Before It Gets Started: Regulierung der Translation am 5′ UTR

Abstract

Die Translationsregulation spielt sowohl unter normalen physiologischen Bedingungen als auch bei Krankheiten eine wichtige Rolle. Diese Regulierung erfordert cis-regulatorische Elemente, die sich meist in 5′ und 3′ UTRs befinden, und trans-regulatorische Faktoren (z.B. RNA-bindende Proteine (RBPs)), die spezifische RNA-Merkmale erkennen und mit der Translationsmaschinerie interagieren, um deren Aktivität zu modulieren. In diesem Beitrag werden wichtige Aspekte der 5′-UTR-vermittelten Regulation erörtert, indem ein Überblick über die Merkmale und die Funktion der wichtigsten Elemente in dieser Region, wie uORF (Upstream Open Reading Frame), Sekundärstrukturen und RBP-Bindungsmotive, sowie über verschiedene Mechanismen der Translationsregulation und deren Auswirkungen auf die Genexpression und die menschliche Gesundheit gegeben wird, wenn diese dereguliert sind.

1. Translationsregulation

Die Genexpression kann auf mehreren Ebenen moduliert werden, von der Chromatinmodifikation bis zur mRNA-Translation. Trotz der Bedeutung der Transkriptionsregulation ist an dieser Stelle klar, dass der mRNA-Gehalt nicht als alleiniger Parameter verwendet werden kann, um den Proteingehalt einer Zelle zu begründen. Tatsächlich haben wir in einer kürzlich durchgeführten Studie unseres Labors festgestellt, dass bei weniger als einem Drittel der analysierten Gene in einer menschlichen Zelllinie eine direkte Korrelation zwischen mRNA und Protein besteht. Darüber hinaus deutet unsere Analyse darauf hin, dass die Translationsregulation erheblich zur Proteinvariation beiträgt, da mehrere Parameter, die mit der Translation zusammenhängen, wie 5′ UTR, 3′ UTR, Länge der kodierenden Sequenz, Vorhandensein von uORFs und Aminosäurezusammensetzung usw., gute Korrelationen mit den erhaltenen mRNA/Protein-Verhältnissen aufweisen. Die Translationsregulation fungiert als wichtiger Schalter, wenn schnelle Veränderungen der Genexpression als Reaktion auf interne und externe Stimuli erforderlich sind (PDGF2, VEGF, TGFβ sind Beispiele für Gene, die auf diese Weise gesteuert werden). Die Translationsregulation spielt auch während der Entwicklung und der Zelldifferenzierung eine wichtige Rolle, indem sie die Expressionsniveaus spezifischer mRNA-Untergruppen während eines bestimmten Zeitfensters verändert, während die Mehrheit der Transkripte unverändert bleibt (nachzulesen in ).

In diesem Beitrag konzentrieren wir uns auf die Bedeutung der 5′ UTR-vermittelten Regulation und die verschiedenen funktionellen Elemente in dieser Region, mit Ausnahme des IRES, das in einem anderen Artikel dieser Ausgabe behandelt wird. Die wichtigsten regulatorischen Elemente im 5′ UTR sind Sekundärstrukturen (einschließlich IRES), Bindungsstellen für RNA-bindende Proteine, uAUGs und uORFs (Abbildung 1).

Abbildung 1

Regulatorische Elemente im 5′ UTR.

2. 5′ UTR

Die durchschnittliche Länge von 5′ UTRs beträgt ~100 bis ~220 Nukleotide bei allen Arten. Bei Wirbeltieren sind 5′-UTRs tendenziell länger in Transkripten, die für Transkriptionsfaktoren, Protoonkogene, Wachstumsfaktoren und ihre Rezeptoren sowie für Proteine kodieren, die unter normalen Bedingungen schlecht übersetzt werden. Ein hoher GC-Gehalt ist ebenfalls ein konserviertes Merkmal, mit Werten von über 60 % bei warmblütigen Wirbeltieren. Im Zusammenhang mit Haarnadelstrukturen kann der GC-Gehalt die Effizienz der Proteintranslation unabhängig von der thermischen Stabilität der Haarnadel und der Position der Haarnadel beeinflussen. UTRs von eukaryotischen mRNAs weisen auch eine Vielzahl von Wiederholungen auf, die kurze und lange durchsetzte Elemente (SINEs bzw. LINEs), einfache Sequenzwiederholungen (SSRs), Minisatelliten und Makrosatelliten umfassen.

