Der Ubiquitin-Proteasom-Weg: Die Komplexität und die unzähligen Funktionen des Proteintods

Unser Verständnis des intrazellulären Proteinabbaus hat sich in den letzten zehn Jahren dramatisch verändert. Von einem unregulierten und unspezifischen „Endpunkt“-Prozess ist es klar geworden, dass die Proteolyse zellulärer Proteine ein hochkomplexer, zeitlich gesteuerter und streng regulierter Prozess ist, der bei einer Vielzahl grundlegender Vorgänge während des Zelllebens und -todes eine wichtige Rolle spielt. Zwei wichtige proteolytische Kaskaden sind beschrieben worden. Caspasen sind am programmierten Zelltod (Apoptose) beteiligt, während der Abbau der meisten kurzlebigen regulatorischen zellulären Proteine durch den Ubiquitin-Proteasom-Weg vermittelt wird. Dazu gehören Regulatoren des Zellzyklus und der Zellteilung wie mitotische und G1-Cycline und Cyclin-abhängige Kinase-Inhibitoren, Wachstumsregulatoren wie c-Fos und c-Jun, Tumorsuppressoren wie p53, Oberflächenrezeptoren wie der Wachstumshormonrezeptor und Ionenkanäle, z. B. CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Das System ist auch an der selektiven Proteolyse abnormaler/mutierter Proteine und an der Verarbeitung von Antigenen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) der Klasse I beteiligt. Die Entdeckung, dass das System z. B. am Abbau von c-myc und an der zweistufigen proteolytischen Aktivierung von NF-κB beteiligt ist, signalisierte den „Eintritt“ des Ubiquitin-vermittelten Abbaus in den Bereich der Transkriptionsregulation. Über den Abbau von kurzlebigen und wichtigen regulatorischen Proteinen scheint das System eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl grundlegender zellulärer Prozesse zu spielen. Dazu gehören die Regulierung des Zellzyklus und der Zellteilung, die Beteiligung an der zellulären Reaktion auf Stress und auf extrazelluläre Modulatoren, die Morphogenese neuronaler Netzwerke, die Modulation von Zelloberflächenrezeptoren, Ionenkanälen und des sekretorischen Weges, die DNA-Reparatur, die Biogenese von Organellen und die Regulierung von Immun- und Entzündungsreaktionen. Jüngste Hinweise deuten darauf hin, dass das System auch an der Apoptose beteiligt ist. Bei einem so breiten Spektrum an Substraten und Prozessen ist es nicht verwunderlich, dass Fehlentwicklungen in diesem Prozess in jüngster Zeit in die Pathogenese verschiedener Krankheiten, sowohl vererbter als auch erworbener, einbezogen wurden. Dazu gehören die Muskeldegeneration nach Denervierung oder längerer Immobilisierung, bestimmte Formen der Alzheimer-Krankheit, männliche Sterilität und das Angelman-Syndrom (neuere Übersichten über das Ubiquitin-System finden sich in den Abschnitten 1-4).

