Emerging Applications of Bacterial Spores in Nanobiotechnology

Sporenhüllen bestehen aus Proteinen, haben geordnete Anordnungen protomerer Untereinheiten, weisen eine Selbstorganisation auf und haben schützende Eigenschaften. Als ruhende, stoffwechselinaktive Lebensformen können Sporen unbegrenzt in einem ausgetrockneten Zustand überleben, und es ist sogar dokumentiert, dass sie Millionen von Jahren intakt überleben. Sporen können Temperaturen von bis zu 90 °C widerstehen und auch schädlichen Chemikalien ausgesetzt werden. Die meisten (aber nicht alle) sporenbildenden Bakterien gehören zu zwei Hauptgattungen: Bacillus und Clostridium. Clostridien, die Sporen bilden, differenzieren sich im Gegensatz zu Bacillus nur unter anaeroben Bedingungen, was Bacillus zur am besten geeigneten Gattung für Studien macht.

Bacillus-Arten produzieren eine einzelne Spore oder Endospore (im Gegensatz zu Pilzexosporen) innerhalb der Bakterienzelle durch einen Differenzierungsprozess, der die koordinierte Wirkung von Hunderten von Entwicklungsgenen erfordert. Typischerweise sind reife Sporen 0,8-1,2 μm lang und haben entweder eine kugelige oder ellipsoide Form (siehe Abbildung 1A). Das einzelne bakterielle Chromosom ist in der Mitte der Spore, dem sogenannten Kern, kondensiert. Schichten von Lipidmembranen und modifiziertem Peptidoglykan umgeben den Sporenkern, aber die wichtigste Struktur ist die Sporenhülle. Diese laminierte Proteinhülle macht die Spore resistent gegen organische Lösungsmittel und Lysozym. Bei Bacillus subtilis sind bis zu 25 verschiedene Hüllproteine in zwei verschiedenen Hüllschichten vorhanden (Abbildung 1B), der inneren und der äußeren Hülle, aber bei anderen Arten gibt es Hinweise darauf, dass die Hülle weniger komplex ist und in einigen Fällen nur aus wenigen Proteintypen besteht. Die Struktur und der Aufbau des Sporenmantels entwickeln sich nun zu einem Modellsystem für das Verständnis komplexer morphogenetischer Aufbauprozesse, ähnlich wie bei klassischen Studien zum Aufbau von Phagen T4. Die äußere, elektronendichte Schicht der B. subtilis-Hülle besteht aus fünf Hauptpolypeptiden: CotA (65 kDa), CotB (59 kDa), CotG (24 kDa), CotC (11 kDa) und CotF (8 kDa). CotA ist eine Multi-Kupfer-Oxidase und kann sich in multimeren Formen (mikroskopisch zu beobachten) innerhalb der Sporen bildenden Zellen in einigen Mutanten mit Manteldefekt anreichern. Vermutlich geht die Oligomerisierung und Selbstorganisation von CotA der Ablagerung auf der Oberfläche der Sporenhülle voraus. Die CotG- und CotB-Proteine interagieren nachweislich kovalent, und darüber hinaus haben CotG und auch CotC äußerst ungewöhnliche Aminosäuresequenzen mit mehrfachen Wiederholungen (>13) von 12-13 Aminosäuren, die reich an Lysin und Tyrosin sind. Darüber hinaus weisen viele der Sporenhüllenproteine bei der SDS-PAGE-Untersuchung ungewöhnliche Profile auf, d. h. multimere Formen und abweichende Molekularmassen. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Sporenhülle tatsächlich flexibel ist und sich ausdehnen und zusammenziehen kann. Diese Eigenschaft ist entscheidend für die Sporenbildung, wenn die Spore dehydriert, und in ähnlicher Weise für die Keimung, wenn die Spore rehydriert. Dieser Aspekt einer selbstorganisierten Struktur ist besonders interessant und könnte in Zukunft eine Reihe von Anwendungen bei der Verabreichung von Medikamenten, der Nanofabrikation und der Oberflächenbeschichtung bieten.