Die Initiierung der Translation in Eukaryonten erfordert die Rekrutierung ribosomaler Untereinheiten entweder an der 5′ m7G-Cap-Struktur. Das Initiationscodon befindet sich im Allgemeinen weit stromabwärts, was eine ribosomale Bewegung zu dieser Stelle erfordert. Diese Bewegung scheint bei einigen mRNAs nichtlinear zu sein (d. h., die ribosomalen Untereinheiten scheinen Segmente der 5′-UTR zu umgehen (shunten), während sie sich in Richtung AUG bewegen). Durch Shunting könnten mRNAs, die uAUGs oder Haarnadelstrukturen enthalten, effizient übersetzt werden. Wichtige Beispiele hierfür sind die mRNAs des Blumenkohl-Mosaik-Virus und des Adenovirus. Der Mechanismus des ribosomalen Shuntings ist ziemlich komplex und erfordert eine mRNA-rRNA-Basenpaarung.

Gene, die Unterschiede in der 5′ UTR ihrer Transkripte aufweisen, sind relativ häufig. 10-18% der Gene exprimieren alternative 5′ UTR, indem sie mehrere Promotoren nutzen, während alternatives Spleißen innerhalb der UTRs schätzungsweise 13% der Gene im Transkriptom von Säugetieren betrifft. Diese Variationen im 5′-UTR können als wichtige Schalter zur Regulierung der Genexpression fungieren. Zwei wichtige Beispiele sind die mit Krebs zusammenhängenden Gene BRCA1 (Brustkrebs 1) und TGF-β (transformierender Wachstumsfaktor β). BRCA1 ist ein Tumorsuppressor, der häufig bei Brustkrebs mutiert ist und Funktionen im Zellzyklus, bei der Apoptose und bei der Reparatur von DNA-Schäden hat. BRAC1 produziert zwei verschiedene Transkripte, die sich von zwei verschiedenen Promotoren ableiten und daher Unterschiede in ihrem 5′ UTR aufweisen. Ein kürzeres Transkript wird sowohl in krebsartigem als auch in nicht krebsartigem Brustgewebe exprimiert und effizient translatiert, während ein längeres Transkript vor allem in Brustkrebs exprimiert wird. Das Vorhandensein mehrerer uAUGs und eine komplexere Struktur beeinträchtigen die Translation dieses längeren Transkripts dramatisch. Dies führt zu einem allgemeinen Rückgang der BRAC1-Konzentration in den Tumorzellen und damit zu einer Verringerung der Wachstumshemmung. TGF-β ist an einer Vielzahl von Prozessen beteiligt, darunter Zellproliferation, Migration, Wundheilung, Entwicklung, Tumorentstehung und Immunsuppression. Es gibt drei bekannte Isoformen: β1, β2 und β3. TGF-β3 produziert zwei alternative Transkripte: ein 3,5 kb großes Transkript mit einem sehr langen 5′ UTR (1,1 kb) und ein 2,6 kb großes Transkript mit einem kürzeren 5′ UTR (0,23 kb). Das Vorhandensein von 11 uORFs in dem längeren Transkript hemmt dessen Translation dramatisch, während das kürzere Transkript effizient translatiert wird.

3. Regulation durch Sekundärstruktur

Sekundärstrukturen können als wichtige regulatorische Werkzeuge in 5′ UTRs fungieren. Es wurde ein Zusammenhang mit der Genfunktion vermutet; es wurde festgestellt, dass Sekundärstrukturen besonders häufig bei mRNAs vorkommen, die für Transkriptionsfaktoren, Protoonkogene, Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren sowie für Proteine kodieren, die unter normalen Bedingungen schlecht übersetzt werden. >90% der Transkripte in diesen Klassen haben 5′ UTRs, die stabile Sekundärstrukturen mit durchschnittlichen freien Energien von weniger als -50 kcal/mol enthalten. 60% dieser stabilen Sekundärstrukturen sind sehr nahe an der Cap-Struktur positioniert. Diese Strukturen sind sehr wirksam bei der Hemmung der Translation. Tatsächlich würde eine Haarnadel in der Nähe des Caps mit einer freien Energie von -30 kcal/mol ausreichen, um den Zugang des Präinitiationskomplexes zur mRNA zu blockieren. Wenn sie sich weiter entfernt im 5′ UTR befinden, benötigen Hairpins eine freie Energie von mehr als -50 kcal/mol, um die Translation zu blockieren. Stabile Sekundärstrukturen können der Abwicklungsaktivität der Helikase elF4A widerstehen. Dieser Effekt kann teilweise durch die Überexpression von elF4A in Zusammenarbeit mit elF4B überwunden werden. mRNAs mit einer stark strukturierten 5′ UTR wie Proto-Onkogene und andere Wachstumsfaktoren nutzen eine cap-abhängige Translationsinitiierung. Es überrascht nicht, dass die Überexpression von Komponenten der Translationsinitiationsmaschinerie, einschließlich elF4E, mit der Tumorentstehung in Verbindung gebracht wird (nachzulesen in ).