Der Abbau eines Proteins über den Ubiquitin-Weg erfolgt in zwei diskreten und aufeinander folgenden Schritten: (i) kovalente Bindung mehrerer Ubiquitinmoleküle an das Proteinsubstrat und (ii) Abbau des Zielproteins durch den 26S-Proteasomkomplex unter Freisetzung von freiem und wiederverwendbarem Ubiquitin. Um eine effiziente und spezifische Beseitigung eines bestimmten Proteins zu einem bestimmten Zeitpunkt zu gewährleisten, müssen sowohl die Ubiquitin-Konjugation als auch der Abbau der markierten Substrate streng reguliert werden. In einer in dieser Ausgabe der Proceedings veröffentlichten Studie (5) berichten Zhang und Kollegen über die Identifizierung einer Aktivierungsregion in der α-Untereinheit des Proteasom-Aktivators PA28 (REG). Um diesen Befund in den entsprechenden biochemischen und physiologischen Kontext einzuordnen, wollen wir kurz auf unser derzeitiges Verständnis des Ubiquitin-Proteolyse-Wegs eingehen. Das System (siehe Abb. 1) besteht aus mehreren Komponenten, die zusammenwirken. Eine davon, Ubiquitin, ein evolutionär konserviertes Protein mit 76 Resten, wird an seinem C-terminalen Gly zu einem energiereichen Thiolester-Zwischenprodukt aktiviert, eine Reaktion, die vom Ubiquitin-aktivierenden Enzym E1 katalysiert wird. Nach der Aktivierung überträgt eines von mehreren E2-Enzymen (Ubiquitin-Trägerproteine oder Ubiquitin-konjugierende Enzyme, UBCs) die aktivierte Ubiquitin-Einheit von E1 auf ein Mitglied der Ubiquitin-Protein-Ligase-Familie, E3, an das das Substratprotein spezifisch gebunden ist. E3 katalysiert den letzten Schritt des Konjugationsprozesses, die kovalente Bindung von Ubiquitin an das Substrat. Die erste Ubiquitin-Einheit wird auf die ɛ-NH2-Gruppe eines Lys-Rests des Proteinsubstrats übertragen, um eine Isopeptidbindung zu erzeugen. In aufeinanderfolgenden Reaktionen wird eine Polyubiquitinkette durch prozessive Übertragung zusätzlicher aktivierter Teile auf Lys48 des zuvor konjugierten Ubiquitinmoleküls synthetisiert. Die Kette dient höchstwahrscheinlich als Erkennungsmarker für das Proteasom (siehe unten). Ubiquitin K48R oder methyliertes Ubiquitin (bei dem alle freien Aminogruppen chemisch modifiziert wurden) können keine Polyubiquitin-Ketten bilden und dienen als Kettenabbrecher. Wenn sie in Zellen überexprimiert oder in zellfreie Systeme eingeführt werden, hemmen sie folglich die Proteolyse. Die Bindung des Substrats an E3 ist spezifisch und deutet darauf hin, dass E3s eine wichtige Rolle bei der Erkennung und Auswahl von Proteinen für die Konjugation und den anschließenden Abbau spielen. Die Struktur des Systems scheint hierarchisch zu sein: ein einziges E1 scheint die für alle Modifikationen erforderliche Aktivierung von Ubiquitin durchzuführen. Mehrere wichtige Arten von E2-Enzymen wurden in Säugetierzellen charakterisiert. Es scheint, dass jedes E2-Enzym mit einem oder mehreren E3-Enzymen zusammenwirken kann. Obwohl bisher nur relativ wenige E3-Enzyme beschrieben wurden, scheinen die Ubiquitin-Ligasen zu einer großen, noch wachsenden Familie von Enzymen zu gehören. Was den Erkennungsmodus der Ligasen betrifft, so ist es unwahrscheinlich, dass jedes E3-Enzym nur ein einziges Substrat anvisiert, abgesehen von einigen wenigen Fällen. Vielmehr ist es denkbar, dass mehrere verschiedene zelluläre Proteine von einer einzigen Ligase über ein ähnliches, aber eindeutig nicht identisches Strukturmotiv erkannt werden. Einige wenige Proteine werden möglicherweise über ihren freien und „destabilisierenden“ N-terminalen Rest erkannt („N-End-Regel“; Ref. 6). Die überwiegende Mehrheit der zellulären Proteine ist jedoch an ihren N-Termini acetyliert oder hat „stabilisierende“ Amino-Termini und wird über verschiedene Signale erkannt. Einige werden über primäre Sequenzen erkannt, die sich stromabwärts vom N-terminalen Rest befinden. Andere werden über sekundäre, posttranslationale Modifikation(en) wie Phosphorylierung oder nach Assoziation mit Hilfsproteinen wie Onkoproteinen oder molekularen Chaperonen erkannt.