Bakterielle Endosporen. Tafel A zeigt Endosporen von B. subtilis, von denen eine noch in der stäbchenförmigen „Mutterzelle“ enthalten ist. Bei B. subtilis sind die Sporen etwa 1,2 μm lang und ellipsoidisch. Freigesetzte Sporen haben eine durchsichtige Schutzhülle, die als Sporenmantel bezeichnet wird und aus bis zu 25 verschiedenen protomeren Komponenten besteht, die in diskreten Schichten angeordnet sind. Tafel B zeigt eine typische SDS-PAGE (12,5 %) Fraktionierung von gelösten Sporenmantelproteinen, die die vorherrschenden Spezies erkennen lässt.

Engineering des bakteriellen Sporenmantels

Eine Strategie zur Entwicklung von Bacillus subtilis-Sporen, um heterologe Antigene auf der Sporenoberfläche darzustellen, wurde kürzlich berichtet und ist in Abbildung 2 dargestellt. Ein auf Sporen basierendes Display-System bietet mehrere Vorteile gegenüber Systemen, die auf der Verwendung von Bakterienzellen beruhen. Dazu gehören die Robustheit der bakteriellen Spore, die eine Lagerung in getrockneter Form ermöglicht, die einfache Produktion, die Sicherheit und eine technologische Plattform, die durch umfangreiche Werkzeuge für die genetische Manipulation unterstützt wird.

Sporenoberflächen-Display unter Verwendung von Sporenmantelproteinen. Die B. subtilis-Spore besteht aus einem inneren Kern (gelb), der von einem peptidoglykanartigen Kortex (rot) umgeben ist, und einer proteinhaltigen Hülle, die in einen inneren (grün) und einen äußeren (schwarz) Teil unterteilt ist. Das Fusionsprotein, das aus einem Träger- (blau) und einem Passagierteil (violett) besteht, ist auf der Sporenoberfläche exponiert.

Im Gegensatz zu der Fülle von Informationen darüber, wie die Genexpression die Differenzierung einer wachsenden Zelle in eine ruhende Spore steuert, ist nur wenig über die Mechanismen des Proteineinbaus in die Hülle, die Art der strukturellen Komponenten, die den äußersten Teil der Hülle bilden, und darüber, ob es Verankerungsmotive gibt, bekannt. Die ersten Versuche, heterologe Proteine auf der Sporenoberfläche freizulegen, konzentrierten sich auf zwei Hüllkomponenten, CotB und CotC. Im Falle von CotB ist bekannt, dass dieses Sporenhüllprotein an der Oberfläche lokalisiert ist, während CotC im Vergleich zu anderen Hüllproteinen eine hohe relative Abundanz aufweist. Die Beobachtung, dass beide Hüllkomponenten sowohl für die Bildung einer scheinbar normalen Spore als auch für ihre Keimung entbehrlich waren, war ein zusätzliches positives Merkmal für die Wahl von CotB und CotC als potenzielle Trägerproteine.

Zwei Antigene wurden zunächst als Modellproteine für die Sporenoberfläche ausgewählt: i) das nicht-toxische 459 Aminosäuren umfassende C-terminale Fragment des Tetanustoxins (TTFC), ein gut charakterisiertes und hoch immunogenes 51.8 kDa-Peptid, kodiert durch das tetC-Gen von Clostridium tetani; und ii) die 103 Aminosäuren umfassende B-Untereinheit des hitzelabilen Toxins von enterotoxigenen Stämmen von Escherichia coli (LTB), ein 12 kDa-Peptid, kodiert durch das eltB-Gen.

CotB als Trägerprotein

Wie andere Hüllkomponenten wurde CotB aufgrund genetischer Hinweise mit der äußeren Hüllschicht in Verbindung gebracht, und erst kürzlich hat eine an intakten Sporen durchgeführte immunzytofluorimetrische Analyse gezeigt, dass CotB für CotB-spezifische Antikörper zugänglich ist und daher höchstwahrscheinlich auf der Sporenoberfläche exponiert ist .

Das CotB-Strukturgen, cotB, steht unter der dualen Transkriptionskontrolle von σK und dem DNA-bindenden Protein GerE. Infolgedessen wird cotB nur im Mutterzellkompartiment der Sporen bildenden Zelle transkribiert. Nach der Synthese im Zytoplasma der Mutterzelle wird CotB in einer Weise um die sich bildende Spore herum aufgebaut, die von CotE, CotG und CotH abhängt. Daher durchlaufen CotB und das heterologe Protein, das schließlich mit ihm fusioniert wird, keinen Zellwand-Translokationsschritt, wie er für Display-Systeme in anderen Bakterien typisch ist.