Das Gen TGF-β1 ist ein gutes Beispiel für eine durch die Sekundärstruktur vermittelte Translationshemmung. Ein evolutionär konserviertes Motiv in der 5′ UTR bildet eine stabile Stammschleife. Diese Struktur allein ist jedoch nicht ausreichend, um die Translation zu blockieren. Die Translationsunterdrückung von TGF-β1 hängt von einer erhöhten Bindung des RNA-Bindeproteins YB-1 an das TGF-β1-Transkript ab. Es wurde dann vorgeschlagen, dass YB-1 die 5′ UTR von TGF-β1 dank seines GC-Gehalts mit hoher Affinität bindet und mit der Stammschleife zusammenarbeitet, um die TGF-β1-Translation durch Erleichterung der Duplexbildung zu hemmen.

4. Regulierung durch RNA-bindende Proteine

Es wird vorhergesagt, dass das menschliche Genom für etwa 1.000 RNA-bindende Proteine (RBPs) kodiert, wobei ein großer Prozentsatz von ihnen an der Translation beteiligt ist. Sie können in zwei Hauptgruppen eingeteilt werden: RBPs, die Teil der grundlegenden Translationsmaschinerie sind und für die Translation aller exprimierten mRNAs benötigt werden (Beispiele: PABPI, elf4E), und RBPs, die auf selektivere Weise funktionieren, indem sie entweder positiv oder negativ das Niveau der Translation spezifischer Ziel-mRNAs kontrollieren (Beispiele: HuR, Musashi1). In Bezug auf die letztgenannte Gruppe wurde beobachtet, dass RBPs unterschiedliche Mechanismen nutzen können, um die Translation zu steigern oder zu hemmen. Obwohl mehrere Ausnahmen bekannt sind, kann man sagen, dass RBPs häufig spezifische Motive in UTRs erkennen und mit der Translationsmaschinerie interagieren, um die Expression zu kontrollieren. Die Beeinflussung der Translation findet normalerweise während des Initiationsschritts statt (nachzulesen in ).

Das am besten charakterisierte Beispiel für eine RBP-vermittelte Regulation unter Einbeziehung von 5′ UTRs liefern die Eisenregulationsproteine (IRP 1 und 2). Diese Proteine erkennen eine hochkonservierte Stammschleifenstruktur mit ca. 30 Nukleotiden, die als Eisenreaktionselement (IRE) bezeichnet wird. Zu den wichtigsten Merkmalen gehören eine Hexanukleotidschleife mit der Sequenz CAGYCX (Y = U oder A; X = U, C oder A) und ein oberer Stamm von 5 bp, der von einem unteren Stamm variabler Länge durch ein ungepaartes Cytosin getrennt ist. Diese Regulierung ist für die Aufrechterhaltung der zellulären Eisenhomöostase von entscheidender Bedeutung, da die Expression zahlreicher mRNAs, die mit der Eisenspeicherung und dem Eisenstoffwechsel in Verbindung stehen, wie Ferritin, mitochondriale Aconitase, Succinatdehydrogenase-Eisenprotein, erythroide 5-Aminolävulinat-Synthetase (eALAS) und ein Eisenexportmolekül namens Ferroportin (FPN1), durch dieses System moduliert wird. Wenn der zelluläre Eisenspiegel niedrig ist, binden IRP1 und IRP2 die IRE und blockieren die Translation des nachgeschalteten ORFs. Bei hohen intrazellulären Eisenspiegeln ist die RNA-Bindungsaktivität der beiden IRP reduziert (Abbildung 2(a)). IREs befinden sich in der Regel in der Nähe des Caps, was eine sterische Hemmung der Bindung von 40S ribosomalen Untereinheiten an das Transkript bewirkt. Sind die IREs weiter von der Kappe entfernt, blockiert der IRE-IRP-Komplex nicht die 40S-Rekrutierung, sondern das ribosomale Scanning (siehe ). Eine interessante Umgehung des IRE/IRP-Mechanismus kann in eisenarmen duodenalen und erythroiden Vorläuferzellen beobachtet werden. Ein vorgelagerter Promotor wird verwendet, um FPN1-Prä-mRNAs zu erzeugen, die ein weiteres Exon enthalten, das durch alternatives Spleißen mit einem Spleißakzeptor im 3′ des IRE verbunden ist. Es wird ein reifes FPN1-Transkript erzeugt, das denselben offenen Leserahmen enthält; die 5′-UTR enthält jedoch nicht die IRE. Daher exprimieren diese Zellen die alternative FPN1-Isoform in einer eisenunabhängigen Weise. Mutationen, die IREs betreffen, können zu Krankheiten führen. Dies ist der Fall beim hereditären Hyperferritinämie-Katarakt-Syndrom (HHCS), einer autosomal-dominanten genetischen Störung, bei der die Aggregation und Kristallisation von Ferritin in der Linse zu bilateralem Katarakt führt .