Nach der Konjugation wird die Proteinkomponente des Addukts durch den Proteasom-Komplex abgebaut, und freies und wiederverwendbares Ubiquitin wird freigesetzt (für neuere Übersichten über Proteasomen, siehe Ref. 7-10). Obwohl der derzeitige Konsens darin besteht, dass das 26S-Proteasom der wichtigste proteolytische Arm des Ubiquitinsystems ist, könnte das Substratspektrum des Enzyms breiter sein und auch nicht ubiquitinylierte Proteine umfassen. Ein gut untersuchter Fall ist der der Ornithindecarboxylase (ODC). ODC wird nach einer nicht-kovalenten Assoziation mit einem Antienzym abgebaut, das im Erkennungsprozess als substratspezifisches Ubiquitin-ähnliches Chaperon fungieren kann. Andere Substrate, vor allem Proteine des endoplasmatischen Retikulums (ER), können ebenfalls vom Proteasom ohne vorherige Ubiquitinylierung abgebaut werden, obwohl dies noch nicht eindeutig geklärt ist. Dazu gehören beispielsweise fehlgefaltete MHC-Schwerkettenmoleküle (HCs), das 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA (HMG-R) von Säugetieren und die Z-Variante des α-1-Antitrypsins (α1-ATZ) (siehe Ref. 11). Es ist jetzt auch klar, dass nicht alle ubiquitinylierten Proteine für den Abbau durch das Proteasom bestimmt sind. Dies gilt vor allem für reife Membranproteine der Zelloberfläche wie den Wachstumshormonrezeptor. Bei diesen Proteinen erfolgt die Ubiquitinmodifikation nach der Ligandenbindung und ist für ihre Endozytose und ihre Ausrichtung auf das Lysosom erforderlich (siehe Ref. 12). Der Abbau von membranverankerten Proteinen durch das Ubiquitinsystem wirft wichtige, noch ungelöste mechanistische Probleme auf, die vor allem mit der Frage zusammenhängen, wie zwei topologisch unterschiedliche Ereignisse wie Fehlfaltung im ER und Abbau im Zytosol oder Ligandenbindung in der extrazellulären Domäne und Ubiquitinylierung an einem zytosolischen Schwanz eines Rezeptors zusammenkommen. Bei Membranproteinen an der Zelloberfläche stellt sich die Frage, welche Rolle die Ubiquitinmodifikation spielt: Ist sie für die Endozytose des markierten Proteins erforderlich oder in einem späteren Stadium für seine spezifische Ausrichtung und Aufnahme durch das Lysosom. Bei ER-Proteinen, die durch das zytosolische Proteasom abgebaut werden, stellen sich wichtige Fragen zu den Mechanismen, die der Rückführung dieser Proteine durch die Membran zurück in das Zytosol zugrunde liegen. Die Transmembrandomäne von membranverankerten Proteinen ist hydrophob und ihre Entfernung von der Membran erfolgt wahrscheinlich durch einen spezialisierten, energieabhängigen, kanalbasierten Transport. Bei lumenalen ER-Proteinen stellt sich die Frage, wie sie in das Zytosol zurücktransportiert werden.

Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass das Prinzip der Ubiquitin-Modifikation nicht auf die gezielte Degradation von Proteinen beschränkt ist. Es scheint, dass Ubiquitin Mitglied einer größeren Familie ist, und es wurden auch mehrere Ubiquitin-ähnliche Proteine beschrieben. Ein interessanter Fall betrifft das Targeting in komplexen Strukturen. Es wurde festgestellt, dass die Lokalisierung von RanGAP1, einem die Ran-GTPase aktivierenden Protein, an das Kernporenkomplexprotein RanBP2 von einer einzigen und stabilen kovalenten Modifikation durch ein 11,5 kDa großes, 101 Residuen umfassendes ubiquitinähnliches Protein, SUMO-1, abhängig ist (13). Die Aktivierungsreaktion ähnelt der von Ubiquitin und umfasst E1 und ein spezifisches E2, UBC9. Die posttranslationale kovalente Modifikation durch Ubiquitin und ubiquitinähnliche Moleküle hat also ein breites Spektrum an Funktionen. Sie ist an der Ausrichtung von Proteinen für den Abbau durch das Proteasom und das Lysosom beteiligt, erfüllt aber auch nicht-proteolytische Funktionen.