CotB hat eine stark hydrophile C-terminale Hälfte, die aus drei 27 Aminosäure-Wiederholungen besteht, die reich an Serin-, Lysin- und Glutamin-Resten sind. Die Serinreste machen mehr als 50 % der CotB-C-terminalen Hälfte aus. Es wird vermutet, dass die Lysinreste in den CotB-Wiederholungen in Analogie zu den Bindegewebsproteinen Kollagen und Elastin für intra- oder intermolekulare Vernetzungen stehen. Das CotB-Protein hat eine abgeleitete Molekülmasse von 46 kDa, migriert aber auf SDS-PAGE als 59 kDa Polypeptid. Kürzlich wurde die Diskrepanz zwischen gemessenem und abgeleitetem Molekulargewicht dadurch erklärt, dass gezeigt wurde, dass CotB zunächst als 46 kDa-Spezies synthetisiert und dann in ein 59 kDa-Homodimer umgewandelt wird, das sowohl die N- als auch die C-terminalen Enden beibehält, die aus der CotB-Nukleotidsequenz vorhergesagt wurden.

Die Strategie zur Gewinnung rekombinanter B. subtilis-Sporen zu erhalten, die CotB-TTFC oder CotB-LTB auf ihrer Oberfläche exprimieren, basierte auf (i) der Verwendung des cotB-Gens und seines Promotors für die Konstruktion von Translationsfusionen und (ii) der chromosomalen Integration der cotB-tetC- und cotB-eltB-Genfusionen in die kodierende Sequenz des nicht-essentiellen Gens amyE (Abbildung 3A) . Die Platzierung der Fusionsproteine unter den Transkriptions- und Translationssignalen von cotB gewährleistete den richtigen Zeitpunkt der Expression während der Sporulation, während die chromosomale Integration die genetische Stabilität des Konstrukts garantierte. Aufgrund des Mangels an Informationen über den Aufbau der CotB-Hülle und über die Anforderungen an die Verankerungsmotive wurden erste Versuche unternommen, indem das Passagierprotein am C-Terminus, am N-Terminus oder in der Mitte von CotB positioniert wurde (Abb. 3B).

Sporen-Oberflächen-Display-System in B. subtilis . (A) Schematische Darstellung der Integration von Genfusionen auf dem Chromosom. Die roten Balken stellen die Genfusion dar, die grauen und grünen Balken das nicht-essentielle amyE-Gen von B. subtilis, das als Integrationsstelle verwendet wird, bzw. das Chloramphenicol-Acetyltransferase (cat)-Gen, das als selektierbarer Marker dient. (B) Schematische Darstellung von Fusionsproteinen, bei denen entweder CotB in voller Länge (380 Aminosäuren) oder CotBΔ105 (275 Aminosäuren) oder CotC (66 Aminosäuren) als Trägerproteine verwendet werden (alle in blau). Die drei 27-Aminosäuren-Wiederholungen von CotB in voller Länge und der in CotBΔ105 verbleibende Teil davon sind schwarz dargestellt. Violette Balken stellen den heterologen Teil der Fusionen (TTFC oder LTB) dar.

Als TTFC und LTB an das C-terminale Ende von CotB fusioniert wurden, konnten sich die chimären Proteine nicht korrekt auf der Sporenoberfläche zusammensetzen (Isticato und Ricca, unveröffentlicht). Solche anfänglichen Misserfolge wurden auf eine mögliche Instabilität der Konstrukte zurückgeführt, entweder auf der DNA-Ebene (sich wiederholende DNA-Sequenzen) oder auf der Proteinebene. Um solche Probleme zu umgehen, wurden TTFC und LTB an das C-terminale Ende einer CotB-Form fusioniert, bei der die drei 27-Aminosäure-Wiederholungen entfernt wurden, CotBΔ105-TTFC (Abb. 3A). Im Gegensatz zur Version in voller Länge wurde das chimäre CotBΔ105-TTFC-Protein korrekt zusammengesetzt und auf der Sporenoberfläche exponiert. Ein quantitativer Dot-Blot zeigte, dass jede rekombinante Spore eine Menge an CotBΔ105-TTFC-Fusionsprotein freilegte, die 0,00022 pg entsprach, was den Schluss zulässt, dass 1,5 × 103 chimäre Moleküle auf der Oberfläche jeder rekombinanten Spore vorhanden sind.