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Abbildung 2

Translationale Regulierung durch RNA-bindende Proteine. (a) In eisenarmen Zellen binden IRPs an die IRE, die in der 5′ UTR der Ferritin-mRNA lokalisiert ist, und blockieren deren Translation. Sobald der zelluläre Eisenspiegel ansteigt, bindet ein Fe-haltiger Komplex an IRPs. Dadurch werden diese Proteine allosterisch modifiziert, was die IRP-IRE-Bindung verringert und die Translation von Ferritin-mRNAs ermöglicht. (b) Regulierung des msl-2-Gens in weiblichen Fliegen. Nach der Transkription im Zellkern bindet SXL spezifisch an intronische U-reiche Regionen der msl-2 Prä-mRNA und hemmt die Entfernung des Introns (1). Im Zytoplasma bindet SXL an die gleichen Elemente, die jetzt in der 5′ UTR der reifen msl-2 mRNA lokalisiert sind, verstärkt die Translationsinitiierung eines vorgelagerten ORF (2) und verhindert die Translation des Haupt-ORF (3). Die regulatorischen Elemente in der 3′ UTR der msl-2 mRNA waren nicht vertreten.

Die RBP-vermittelte Regulation kann sehr aufwendig sein und mehrere Schritte umfassen. Ein gutes Beispiel für die Überschneidung von Faktoren und unterschiedlichen Regulierungsprozessen ist das Gen male-specific-lethal 2 (msl-2) in Drosophila, ein Hauptakteur beim Dosierungsausgleich. Das frauenspezifische RNA-Bindungsprotein sex lethal (SXL) ist an mehreren Aspekten der msl-2-Regulation beteiligt, wobei die msl-2-Expression verhindert werden muss (Abbildung 2(b)). Die Regulierung beginnt auf der Ebene des Spleißens; SXL bindet an zwei polyU-Abschnitte, die sich in einem Intron befinden, das Teil der 5′ UTR ist. Dieser Prozess bewirkt eine Intron-Retention und bewahrt kritische Sequenzen, die später für die Translationsregulation verwendet werden. Im Zytoplasma fungiert dasselbe SXL-Protein als Translationsrepressor von msl-2 in zwei unterschiedlichen Mechanismen, die an der 3′ und 5′ UTR stattfinden. SXL bindet U-reiche Sequenzen in der 3′ UTR und rekrutiert das Corepressor-Protein UNR (stromaufwärts von N-ras) und PABP, das die Rekrutierung des Prä-Initiationskomplexes am 5′-Ende der mRNA blockiert. Um sicherzustellen, dass msl-2 vollständig unterdrückt wird, findet am 5′-UTR ein zweiter regulatorischer Schritt statt, der ebenfalls durch SXL vermittelt wird. Diese Unterdrückung beinhaltet einen neuartigen Regulierungsmechanismus, bei dem ein Crosstalk zwischen SXL und einem uORF stattfindet, um die Translation effizient zu unterdrücken. Die 5′ UTR von msl-2 enthält 3 uORFs, aber nur der dritte ist an der Repression beteiligt. Interessanterweise ist diese Repression in Abwesenheit von SXL sehr schwach (~2fach), aber wenn SXL vorhanden ist, bindet es einen Poly-U-Abschnitt einige Nukleotide vom uAUG entfernt und erhöht diese Repression auf mehr als das 14-fache. SXL wirkt, indem es die Translationsinitiation am uAUG fördert und nicht als einfache sterische Arretierung von scannenden Ribosomen wirkt. Dieser Effekt könnte über eine Interaktion zwischen SXL und Translationsinitiationsfaktoren erfolgen, möglicherweise Mitglieder der elF3-Komponente, wie ein Two-Hybrid-Screening gezeigt hat. Dieser Mechanismus betrifft potenziell eine große Anzahl von mRNAs; bei 268 Transkripten in Drosophila wurde festgestellt, dass sie SXL-Bindungsmotive enthalten, die mit uAUG in einem angemessenen Abstand assoziiert sind. So wurde beispielsweise ein Reporterkonstrukt, das die 5′UTR des Gens Irr47 enthielt, durch das SXL-Protein um das 4-fache unterdrückt.

