Histidin oder anderen Aminen sein. Diese Stämme beherbergen daher Gene oder Operons, die für Decarboxylasen oder andere Enzyme kodieren, die an der Synthese von biogenen Aminen oder deren Abbau beteiligt sind. Bei Meeresfrüchten wird die Synthese von biogenen Aminen nicht den Enterokokken zugeschrieben. Während hitzeresistente Bakterien wie Enterokokken, die hauptsächlich an der Produktion biogener Amine in Milcherzeugnissen beteiligt sind, durch die Pasteurisierung nur teilweise abgetötet werden, wird durch die Hitzebehandlung der Gehalt an biogenen Aminen verringert. Dieses Phänomen kann auf die Verringerung der Kontamination des Lebensmittels und/oder auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass ein wesentlicher Decarboxylierungs-Cofaktor durch die Pasteurisierung denaturiert wurde.

Obwohl Milchsäurebakterien gegenüber Lipiden nicht sehr aktiv sind, ist bekannt, dass sie an der Aromatisierung von Käse beteiligt sind, entweder durch die Umwandlung kurzkettiger Fettsäuren in Ketone oder methylierte Lactone oder durch die Bildung von Aldehyden, die aus der Oxidation ungesättigter Fettsäuren resultieren und für die Entwicklung ranziger Gerüche und Geschmäcker verantwortlich sind, entweder durch die Solvatisierung der aromatischen Verbindungen, die aus Lipiden, aber auch aus Proteinen und Laktose entstehen. Nach , und haben Enterokokken eine Esterase-Aktivität, die oft stärker ist als die anderer Milchsäurebakterien. Unter den Enterokokken sind diese Aktivitäten ebenfalls variabel, und Untersuchungen von zeigen, dass sie bei E. faecalis stärker sind als bei E. faecium. Andere Studien zeigen, dass die lipolytische Aktivität von Enterokokken nicht von der Spezies abhängt, sondern von der Art des Käses, aus dem der Stamm stammt.

Bereits 1965 wurde gezeigt, dass Esterase-Aktivitäten von E. faecalis- und E. faecium-Stämmen ausgedrückt werden. Sie zeigen, dass Enterokokken aktiver auf Triglyceride reagierten als Streptococcus-Stämme und dass die Hydrolyseraten mit zunehmender Kohlenstoffkettenlänge der freigesetzten Fettsäuren (Tripropionin > Tributyrin > Tricaprin > Tricaprylin) abnahmen. Sie weisen auf die fehlende Aktivität bei Triolein hin. zeigen, dass Enterokokken eine geringe lipolytische Aktivität aufweisen, wenn sie in ein Wachstumsmedium mit Vollmilch gegeben werden. Die Arbeiten von zeigen, dass E. faecium und E. faecal, die aus Käse isoliert wurden, Tributyrin hydrolysieren, aber nicht aktiv auf Milchlipide reagieren. zeigen, dass eine Lipase von E. faecal auch aktiver auf Tributyrin als auf Tricaproin, Tricaprylin und Triolein wirkt. Die Fähigkeit der Enterokokken, Milchlipide zu hydrolysieren, ist jedoch von Stamm zu Stamm sehr unterschiedlich. Einige Stämme zeigen keine lipolytische Aktivität, während andere eine hohe Aktivität für ein breites Spektrum an Fettsäuren aufweisen. Arbeiten von , die mit synthetischen Substraten (4-Nitrophenyl-Acyle) durchgeführt wurden, zeigen eine Aktivität von E. faecium für Fettsäuren mit einer Kettenlänge zwischen 2 und 18 Kohlenstoffen. In späteren Studien zeigen dieselben Autoren, dass eine intrazelluläre Esterase von E. faecium in vitro eine Aktivität für 4-Nitrophenyl-Acyle mit einer Kettenlänge zwischen 2 und 12 Kohlenstoffatomen entwickelt, mit einem Optimum in Gegenwart von 4-Nitrophenyl-Butyrat (C2). Die Arbeiten von zeigen, dass die Mehrheit der getesteten Enterokokkenstämme (90 %, N = 129) in der Lage ist, homogene Triglyceride zu hydrolysieren, die Fettsäuren mit einer Kettenlänge zwischen 4 und 18 Kohlenstoffen enthalten, wobei die Aktivität mit zunehmender Kohlenstoffkettenlänge abnimmt. Alle in dieser Studie getesteten Stämme (100 %) zeigen eine Aktivität für die synthetischen Substrate, von 4-Nitrophenylacetat (C2) bis 4-Nitrophenylstearat (C18), wobei die Aktivität ebenfalls mit zunehmender Länge der Fettsäure-Kohlenstoffkette abnimmt.

Zu den wenigen veröffentlichten Studien über hydrolytische Aktivitäten, die am Verderb von Eiprodukten beteiligt sein könnten, gehören solche, die lipolytische Aktivitäten zeigen, die von den Stämmen E. faecium und insbesondere E. faecalis, die aus verdorbenen pasteurisierten flüssigen Volleiprodukten isoliert wurden, exprimiert werden. Arbeiten von zeigen, dass Lipase-Aktivitäten auch bei der Hälfte der Enterococcus-Stämme nachgewiesen werden, die aus industriellem Eiweiß gewonnen und auf ihre Fähigkeit getestet wurden, einen der Hauptbestandteile der schwimmenden Inseldesserts, die Puddingcreme, zu verderben.