Im Gegensatz zu CotBΔ105-TTFC wurde CotBΔ105-LTB nicht richtig zusammengesetzt. Der Stamm, der diese Chimäre exprimiert, zeigte eine verringerte Sporulations- und Keimungseffizienz und seine Sporen waren nicht resistent gegen Lysozym. Diese Beobachtungen und die SDS-PAGE-Analyse der freigesetzten Hüllproteine deuten darauf hin, dass die Anwesenheit von CotBΔ105-LTB die Sporenhülle stark verändert. Eine In-silico-Analyse zeigte eine gewisse Homologie zwischen dem chimären Produkt (in der Fusionsregion) und LytF, einer zellwandassoziierten Endopeptidase, die von B. subtilis während des vegetativen Wachstums produziert wird, was die Möglichkeit aufkommen lässt, dass das chimäre Produkt die ordnungsgemäße Hüllenbildung beeinträchtigen könnte, indem es einige Hüllenkomponenten abbaut (Mauriello und Ricca, Daten nicht gezeigt).

Zusätzlich zu der oben beschriebenen C-terminalen Endfusion wurde das Modell-Passagierprotein TTFC auch am N-Terminus und in der Mitte von CotB fusioniert (Abb. 3B). In beiden Fällen wurde die CotBΔ105-Form von CotB verwendet, um die Probleme mit der C-terminalen Fusion zu vermeiden (siehe oben). Sowohl die N-terminalen als auch die Sandwich-Fusionen führten zu chimären Produkten, die sowohl in qualitativer als auch in quantitativer Hinsicht korrekt in die Hüllstruktur eingebaut wurden. Zumindest im Fall von CotB konnte man daraus schließen, dass das Passagierprotein dort, wo es exponiert ist, die Darstellung auf der Sporenoberfläche nicht beeinträchtigt.

CotC als Trägerprotein

CotC ist eine 12 kDa große, alkalilösliche Komponente der Sporenhülle von B. subtilis, die zuvor durch reverse Genetik identifiziert und dann aufgrund genetischer Nachweise mit der äußeren Hüllschicht in Verbindung gebracht wurde. CotC wurde zunächst aufgrund seiner relativen Häufigkeit in der Hülle als Trägerkandidat betrachtet (Abbildung 1B). Zusammen mit CotG und CotD macht CotC etwa 50 % der gesamten aufgelösten Hüllproteine aus. Diese relativ hohen Mengen könnten den Aufbau einer beträchtlichen Anzahl von CotC-basierten Chimären auf der Hülle ermöglichen und somit ein effizientes heterologes Display gewährleisten. Die Expression des cotC-Gens steht unter der Kontrolle des mutterzellspezifischen σ-Faktors σK und der Transkriptionsregulatoren GerE und SpoIIID. Wie CotB wird auch CotC in der Mutterzelle transkribiert, und sein Zusammenbau auf der Hülle erfordert keine Membrantranslokation. Das Primärprodukt des cotC-Gens ist ein Polypeptid mit 66 Aminosäuren, das extrem reich an Tyrosin- (30,3%) und Lysinresten (28,8%) ist. Kürzlich wurde jedoch gezeigt, dass CotC zu mindestens vier verschiedenen Proteinformen mit einer Größe zwischen 12 und 30 kDa zusammengesetzt wird. Zwei dieser Formen mit Molekularmassen von 12 und 21 kDa, die höchstwahrscheinlich einer monomeren bzw. homodimeren Form von CotC entsprechen, werden unmittelbar nach ihrer Synthese acht Stunden nach Beginn der Sporulation in die sich bildende Spore eingebaut. Die beiden anderen Formen, 12,5 und 30 kDa, sind wahrscheinlich die Produkte posttranslationaler Modifikationen der beiden anderen Formen, die während der Sporenreifung direkt auf der Manteloberfläche auftreten.