RBPs können antagonistische Funktionen bei der Regulierung der Translation haben. Ein interessantes Beispiel ist die Regulierung von p21 im Zusammenhang mit der replikativen Seneszenz, einem zellulären Zustand, in dem Zellen in einen irreversiblen Wachstumsstillstand geraten. Die Induktion von p21 ist erforderlich, um den Prozess in Gang zu setzen und cdk2-Cyclin E-Komplexe zu hemmen. Die 5′ UTR von p21 enthält eine GC-reiche Sequenz, die eine Stammschleife bildet. Dieses Element wird von zwei RBPs mit unterschiedlichen Eigenschaften erkannt: CUGBP1 und Calreticulin (CRT). Die Konkurrenz zwischen den beiden Proteinen bestimmt das endgültige Niveau der p21-Expression und entscheidet darüber, ob Zellen proliferieren oder einen Wachstumsstopp und Seneszenz durchlaufen. Die Bindung von CUGBP1 an die p21-mRNA ist in seneszenten Zellen im Vergleich zu jungen Fibroblasten drastisch erhöht. Der Proteingehalt ändert sich während des Prozesses nicht, und diese Aktivitätssteigerung ist auf die Phosphorylierung zurückzuführen. Andererseits zeigten CRT-IPs eine vier- bis fünffache Verringerung der Aktivität in Seneszenzzellen, was auf einen Rückgang der Expression zurückzuführen ist. Es wurde gezeigt, dass beide Proteine die Translation von p21 beeinflussen. Während CUGBP1 jedoch als Aktivator fungiert, wirkt CRT als Repressor. Da die beiden Proteine in seneszenten Zellen gegensätzliche Aktivitäten aufweisen, wurde untersucht, ob sie um die Interaktion mit der mRNA von p21 konkurrieren und deren Translation kontrollieren. Steigende Mengen des einen Proteins konnten die Bindung des anderen Proteins an die p21 mRNA und dessen Wirkung auf die Translation umkehren; die Affinität zur Bindungsstelle ist recht unterschiedlich, da CUGBP1 in den Bindungsreaktionen in einem vier- bis achtfachen molaren Überschuss zu CRT vorhanden sein musste, um dessen Bindung an die p21 mRNA zu antagonisieren und dessen Translation zu beeinflussen.

