Apoenzym

5.11.3 Rolle des Proteins – Wechselwirkungen zwischen Enzym, Coenzym und Substrat

In allen Fällen wird das Coenzym an das Apoenzym gebunden, ohne dass sich das Absorptionsspektrum grundlegend ändert. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass das Enzym den Corrinring nicht von seiner Grundzustandskonformation in Lösung ablenkt. Das UV-sichtbare Absorptionsspektrum des Coenzym-Protein-Komplexes gibt jedoch keinen Aufschluss über die Identität des α-axialen Liganden. Studien haben gezeigt, dass der α-axiale 5,6-Dimethylbenzimidazol-Ligand in mindestens drei Cobalamin-abhängigen Enzymen durch eine Histidin-Seitenkette des jeweiligen Proteins ersetzt ist: Methionin-Synthase,4,7 Methylmalonyl-CoA-Mutase,8,45,46 und Glutamatmutase.47 Im Gegensatz dazu besetzt der 5,6-Benzimidazol-Ligand von Cobalamin immer noch die α-axiale Ligandenposition in AdoCbl, das an Diol-Dehydrase48 und Ribonukleotid-Reduktase gebunden ist (siehe Kapitel 5.08).

Um die Koordination durch die Histidin-Seitenkette zu ermöglichen, muss die „Nukleotidschleife“ der 5,6-Dimethylbenzimidazol-Base, des Ribofuranosylphosphodiesters und der Propionamid-Seitenkette vom Corrin-Ring wegschwenken und sich in eine Bindungstasche innerhalb des Proteins einfügen. Die Konsensussequenz DxHxxG wurde in Cobalamin-abhängigen Enzymen identifiziert, die den α-axialen Liganden durch eine Histidin-Seitenkette ersetzen.7,49,50 Das Histidin, das mit dem Cobalt-Atom koordiniert, interagiert höchstwahrscheinlich mit dem Aspartat-Rest über eine Wasserstoffbrücke. Abgesehen von der Rolle eines koordinierenden Liganden ist die genaue Funktion der His/Asp-Dyade als Modulator der enzymatischen Aktivität noch nicht klar.49 Andere Reste im aktiven Zentrum könnten ebenfalls an einem ausgedehnten Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk beteiligt sein, um die Reaktivität am Metallzentrum zu kontrollieren.7

Adenosylcobalamin-abhängige Enzyme müssen die Rate der CoC-Bindungshomolyse um mindestens den Faktor 1012 erhöhen, um die beobachtete Katalyserate zu erreichen.14 Die Labilisierung von Adenosylcobalamin erfordert eine Schwächung der CoC-Bindung, um die homolytische Spaltung zu ermöglichen. Obwohl das Konzept bei Cobalamin-abhängigen Enzymen nicht bewiesen ist, könnte die für die Verzerrung (Schwächung) der CoC-Bindung erforderliche Energie leicht aus der Nutzung überschüssiger Bindungsenergie stammen, die sich aus mehreren Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Cobalamin-Cofaktor ergibt, einschließlich der Amid-Seitenketten, die den Corrin-Ring schmücken.51 Die Amid-Seitenketten sind auch wichtige Erkennungselemente für die Bindung an die nicht-enzymatischen Cobalamin-Transportproteine Transcobalamin, Haptocorrin und Intrinsic Factor.52 Die Entfernung oder chemische Derivatisierung spezifischer Amid-Seitenketten verändert die Bindung an Transcobalamin um das 3- bis 40-fache52 und die vollständige Entfernung der c-Amid-Seitenkette ermöglicht die Einführung einer zusätzlichen Doppelbindung in das makrozyklische Skelett, wodurch der Corrin-Ring abgeflacht wird, was zu einer Rotverschiebung des Absorptionsmaximums führt.53

Neben der Förderung der gewünschten Reaktion erfüllen Adenosylcobalamin-abhängige Enzyme eine zweite wichtige Funktion, indem sie unerwünschte Nebenreaktionen verhindern, die häufig mit radikalischen Reaktionen einhergehen.54 Diese Funktion der negativen Katalyse54 erfordert eine stark eingeschränkte freie Energieoberfläche, die man sich als tiefe Schlucht vorstellen kann, durch die sich die Reaktion entlang der freien Energieoberfläche bewegt. Diese Schlucht muss steile Wände aufweisen, um Nebenreaktionen zu verhindern und das hochreaktive radikalische Zwischenprodukt einzuschränken. Am Ende der Reaktionssequenz wird das radikalische Zwischenprodukt durch Rekombination des 5′-Desoxyadenosyl-Radikals und des Cob(II)-Alamins gelöscht, wodurch der Grundzustand (Ruhezustand) des Adenosylcob(III)-Alaminkofaktors wiederhergestellt wird. Wenn das Enzym 25 kcal mol-1 investiert, um die Homolyse der C-Co-Bindung zu fördern, um den katalytischen Zyklus zu beginnen, muss diese Energie am Ende der Reaktionssequenz zurückgewonnen werden. Die Rückgewinnung der Energie wäre nicht möglich, wenn eine unerwünschte Folge von Umlagerungen eintritt, die ein Radikal erzeugt, das thermodynamisch stabiler ist als das 5′-Desoxyadenosylradikal. Daher muss das Enzym verhindern, dass sich das Alkylradikal zu einem energiearmen Zwischenprodukt umlagert oder durch das Proteingerüst wandert, um ein stabiles Radikal zu bilden, das nicht an der Katalyse teilnehmen kann.55