Der am besten untersuchte Proteasomkomplex, der am Abbau von mit Ubiquitin markierten Proteinen beteiligt ist, ist der 26S-Proteasomkomplex. Es handelt sich um eine „dumpfschalenförmige“ symmetrische Struktur, die aus einer katalytischen Kerneinheit, einem tonnenförmigen 20S-Proteasom-Komplex, besteht, der an beiden Seiten von regulatorischen 19S-Proteasom-Komplexen (19S-20S-19S) flankiert wird. Die Kristallstruktur des eukaryotischen 20S-Proteasoms (Hefe) wurde bei 2,4 Å aufgelöst (14). Die Studie hat frühere Vorhersagen über die Struktur des Komplexes bestätigt, aber auch einige unerwartete Merkmale offenbart. Der Hefekomplex ist als Stapel von vier Ringen angeordnet, von denen jeder sieben verschiedene Untereinheiten, α1-7β1-7β1-7α1-7, enthält. Die verschiedenen α- und β-Untereinheiten haben Molekularmassen im Bereich von 25-30 kDa. Die aktiven Stellen befinden sich in drei β-Untereinheiten, β1, β2 und β5, aber nicht in den α-Untereinheiten. Die topologische Analyse der Lage der verschiedenen Untereinheiten hat gezeigt, dass für die drei verschiedenen proteolytischen Aktivitäten, die trypsinähnlichen, die chymotrypsinähnlichen und die postglutamylpeptidylhydrolytischen Aktivitäten, die aktiven Stellen von benachbarten Paaren identischer β-Typ-Untereinheiten gebildet werden, die in verschiedenen β-Ringen sitzen. Die Analyse der Reste der aktiven Stellen offenbart einen neuartigen proteolytischen Mechanismus. Die drei β-Untereinheiten durchlaufen eine Autokatalyse zwischen dem letzten Gly-Rest des Pro-Peptids und Thr1 der reifen Untereinheit, die an dem autokatalytischen Prozess beteiligt ist und zu einem wesentlichen Teil der katalytischen Stelle wird. Die Auflösung der Kristallstruktur ermöglichte auch ein besseres Verständnis der Wirkungsweise der verschiedenen Proteasominhibitoren. Thr1 in β1, β2 und β5 bindet den weniger spezifischen Calpain-I-Inhibitor Acetyl-Leu-Leu-Norleucinal (ALLN). Lactacystin, ein spezifischerer Inhibitor, kann kovalent an β5 gebunden werden, wo er zusätzlich eine Vielzahl von Wasserstoffbrückenbindungen mit anderen umgebenden Seitenketten erzeugen kann. Mutationsanalysen haben gezeigt, dass die anderen β-Untereinheiten, insbesondere β4 und β7, die sich in unmittelbarer Nähe von β5 und β1 befinden, die Aktivität dieser Untereinheiten beeinflussen. Auch β6 und β7 werden durch spezifische Prozessierung aus Pro-Proteinen gebildet. β3 und β4 werden nicht prozessiert. Aufgrund ihrer möglichen Rolle bei der Herstellung von Kontakten zwischen den Untereinheiten und der Stabilisierung der komplexen Struktur scheint es, dass die Propeptide für die Biogenese und Stabilisierung der proteasomalen Struktur wesentlich sind und die Prozessierung erst nach dem Zusammenbau erfolgt. Die Kristallstruktur hat auch gezeigt, dass die α-Ketten, obwohl katalytisch inaktiv, eine wesentliche Rolle bei der Stabilisierung der Zwei-Ring-Struktur der β-Ketten spielen. Sie müssen auch eine Rolle bei der Bindung der 19S-Cap-Komplexe spielen, aber die Struktur der Kontakte und die Mechanismen der Bindung werden erst aufgeklärt werden, wenn die Kristallstruktur des 26S-Komplexes aufgelöst ist. Die Kristallstruktur hat auch einen Abstand von 28 Å zwischen Thr1-Resten benachbarter aktiver β-Untereinheiten ergeben. Dieser Abstand bestimmt wahrscheinlich die Länge der während des proteolytischen Prozesses erzeugten Peptide (≈8-aa-Reste) und erklärt die Rolle des Proteasoms bei der Erzeugung antigener Peptide, die auf MHC-Molekülen der Klasse I präsentiert werden. Das Vorhandensein von Zwischenprodukten variabler Länge deutet jedoch auf eine zweite hydrolytische Stelle stromabwärts von Thr1 hin (siehe unten).

