Alkalisches Phosphatase-Isoenzym

Genomische Struktur, Proteinchemie und Enzymologie der alkalischen Phosphatase

ALP (Orthophosphor-Monoester-Phosphohydrolase, alkalisches Optimum, EC 3.1.3.1) kommt in der Natur überall in Pflanzen und Tieren vor (McComb et al., 1979). Beim Menschen werden vier ALP-Isoenzyme von vier verschiedenen Genen kodiert (Millán, 1988, 2006; Harris, 1990; Moss, 1992). Drei der Isoenzyme haben im Wesentlichen eine gewebespezifische Expression und werden als Darm-, Plazenta- und Keimzellen-(plazentagleiche) ALP bezeichnet. Das vierte ALP-Isoenzym wird ubiquitär exprimiert und wird daher als TNSALP bezeichnet (Stigbrand und Fishman, 1984; Harris, 1990; Moss, 1992). Skelett-, Leber- und Nierengewebe sind besonders reich an TNSALP. Die charakteristischen physikochemischen Eigenschaften (Hitzestabilität, elektrophoretische Mobilität usw.) der aus menschlichen Knochen, Leber und Nieren gereinigten ALPs gehen verloren, wenn sie Glykosidasen ausgesetzt werden (Moss und Whitaker, 1985), und TNSALP ist daher eine Familie von „sekundären“ Isoenzymen (ich werde sie „Isoformen“ nennen). Sie werden von demselben Gen kodiert, haben die gleiche Polypeptidsequenz und unterscheiden sich nur durch posttranslationale Modifikationen, die Kohlenhydrate einbeziehen (Harris, 1980).

Das Gen-Mapping-Symbol für TNSALP ist ALPL („ALP-Leber“), obwohl die Funktion der Leber-Isoform von TNSALP nicht bekannt ist (siehe später). ALPL befindet sich in der Nähe der Spitze des kurzen Arms von Chromosom 1 (1p36.1-p34), während die Gene für die Darm-, Plazenta- und Keimzellen-ALPs an der Spitze des langen Arms von Chromosom 2 (2q34-q37) liegen (Harris, 1990; Millán, 2006). ALPL scheint das ursprüngliche Gen zu sein, während die gewebespezifischen ALPs wahrscheinlich durch Genduplikation entstanden sind (Harris, 1990). ALPL ist etwas größer als 50 kb und enthält 12 Exons, von denen 11 translatiert werden, um das reife Enzym zu bilden, das aus 507 Aminosäureresten besteht (Weiss et al., 1988b). TATA- und Sp1-Sequenzen können regulatorische Elemente sein, aber die Basalexpression scheint „haushaltende“ Promotoreffekte widerzuspiegeln, während die unterschiedliche Expression in verschiedenen Geweben durch einen posttranskriptionalen Mechanismus vermittelt werden kann (Kiledjian und Kadesch, 1990). ALPL hat zwei Promotoren und zwei entsprechende 5′-nicht codierende Exons, 1a und 1b. Ihre Expression resultiert in zwei verschiedenen mRNAs mit unterschiedlichen 5′-untranslatierten Regionen (Nosjean et al., 1997). Die Transkription erfolgt bevorzugt vom stromaufwärts gelegenen Promotor (1a) in Osteoblasten und vom stromabwärts gelegenen Promotor (1b) in Leber und Niere (Millán, 2006).

Die gewebespezifischen ALP-Gene sind kleiner als ALPL, was vor allem auf kürzere Introns zurückzuführen ist. Die von ihren cDNAs abgeleiteten Aminosäuresequenzen deuten auf eine 87%ige Positionsidentität zwischen plazentarem und intestinalem ALP hin, aber nur auf eine 50-60%ige Identität zwischen den gewebespezifischen ALPs und TNSALP (Harris, 1990).

Die Aminosäuresequenz von TNSALP weist auf fünf potenzielle N-gebundene Glykosylierungsstellen hin (Weiss et al., 1988). Die N-Glykosylierung ist für die katalytische Aktivität notwendig. Die O-Glykosylierung charakterisiert die Knochen-, aber nicht die Leber-Isoform (Nosjean et al., 1997).

Im Jahr 2000 wurde die Kristallstruktur von ALP aus der menschlichen Plazenta mit einer Auflösung von 1,8 Å beschrieben (Le Due et al., 2000). Das aktive Zentrum von TNSALP leitet sich von einer Nukleotidsequenz ab, die in ALPs in der gesamten Natur konserviert ist (Henthorn und Whyte, 1992), spiegelt sechs Exons wider und umfasst 15 Aminosäurereste (Zurutuza et al., 1999).