5. Regulation durch uORFs und Upstream AUGs

uORFs und uAUGs sind wichtige regulatorische Elemente in 5′ UTRs. Wie ihre Namen vermuten lassen, sind uORFs Sequenzen, die durch ein Start- und ein Stoppcodon stromaufwärts der kodierenden Hauptregion definiert sind, während uAUGs Startcodons ohne ein stromabwärts gelegenes In-Frame-Stoppcodon sind, die stromaufwärts der kodierenden Hauptregion liegen. Ein großer Prozentsatz des menschlichen Transkriptoms enthält uORF und/oder uAUGs, wobei die Werte zwischen 44 und 49 % liegen. Ähnliche Zahlen finden sich auch im Transkriptom der Maus. Obwohl diese Zahlen hoch klingen mögen, sind sowohl uORFs als auch uAUGs weniger häufig als zufällig erwartet, was darauf hindeutet, dass sie unter Selektionsdruck stehen. uORFs und uAUGs sind in bestimmten Untergruppen wie Transkriptionsfaktoren, Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren sowie Proto-Onkogenen überrepräsentiert. Sowohl uORFs als auch uAUGs sind extrem vielfältig und variieren in Bezug auf die Position in Bezug auf das Cap und das Haupt-AUG, die Anzahl pro Transkript und die Länge (im Falle von uORFs). Die ergänzende Tabelle 1 (im ergänzenden Material, online verfügbar unter http://dx.doi.org/10.1155/2012/475731) enthält eine umfassende Liste der uORFs und uAUGs im menschlichen Transkriptom. uORFs und uAUGs wurden bisher noch nicht umfassend auf ihre Erhaltung hin untersucht. Eine Pilotstudie, die mit einer Untergruppe von Transkripten von Mensch, Maus und Ratte durchgeführt wurde, zeigte, dass beide Elemente mäßig konserviert sind, da 38 % der uORFs und 24 % der uAUGs zwischen den drei Arten als konserviert ermittelt wurden. Die bescheidene Erhaltung von uORFs in Verbindung mit der Tatsache, dass ihre durchschnittliche Länge (20 Nukleotide) zufällig erwartet wird und uAUGs im Vergleich zu uORFs eine stärkere Unterdrückung bieten, legt nahe, dass viele uAUGs im Laufe der Evolution durch den Erwerb eines nachgeschalteten Stoppcodons neutralisiert wurden. Es wurde daher vorgeschlagen, dass nur einige wenige uORFs, sehr wahrscheinlich die konservierten, für die Expressionsregulation rekrutiert wurden. In Hefe wurde gezeigt, dass uORFs in 5′ UTRs statistisch unterrepräsentiert sind und durch Selektionsdruck entfernt wurden, was ebenfalls darauf hindeutet, dass die verbleibenden uORFs in die Translationsregulation involviert sein könnten.

Obwohl insgesamt davon ausgegangen wurde, dass uORFs bisher negativ mit der Proteinproduktion korreliert sind, wurde eine funktionelle Aktivität nur für eine begrenzte Anzahl von uORFs und uAUGs nachgewiesen. In Abbildung 3 zeigen wir Beispiele für die Auswirkungen, die uAUGs auf die Translationseffizienz haben können. Zu den wichtigsten Merkmalen, die zur Funktionalität beitragen können, gehören der lange Abstand zwischen 5′ cap und uORF, die Sequenzerhaltung, der Kontext, in dem sich das AUG befindet, die Stärke der Initiationsstelle für den ORF, die Länge des uORF und die Anzahl der AUGs in der 5′ UTR. Es wurden unterschiedliche Ergebnisse beobachtet, wenn ein Ribosom auf ein uAUG oder einen uORF stößt. Da die Zahl der charakterisierten Ereignisse noch gering ist, ist es schwierig, allgemeine Mechanismen zu definieren; wir beschreiben daher einige gut charakterisierte und relevante Ereignisse. Von Leaky Scanning spricht man, wenn ein Teil der Scanning-Komplexe das uAUG oder den uORF umgeht und weiter nach dem nächsten AUG scannt. In diesem Fall wirkt das stromaufwärts gelegene AUG als „Lockvogel“ für das ORF-AUG und fungiert zumindest für einen Teil der Ribosomen als negativer Regulator der Translation. Die Produktion von cis-wirksamen Peptiden durch uORFs kann die Initiierung der Translation des stromabwärts gelegenen ORFs reduzieren, indem das Ribosom am Ende des uORFs abgewürgt wird. Ein klassisches Beispiel ist das evolutionär konservierte eukaryotische Arginin-Attenuator-Peptid (AAP), das die Translation von Proteinen, die an der De-novo-Arginin-Biosynthese von Pilzen beteiligt sind, bei hoher Arginin-Konzentration negativ kontrolliert. In diesem Szenario verändert Arginin die Konformation von AAP und/oder die Umgebung der P-Stelle, was zum Abwürgen der Ribosomen am Terminationscodon von AAP uORF führt. AAP reduziert auch die Translationsdehnung durch Abwürgen des Ribosoms, wenn der uORF in eine kodierende Sequenz eingefügt wird. Ein weiteres klassisches Beispiel für die uORF-vermittelte Regulation stammt aus der Hefe. In der 5′ UTR des Transkriptionsfaktors GCN4 sind vier uORFs vorhanden. Der erste der vier uORFs wird unabhängig von den Nährstoffbedingungen immer effizient übersetzt. In ungestörten Zellen ermöglicht die schnelle Nachladung von Ribosomen und Initiations-Cofaktoren die Translation der uORFs 2-4, während sie die Translation des Haupt-ORFs hemmt. In Situationen mit Aminosäuremangel sind Initiationsfaktoren knapp, was zu einer verlangsamten Wiederbeladung der Ribosomen und einem Scannen der Sequenzen führt, die die uORFs enthalten. Ein funktionsfähiger Initiationskomplex wird nur an der kodierenden Hauptsequenz neu zusammengesetzt und GCN4 exprimiert. Dieser Mechanismus ermöglicht eine schnelle Reaktion auf Ernährungsstress. Ein weiteres ähnliches Beispiel für eine durch uORF regulierte Expression ist das Gen für Carnitin-Palmitoyltransferase 1C (CPT1C). CPT1C reguliert den Stoffwechsel im Gehirn in Situationen mit Energieüberschuss. Das Vorhandensein des uORF in der 5′ UTR unterdrückt die Expression des ORF. Diese Unterdrückung wird jedoch als Reaktion auf spezifische Stressreize wie Glukoseentzug und Palmitat-BSA-Behandlung aufgehoben. Es wurde vermutet, dass uORFs auch den mRNA-Abbau induzieren können. Eine Reihe von 5′-UTR-Konstrukten, die als Reporter das cat-Gen aus dem bakteriellen Transposon Tn9 enthalten, wurde in Hefe getestet. Durch eine einzige Nukleotidsubstitution wurde ein 7-Codon ORF stromaufwärts des cat-Gens geschaffen. Der uORF wurde effizient translatiert und verursachte eine Translationshemmung des cat ORF und eine Destabilisierung der cat mRNA. Ein Zusammenhang zwischen uORFs und mRNA-Zerfall wurde auch auf der Grundlage eines Vergleichs zwischen den durchschnittlichen Expressionsniveaus von uORF-haltigen und nicht uORF-haltigen Transkripten vorgeschlagen .