Ein wichtiges, noch ungelöstes Problem betrifft den Eintritt von Proteinsubstraten und den Austritt von proteolytischen Produkten aus dem Proteasom. Das archaebakterielle (Thermoplasma acidophilum) Proteasom enthält zwei Eingangsporen von ≈13 Å an den beiden Enden des Zylinders, die von definierten Segmenten der sieben α-Ketten umgeben sind. Im eukaryotischen 20S-Proteasom gibt es diese Eintrittspforten überraschenderweise nicht, und der Eintritt in die katalytische Kammer zwischen den β-Ringen ist von den Enden des Komplexes aus nicht möglich. Die N-terminalen Domänen von α1, α2, α3, α6 und α7 ragen aufeinander zu und füllen den Raum in mehreren Schichten eng zusammenwirkender Seitenketten. Der Eintritt von den Enden her wird also nur nach einer erheblichen Umstrukturierung möglich sein, die möglicherweise nach der Assoziation mit dem 19S-Komplex erfolgt. Eine solche Umlagerung kann auch metabolische Energie erfordern, die durch die ATPase-Aktivität mehrerer Untereinheiten des 19S-Komplexes bereitgestellt werden kann. Der Hefekomplex weist einige enge seitliche Öffnungen auf, insbesondere an der Schnittstelle zwischen dem α- und dem β-Ring. Diese Öffnungen führen direkt zu den aktiven Thr1-Stellen. Sie sind mit polaren Resten beschichtet, die sich potenziell umordnen können, um ≈10 Å große Öffnungen zu erzeugen, durch die ungefaltete und verlängerte Proteinsubstrate eintreten können.

Die Regulierung der 20S-Proteasom-Aktivität erfolgt auf mehreren Ebenen. Nach der Stimulation von Antigen-präsentierenden Zellen mit Interferon γ werden drei konstitutive β-Untereinheiten, 1, 2 und 5, durch neue und unterschiedliche β-Untereinheiten, β1i (LMP2), β2i (MECL1) und β5i (LMP7), ersetzt. Die neuen Untereinheiten sind relativ effizienter bei der Erzeugung antigener Peptide, die von den MHC-Klasse-I-Molekülen und den entsprechenden zytotoxischen T-Zellen über die T-Zell-Rezeptoren erkannt werden. Eine andere Art der Regulierung beinhaltet die Komplexbildung mit regulatorischen Komplexen. Das 26S-Proteasom wird nach ATP-abhängiger Assoziation des 20S-Komplexes mit zwei 19S-Komplexen gebildet. Die 19S-Komplexe bestehen aus mindestens 18 verschiedenen Proteinen mit einem Molekularmassenbereich von 25-110 kDa. Dieser Komplex dient als Eintrittspforte in den katalytischen Kern und stellt die verschiedenen regulatorischen Funktionen bereit, die notwendig sind, um den selektiven Abbau von Ubiquitin-markierten Substraten zu gewährleisten. Dazu gehören beispielsweise eine Bindungsstelle für Ubiquitin-Ketten, Ubiquitin-Recycling-Aktivität und mehrere ATPasen sowie die Fähigkeit, die verschiedenen Peptidase-Aktivitäten des 20S-Komplexes zu stimulieren. In der Tat wurden Untereinheiten identifiziert, die solche Aktivitäten ausüben. Von besonderem Interesse ist die Ubiquitin-Ketten bindende Untereinheit, die sowohl bei Säugetieren (S5a) als auch bei Pflanzen (MBP1) beschrieben wurde. Diese Untereinheiten binden Ubiquitin-Monomere; Polyubiquitin-Ketten, insbesondere solche, die mehr als vier Einheiten enthalten, binden jedoch mit höherer Affinität. Kürzlich wurde das Hefegen, das für die homologe Kette, Mcb1, kodiert, kloniert. Überraschenderweise zeigen Δmcb1-Deletionsmutanten keinen Wachstumsdefekt und bauen normal ubiquitinylierte Proteine ab, mit Ausnahme des linearen Fusionsmodellproteins Ubiquitin-Pro-β-Gal. Sie zeigen jedoch eine leichte Empfindlichkeit gegenüber Stress, wie z.B. der Einwirkung von Aminosäureanaloga (15). Eine mögliche Erklärung für diese unerwarteten Ergebnisse ist, dass ubiquitinylierte Proteine