Im Fall von CotC wurden bisher nur C-terminale Fusionen konstruiert (Abbildung 3B). Sowohl CotC-TTFC- als auch CotC-LTB-Genfusionen wurden durch Klonierung von tetC oder eltB im Rahmen des letzten CotC-Codons unter der Transkriptions- und Translationskontrolle der CotC-Promotorregion erhalten. Die Genfusion wurde dann durch doppelte Cross-over-Rekombination in das B. subtilis-Chromosom am amyE-Locus integriert (Abbildung 3A). Diese beiden chimären Proteine wurden auf dem Mantel der rekombinanten Sporen ohne größere Auswirkungen auf die Sporenstruktur und/oder -funktion eingebaut, da sie in Bezug auf die Effizienz der Sporulation und Keimung sowie die Resistenzeigenschaften identisch mit den Wildtypsporen waren. Western Blot, zytofluorimetrische Analysen und, für CotC-TTFC, Immunfluoreszenzmikroskopie (Abbildung 4) zeigten, dass beide CotC-basierten Chimären auf der Oberfläche der rekombinanten Sporen vorhanden waren. Eine quantitative Bestimmung der rekombinanten Proteine auf den B. subtilis-Sporen ergab, dass ca. 9,7 × 102 und 2,7 × 103 Moleküle von CotC-TTFC bzw. CotC-LTB aus jeder Spore extrahiert wurden.

Nachweis des Vorhandenseins von CotC-LTB und CotC-TTFC durch Immunfluoreszenzmikroskopie. Die Sporulation von B. subtilis-Stämmen wurde durch die Resuspensionsmethode ausgelöst, und die Proben wurden 6 Stunden nach Beginn der Sporulation entnommen und durch Immunfluoreszenzmikroskopie wie zuvor beschrieben analysiert. Die Proben wurden mit einem Maus-Anti-LTB-Antikörper, gefolgt von einem Anti-Maus-IgG-TRITC-Konjugat (rotes Fluorescein, Felder A & B), oder einem Kaninchen-Anti-TTFC-Antikörper, gefolgt von einem Anti-Kaninchen-IgG-FITC-Konjugat (grünes Fluorescein, Felder C & D) markiert. Felder A & C, Wildtypsporen; Feld B, isogene Sporen, die CotC-LTB exprimieren; Feld D, isogene Sporen, die CotC-TTFC exprimieren.

Obwohl CotC in der Hülle häufiger vorkommt als CotB, werden durch die CotC- und CotBΔ105-basierten Systeme vergleichbare Mengen heterologer Proteine freigelegt. Dieses Ergebnis war etwas unerwartet, da CotC in der Hülle offenbar viel häufiger vorkommt als CotB. Eine mögliche Erklärung ergibt sich aus der jüngsten Erkenntnis, dass das C-terminale Ende von CotC nicht nur für die Interaktion mit anderen CotC-Molekülen, sondern auch mit anderen Hüllenkomponenten essentiell ist (Isticato und Ricca, Manuskript in Vorbereitung), und zeigt daher, dass die Verwendung von CotC als Träger noch optimiert werden muss.

Stabilität von in Sporen dargestellten Proteinen

Einer der Hauptgründe, die für die Verwendung der bakteriellen Spore als günstiges Displaysystem sprechen, ist ihre gut dokumentierte Stabilität. Sporen können einfach bei Raumtemperatur für eine lange Zeit gelagert werden, ohne dass ihre Resistenz- und Stabilitätseigenschaften abnehmen. Dies ist eine äußerst nützliche Eigenschaft für eine Vielzahl von biotechnologischen Anwendungen. Handelt es sich bei dem Passagierprotein beispielsweise um ein Antigen, so könnte die rekombinante Spore zu einem idealen hitzestabilen oralen Impfstoff für den Einsatz in Entwicklungsländern werden, wo die Hitzestabilität aufgrund der schlechten Verteilung und Lagerung besonders problematisch ist.