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Abbildung 3

Auswirkung von uAUG-Sequenzen auf die Translationsregulation. (a) Vergleich der Luziferasewerte, die für Konstrukte mit der 5′ UTR des Gens ACT (Kontrolle) und für uAUG-haltige Gene erhalten wurden: WBSCR16, MFSD5 und BCL2L13. (b) Die Deletion oder Mutation der uAUG-Sequenz in den Genen WBSCR16, MFSD5 und BCL2L13 hebt die Translationsunterdrückung auf, was sich in einer Zunahme der Luziferaseaktivität zeigt.

Einige Mutationen, die uORFs eliminieren oder erzeugen, die letztendlich die Proteinmenge verändern, wurden mit menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Ihre Bedeutung wurde kürzlich diskutiert. Eine Prädisposition für Melanome kann durch eine Mutation verursacht werden, die einen uORF in die 5′ UTR des Gens Cyclin-dependent-kinase inhibitor protein (CDKN2A) einführt. Hereditäre Thrombozytämie wird durch eine Mutation verursacht, die eine Spleißvariante erzeugt, die ein uORF eliminiert, was zu einer erhöhten Proteinproduktion des Gens Thrombopoietin führt. Die hereditäre Hypotrichose von Marie Unna wird durch eine Mutation verursacht, die einen uORF in der 5′ UTR des Gens hairless homolog unterbricht und dadurch dessen Expression erhöht. Ein Übergang von G zu A in einem der uORFs in der 5′ UTR des TGF-β3-Transkripts wurde mit arrhythmogener rechtsventrikulärer Kardiomyopathie/Dysplasie (ARVC) in Verbindung gebracht. Eine weitere Gruppe von fünf uORFs, die mit Krankheiten assoziiert sind, wurde kürzlich mit Hilfe von Reporter-Assays getestet; dazu gehören gonadale Dysgenesie (SRY) , Van-der-Woude-Syndrom (IRF6) , Carney Complex Typ 1 (PRKAR1A) , hereditäre Pankreatitis (SPINK1) und Thalassaemia-β (HBB) . Diese Liste wird sicherlich noch erweitert werden, da über 500 Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), die uORFs erzeugen oder löschen, berichtet wurden.