von einer zusätzlichen, noch nicht definierten, proteasomalen Untereinheit erkannt werden. Ein solcher Kandidat ist das deubiquitinylierende Enzym Doa4, das die Aufgabe hat, Ubiquitineinheiten von proteolytischen Substraten zu entfernen. Eine andere Möglichkeit ist, dass das Proteasom keine Ubiquitin-Anteile erkennt, sondern sich ähnlich wie molekulare Chaperone mit schlecht definierten, fehlgefalteten Motiven im Proteinsubstrat verbindet. Diese Motive entstehen nach der „Denaturierung“ des Proteins durch Ubiquitin-Markierung. Die Identifizierung der Spezifität der Erkennung durch das Proteasom und die Rolle, die Ubiquitin in diesem Prozess spielt, sind für das Verständnis der Wirkungsmechanismen der Protease im Besonderen und des Ubiquitinsystems im Allgemeinen von wesentlicher Bedeutung. Eine weitere regulatorische Funktion des 19S-Proteasoms ist die Bearbeitung von Polyubiquitinketten. Der Komplex enthält eine 37-kDa-Isopeptidase, die einzelne Ubiquitin-Einheiten vom distalen Ende kurzer Poly-Ubiquitin-Ketten entfernt (16). Es wird angenommen, dass diese Isopeptidase an der Bearbeitung und Rettung von schlecht ubiquitinylierten oder langsam abgebauten Proteinen vor dem Abbau beteiligt ist. In dieser Hinsicht unterscheidet sie sich von Doa4 und einer ATP-abhängigen Isopeptidase, die mit dem Proteasom assoziiert ist. Die beiden Enzyme sind an der Wiederverwertung von Ubiquitin und der Aufrechterhaltung des freien Ubiquitinspiegels in der Zelle beteiligt.

Ein weiterer Komplex, der mit dem 20S-Proteasom assoziiert ist und dessen Aktivität drastisch erhöht, ist PA28 (REG oder der 11S-Regulator; siehe 17 und 18). Anders als bei der Assoziation mit 19S ist die Komplexbildung mit PA28 ATP-unabhängig. Nach der Assoziation erhöht PA28 die Vmax und senkt den Km des 20S-Komplexes gegenüber einer ganzen Reihe verschiedener Peptide. Der PA28-20S-PA28-Komplex ist jedoch inaktiv gegenüber intakten nativen oder Ubiquitin-konjugierten Proteinen. Der reine Aktivator ist ein Komplex aus zwei ≈28-kDa-Untereinheiten, PA28α und PA28β, die ≈50% identisch sind. Immunopräzipitation mit untereinheitsspezifischen Antikörpern und chemische Vernetzungsexperimente zeigten, dass PA28 ein ringförmiges Hexamer ist, das aus abwechselnden α- und β-Untereinheiten mit einer Stöchiometrie von (αβ)3 besteht (19). Interessanterweise sind diese Untereinheiten auch zu 30-40% identisch mit einem Kernprotein mit bisher unbekannter Funktion, dem Ki-Antigen, das mit Seren von Patienten mit der Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythematodes reagiert. Der hexamere Komplex hat eine ringförmige Struktur (Abb. 1) und umhüllt den 20S-Proteasom-Komplex entweder an einer oder an beiden Endplatten. Die Kappenstruktur wird von einem zentralen Kanal mit einer 20 Å großen Öffnung am äußersten Ende und einer 30 Å großen Öffnung an der Proteasom-Bindungsfläche durchzogen (20, 21). Die Öffnungen und der Kanal dienen höchstwahrscheinlich als Teil der Translokationsmaschinerie von Peptidsubstraten auf dem Weg zur katalytischen Kammer des 20S-Komplexes. PA28α kann Hexa- oder Hepta-Homomultimere bilden, die mit dem 20S-Komplex assoziieren und ihn aktivieren, allerdings weniger effizient als das (αβ)3-Heteromultimer. Im Gegensatz dazu assoziiert PA28β nicht mit dem 20S-Komplex und hat keine stimulierende Aktivität. Die Rolle der β-Untereinheiten besteht wahrscheinlich darin, die Aktivität von PA28 zu modulieren, indem sie indirekt die Aktivität der α-Untereinheiten beeinflussen oder die Affinität des PA28-Partikels zum 20S-Proteasom verändern.