Eine paramagnetische Spezies bildet sich erst, wenn alle Reaktionskomponenten im Enzym-Substrat-Komplex vorhanden sind, da die Bildung eines von einem Coenzym abgeleiteten Radikals in Abwesenheit von Substrat zu unerwünschten Nebenreaktionen führen könnte. EPR-Experimente mit Methylmalonyl-CoA-Mutase46,55 bestätigen, dass die Homolyse der CoC-Bindung erst nach Zugabe von Substrat erfolgt, was durch das Auftreten eines produktähnlichen EPR-Signals angezeigt wird.46 In ähnlicher Weise zeigen spektrophotometrische Experimente mit Ethanolamin-Ammoniak-Lyase im gestoppten Durchfluss, dass die Signatur von Cob(II)alamin im sichtbaren Spektrum erst erscheint, wenn Enzym und Coenzym mit sättigenden Mengen an Substrat kombiniert werden.5659

Photolyse, Thermolyse und enzymbetriebene Homolyse der CoC-Bindung von Adeno-Sylcobalamin führen zu einem Singulett-Radikalpaar, das aus Cob(II)alamin und dem 5′-Desoxyadenosyl-Radikal besteht.60,61 Da alle diese Prozesse zur Bildung desselben Radikalpaares führen, können Informationen aus der Reaktionsdynamik von Photolyse-Studien mit vorgeschlagenen enzymatischen Reaktionsmechanismen in Verbindung gebracht werden. Die Photohomolyse von Adenosylcobalamin beginnt mit einer elektronischen π → π*-Bewegung im Corrin-Ring und muss einen Ladungstransfer-Zwischenzustand auf dem Weg zur Homolyse der CoC-Bindung beinhalten.60,61 Pikosekunden-Photolysestudien von Adenosylcobalamin zeigen Geminat-Radikalpaar-Rekombinationsraten von 109 s-1, mit fraktionellen Käfig-Rekombinations-Effizienzen, Fc, von etwa 94 %.42,62-64 Nanosekunden- und Dauerstrich-Photolysestudien von Cobalaminen bestätigen eine effiziente Radikalpaar-Rekombination im Geminat-Käfig, mit einer photochemischen Gesamt-Quantenausbeute von etwa 20 % für Adenosylcobalamin und 35 % für Methylcobalamin.65,66 In Abwesenheit des Enzyms rekombiniert ein großer Teil der Geminat-Radikalpaare, bevor es zu einer signifikanten Diffusionstrennung kommt. Um das 5′-Desoxyadenosylradikal zu stabilisieren und die Katalyse zu fördern, muss das Enzym den Abstand zwischen den Radikalpaaren vergrößern, wahrscheinlich durch eine Konformationsänderung. Wie auch immer der Mechanismus aussieht, die hohe Rate der Geminat-Rekombination im Radikalpaar erfordert, dass eine der Funktionen des Enzyms darin besteht, die Radikale zu trennen oder eines der Radikale vorübergehend einzufangen, um eine vorzeitige Rekombination zu verhindern.

Obwohl die resultierenden Singulett-Radikalpaare {5′-Desoxyadenosylradikal:Cob(II)alamin} identische elektronische Zustände haben,59-61,67 kann die enzymatische Homolyse der CoC-Bindung nicht auf einen angeregten elektronischen Zustand zugreifen und muss mit einem anderen Prozess beginnen, um die CoC-Bindung zu schwächen und das Gleichgewicht in Richtung Dissoziation zu verschieben (siehe Abschnitt 5.11.2). Die dehnungsinduzierte Spaltung führt nicht nur zur Homolyse der CoC-Bindung, sondern dieser Prozess vergrößert auch den Abstand zwischen den Radikalpaaren, wenn eine Komponente der Verzerrung entlang der apikalen Kobaltachse erfolgt. Dieser Brute-Force-Ansatz zur Streckung der CoC-Bindung ist möglicherweise die effizienteste Methode, um sowohl die Homolyse als auch eine Nettoverringerung der Rekombinationsrate der Radikalpaare zu erreichen.

Es ist auch möglich, dass das Enzym die CoC-Bindung stärkt und die Homolyse benachteiligt, indem es die apikale Co-α-N-Wechselwirkung komprimiert. Die thermodynamischen Eigenschaften der Adenosylcobinamid-Analoga + und + wurden untersucht.68 In + wurde eine stärkere CoC-Bindung mit einem kürzeren CoN-Bindungsabstand im Vergleich zu Pyridin als α-axiale Base beobachtet. Die stärkere CoC-Bindung führt zu einer deutlichen Verschiebung hin zur Heterolyse als bevorzugtem Weg. In diesem Modellsystem muss das untersuchte Enzym, die Methylmalonyl-CoA-Mutase, entweder die CoC-Heterolyse verhindern oder einen heterolytischen Weg beschreiten.68

In der Methionin-Synthase ist der Corrin-Teil des Cobalamins zwischen zwei Domänen eines 27 kDa-Fragments eingebettet, wobei der Nukleotidschwanz in eine tiefe Tasche eindringt, die von Resten der C-terminalen Domäne gebildet wird.7,69,70 Diese Sequenz enthält eine Region mit mäßiger Hydrophobie, die von ausgedehnten hydrophilen Segmenten flankiert wird.71 Strukturelle Ähnlichkeiten werden zwischen den Domänen erwartet, die eine Schnittstelle zum Corrin-Ring bilden. Die α/β-Domäne, die die untere Hälfte des Corrin-Rings bindet und den verlängerten Nukleotidschwanz (Phosphodiester-Anteil und 5,6-Dimethylbenzimidazol-Gruppe) in der Methionin-Synthase und der Methylmalonyl-CoA-Mutase aufnimmt, wird auch in der Glutamat-Mutase erwartet (vide infra).