6. Suche nach neuen regulatorischen Elementen im 5′ UTR

Nur ein kleiner Teil der posttranskriptionellen regulatorischen Elemente, die sich in den menschlichen 5′ UTRs befinden, wurde charakterisiert. Diese identifizierten UTR-Elemente sind in einer Web-Ressource katalogisiert, die von der Gruppe von Graziano Pesole unter dem Namen UTRdb (http://utrdb.ba.itb.cnr.it/) gepflegt wird. Die In-vivo-Methoden zur Identifizierung posttranskriptioneller regulatorischer Elemente in UTRs, insbesondere derjenigen, die mit RBPs assoziiert sind, haben sich in den letzten fünf Jahren dank der Deep-Sequencing-Technologie dramatisch weiterentwickelt. CLIP und RIP-Seq sind Methoden, die auf der Isolierung von RNA-Proteinmolekülen (RNPs) durch Immunpräzipitation beruhen, gefolgt von einem RNase-Verdau und der präzisen Identifizierung von RBP-Bindungsstellen durch Deep Sequencing . Obwohl die Anzahl der bisher mit diesen Methoden analysierten RBPs sehr gering ist (Übersicht in ), könnte man davon ausgehen, dass mit der zunehmenden Zugänglichkeit der Deep-Sequencing-Technologie und der Vereinfachung der Methoden sehr bald ein großer Teil der menschlichen RBP-Bindungsstellen in den UTRs kartiert sein wird.

Eine weitere Möglichkeit zur Kartierung von UTR-Elementen, die die Translation regulieren, ist die Verwendung rein rechnerischer Methoden, die auf der Analyse der UTR-Sequenzen basieren. Diese Methoden beruhen auf der Identifizierung degenerierter Ribonukleotidmuster, die die erwarteten Eigenschaften von RBP-Bindungsstellen aufweisen. Ähnliche Methoden werden seit fast 30 Jahren zur Identifizierung von Transkriptionsregulatoren in Promotorsequenzen eingesetzt. Diese Methoden sind inzwischen ausgereift, weit verbreitet und haben bei der Zusammenstellung von Datenbanken über die Transkriptionsregulation (z. B. TRANSFAC) große Hilfe geleistet. Obwohl ein Großteil der Arbeit, die auf die Entwicklung und Verfeinerung von Algorithmen zur Analyse regulatorischer Sequenzen im Zusammenhang mit der Transkriptionsregulation gerichtet ist, auf entsprechende Analyseprobleme im Zusammenhang mit posttranskriptionalen regulatorischen Elementen übertragen werden kann, gibt es zusätzliche Komplikationen im Zusammenhang mit RBP-Bindungsstellen. Die offensichtlichste davon ist, dass RBPs sekundärstrukturelle Präferenzen haben, und nur wenige bestehende Analysewerkzeuge können Informationen über die RNA-Faltung berücksichtigen. Ebenso können regulatorische Elemente aufgrund der RNA-Faltung leichter synergistisch wirken oder eine konzertierte Bindung an Sequenzelemente aufweisen, die in der Primärsequenz distal, im gefalteten Molekül aber sehr nah sind. Eine weitere Schwierigkeit ist das Fehlen von Beispielen für translationale regulatorische Elemente zum Trainieren der Analyse. Auf der Grundlage einer Handvoll gut untersuchter Beispiele entsteht oft der Eindruck, dass RBP-Bindungsstellen im Durchschnitt kürzer sind als die Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren (TFs), aber dieser Eindruck kann auf eine Verzerrung in der Gruppe der RBPs zurückzuführen sein, auf die sich die Forschung am meisten konzentriert. Eine der leistungsfähigsten Methoden zur Identifizierung von regulatorischen Elementen ist das phylogenetische Footprinting, das sich den Vorteil einer lokal erhöhten evolutionären Erhaltung zunutze macht, um funktionelle Elemente aufzudecken. Diese Logik funktioniert ebenso gut für posttranskriptionale regulatorische Elemente. Leider sind TF-Bindungsstellen auch ein großes Hindernis für die direkte Anwendung der computergestützten Sequenzanalyse zur Identifizierung von 5′-UTR-Elementen, die an der Translation beteiligt sind. Elemente, die an der Transkriptionsregulation beteiligt sind, befinden sich sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts von Transkriptionsstartstellen, und wenn 5′-UTRs ausreichend kurz sind, sind posttranskriptionale regulatorische Elemente wahrscheinlich mit TF-Bindungsstellen verschachtelt.

Letztendlich werden sich die besten Methoden zur Identifizierung posttranskriptionaler regulatorischer Elemente aus der komplementären Anwendung von experimentellen und rechnerischen Techniken ergeben.

Danksagungen

Die Forschung im Labor von Penalva wird von der Voelcker-Stiftung, der Children’s Brain Tumor Foundation und 5R21HG004664-02 und 1R01HG006015-01A1 unterstützt.

Ergänzende Materialien