PA28α enthält in seinem zentralen Teil eine einzigartige Sequenz, das KEKE-Motiv, das eine hydrophile Domäne ist, die aus abwechselnd positiv geladenen Lys-Resten und negativ geladenen Glu-Resten besteht. Es wurde postuliert, dass dieses Motiv, das in PA28β nicht vorhanden ist, die Protein-Protein-Interaktion zwischen den α-Untereinheiten des PA28-Partikels und den α-Untereinheiten des 20S-Proteasoms fördert (22). Eine Mutationsanalyse ergab jedoch, dass ΔKEKE PA28α seine stimulierende Aktivität beibehält (23). Die Bindung an das 20S-Proteasom erfordert jedoch einen intakten C-Terminus des PA28α und könnte die C2-α-Untereinheit des 20S-Proteasoms einbeziehen (8). Es wurde vermutet, dass die Phosphorylierung die stimulierende Aktivität von PA28α aktiviert, allerdings ist diese Art der Regulierung noch nicht eindeutig geklärt.

Die Mutationsanalyse von PA28α durch Zhang und Kollegen (5) ergab mehrere inaktivierende Mutationen in einer definierten Schleife an der Basis des Moleküls. Einige der mutierten Proteine binden fest an den 20S-Komplex, können ihn aber nicht aktivieren (5). Somit kann die Bindung an das Proteasom eindeutig von der stimulierenden Aktivität von PA28 getrennt werden. Interessanterweise gibt es eine große Lücke in der Verteilung der inaktivierenden Mutationen, die die Aminosäurereste 51-122 umfasst. Diese mutationsfreie Zone stellt eine Region dar, die für jede Untereinheit des PA28-Komplexes einzigartig ist. Sie ist wahrscheinlich nicht an der Interaktion von PA28 mit dem 20S-Komplex oder an der Stimulierung seiner proteolytischen Aktivität beteiligt. Vielmehr könnte sie eine Rolle bei der Funktion des Partikels in der intakten Zelle spielen, wie z.B. bei seiner intrazellulären Lokalisierung oder der Assoziation mit anderen Komponenten, die seine spezifische Aktivität und Interaktionen bestimmen.

Ein wichtiges Problem betrifft die physiologische Rolle von PA28. Beide Untereinheiten werden durch Interferon γ deutlich induziert, was auf eine Rolle des Partikels bei der Antigenverarbeitungsfunktion des Proteasoms hindeutet. Die Überexpression von PA28α in einer Mausfibroblastenlinie, die das pp89-Protein des Cytomegalovirus exprimiert, führt zu einer deutlichen Verbesserung der Erkennung durch pp89-spezifische zytotoxische T-Zellen. In ähnlicher Weise wurde auch die Präsentation eines Influenza-Nukleoproteins gesteigert (24). Studien in einem zellfreien System ergaben, dass der PA28-20S-PA28-Komplex mit Hilfe eines koordinierten Doppelspaltungsmechanismus große Peptide (die flankierende Sequenzen sowohl am N- als auch am C-Terminus aufweisen) effizient auf genau die antigenen Epitope zuschneiden kann, die vom MHC-Komplex und den entsprechenden zytotoxischen T-Zellen erkannt werden (25). Es scheint also, dass PA28 eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung von Antigenen für die Präsentation auf Klasse-I-MHC-Molekülen spielt. Da das PA28-20S-PA28-Proteasom keine intakten nativen oder ubiquitinylierten Proteine verdauen kann, muss es dem 19S-20S-19S-Proteasom nachgeschaltet sein, das mit Ubiquitin markierte Proteine oder große Peptide abbaut. Es ist auch möglich, dass ein einziges asymmetrisches 19S-20S-PA28-Proteasom existiert, das diesen zweistufigen proteolytischen Prozess, die anfängliche Proteolyse zu großen Peptiden und das abschließende Trimmen, durchführen kann, auch wenn dies noch nicht nachgewiesen wurde. Die symmetrischen oder mutmaßlich asymmetrischen PA28-enthaltenden Proteasomen könnten auch am terminalen Abbau von Peptiden zu freien Aminosäuren beteiligt sein, eine Aktivität, die nicht vom 19S-20S-19S-Proteasom katalysiert werden kann (Abb. 1). Es scheint also, dass die Aufklärung der zellulären Rolle des PA28-Komplexes weitere Experimente abwarten muss.