Die Stabilität von Sporen ist zwar gut dokumentiert, die Stabilität heterologer Proteine, die auf der Sporenoberfläche exponiert sind, wurde jedoch erst kürzlich untersucht. Sporen, die CotBΔ105-TTFC (siehe oben) exprimieren, und Elternsporen wurden bei -80°C, -20°C, +4°C und bei Raumtemperatur gelagert und nach verschiedenen Lagerungszeiten bis zu 12 Wochen untersucht. In allen Fällen war die Menge des auf der Oberfläche der rekombinanten Sporen vorhandenen heterologen Proteins zwischen frisch hergestellten Sporen und solchen, die bis zu 12 Wochen gelagert wurden, identisch (Abb. 5). Diese Ergebnisse, die zeigen, dass heterologe Proteine stabil auf der Oberfläche rekombinanter Sporen exponiert werden können, bestätigen das auf Sporen basierende System als einen sehr vielversprechenden Display-Ansatz, der einige Nachteile anderer Systeme überwinden könnte und der in einer Vielzahl verschiedener biotechnologischer Bereiche Anwendung finden könnte.

Dot-Blot-Analyse von Proteinen aus Wildtyp-Sporen und aus Sporen, die die CotBΔ 105 -TTFC-Chimäre exprimieren. Frisch gereinigte Sporen, die die CotBΔ105-TTFC-Chimäre exprimieren (t0) oder nach 4, 8 oder 12 Wochen (t4, t8 und t12) Lagerung bei Raumtemperatur wurden mittels Dot-Blotting von extrahierten Sporenmantelproteinen untersucht. Die Konzentrationen der gereinigten TTFC (in Nanogramm) und der Hüllproteine (in Mikrogramm) sind angegeben. Die Proteine wurden geladen und mit monoklonalen Anti-TTFC-Antikörpern (Boeringher) und anschließend mit Phosphatase-konjugierten Sekundärantikörpern zur Reaktion gebracht. Signale ähnlicher Intensität wurden mit frisch gereinigten Sporen und mit Sporen, die bis zu 12 Wochen bei Raumtemperatur gelagert wurden, erhalten.

Proof of Principle for Oral Vaccination Using Tetanus as a Model Disease

Sporen, die CotBΔ105-TTFC exprimieren, wurden zur Immunisierung von Mäusen auf oralem Weg verwendet. Serum-IgG und fäkales sIgA zeigten eine deutliche Serokonversion gegen TTFC. Das Verabreichungsschema umfasste drei Sätze von drei Dosen (1,67 × 1010) über 5 Wochen und basierte auf für orale Immunisierungen optimierten Schemata. Die Titer der TTFC-spezifischen IgG nach 33 Tagen (>103) deuteten darauf hin, dass diese auf einem schützenden Niveau lagen, und Mäuse, die mit Tetanustoxin mit einer LD50 von 10 herausgefordert wurden, waren vollständig geschützt. Von acht Mäusen, denen eine Dosis von 20 LD50 verabreicht wurde, überlebten sieben, was darauf schließen lässt, dass dies der Schwellenwert für den Schutz ist. Eine ähnliche Studie wurde mit einer nasalen Immunisierung mit CotB-TTFC-Sporen durchgeführt, allerdings mit einer niedrigeren Dosis und drei Immunisierungen. Hier waren die TTFC-spezifischen IgG-Antworten geringer, zeigten aber immer noch eine Serokonversion. Diese Studien zeigen, dass manipulierte Sporen, die ein heterologes Antigen exprimieren, für eine schützende Immunisierung verwendet werden können. Darüber hinaus sind Schleimhautreaktionen zwar nicht wichtig für den Schutz vor Clostridium tetani (einem systemischen Erreger), aber offensichtlich wichtig für mukosale Erreger. Weitere Studien werden erforderlich sein, um die Dosierungsschemata zu optimieren (geringere Dosen und weniger Sporen), aber diese bahnbrechenden Studien haben den Weg für die Entwicklung von Impfstoffen gegen spezifische Schleimhauterreger geebnet. Obwohl diese Studien ermutigend sind und humorale Reaktionen zeigen, gibt es noch keine eindeutigen Hinweise auf zelluläre Reaktionen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass sich die Sporen in den GALT ausbreiten und in den Peyer’schen Flecken (PP) und den mesenterialen Lymphknoten gefunden werden. Die geringe Größe der Sporen (1 μm) würde es ihnen ermöglichen, von M-Zellen aufgenommen und in die PP transportiert zu werden, wo sie mit antigenpräsentierenden Zellen interagieren könnten. Erste Studien haben gezeigt, dass die Sporen keimen und für kurze Zeit in Darmmakrophagen persistieren können und in vivo Th 1-Zytokine wie IFN-γ auslösen

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