ALPs sind Zn++-Metalloenzyme (McComb et al., 1979). Die katalytische Aktivität erfordert eine multimere Konfiguration identischer Untereinheiten, wobei jedes Monomer ein aktives Zentrum und zwei Zn++-Atome besitzt, die die Tertiärstruktur stabilisieren (Kim und Wycoff, 1991).

ALPs werden im Kreislauf im Allgemeinen als homodimer betrachtet (McComb et al., 1979). TNSALP hat in seiner symmetrischen dimeren Form eine αβ-Topologie für jede Untereinheit, einschließlich eines zehnsträngigen β-Faltblattes in der Mitte (Hoylaerts und Millán, 1991). In Geweben sind ALPs jedoch an Zelloberflächen gebunden (siehe unten), vielleicht als Homotetramere (Fedde et al., 1988).

In vitro haben ALPs eine breite Substratspezifität und pH-Optima, die von der Art und Konzentration der Phosphorverbindung abhängen, die katalysiert wird (McComb et al., 1979). Die katalytische Aktivität erfordert Mg++ als Cofaktor (McComb et al., 1979). Sowohl PPi als auch Phosphoester können hydrolysiert werden (Xu et al., 1991). Die Reaktion beinhaltet die Phosphorylierung/Dephosphorylierung eines Serinrestes. Die Dissoziation des kovalent gebundenen Pi scheint der geschwindigkeitsbeschränkende Schritt zu sein. Pi ist nämlich ein starker kompetitiver Inhibitor von ALP (McComb et al., 1979; Kim und Wyckoff, 1991; Coburn et al., 1998). Möglicherweise stabilisiert Pi aber auch das Enzym (Farley, 1991).

Über die Biosynthese von ALP in höheren Organismen bestehen noch Unklarheiten. Die Gensequenzen der menschlichen ALP-Isoenzyme weisen darauf hin, dass die naszierenden Polypeptide eine kurze Signalsequenz von 17-21 Aminosäureresten (Harris, 1990) und eine hydrophobe Domäne an ihrem Carboxylterminus aufweisen (Weiss et al., 1988b). Am intrazellulären Abbau von ALPs können Proteasomen beteiligt sein (Cai et al., 1998). Nichtsdestotrotz sind diese ALPs an die äußere Oberfläche der Plasmamembranen gebunden, und zwar an die polare Kopfgruppe einer Phosphatidylinositol-Glykan-Einheit (Whyte et al., 1988; Whyte, 1994), und können durch Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase freigesetzt werden (Fedde et al., 1988). Die genaue Interaktion mit Phosphatidylinositol kann jedoch von ALP-Isoenzym zu ALP-Isoenzym unterschiedlich sein (Seetharam et al., 1987).

Lipidfreies ALP ist der Teil, der normalerweise im Blutkreislauf zu finden ist. Die Mechanismen der ALP-Freisetzung von der Zelloberfläche sind jedoch nicht bekannt. Der Prozess könnte durch eine Phosphatidase des C- oder D-Typs, durch Detergenzien, Proteolyse, Membranfraktionierung oder Lipolyse ausgelöst werden (Alpers et al., 1990).

Bei gesunden Männern und Frauen stammt fast die gesamte ALP-Aktivität im Serum oder Plasma von ungefähr gleichen Mengen der Knochen- und Leber-Isoformen von TNSALP (Millán et al., 1980). Säuglinge und Kinder, insbesondere Neugeborene und Jugendliche, haben höhere Blutspiegel der Knochen-Isoform (McComb et al., 1979). Einige Personen mit den Blutgruppen B und O, die „Sekretoren“ sind, erhöhen die geringe Menge an intestinalem ALP in ihrem Blutkreislauf nach der Einnahme einer fettigen Mahlzeit (Langman et al., 1966; McComb et al., 1979). Normalerweise trägt das intestinale ALP jedoch nur wenige Prozent zur gesamten ALP-Aktivität im Serum bei (maximal 20 %) (McComb et al., 1979; Mulivor et al., 1985). Plazenta-ALP wird normalerweise nur im letzten Trimester der Schwangerschaft exprimiert und zirkuliert (Birkett et al., 1966). Verschiedene Krebsarten setzen jedoch plazentarisches oder keimzellähnliches ALP in den Blutkreislauf frei (Millán, 1988). Der Abbau von zirkulierendem ALP erfolgt, wie bei vielen anderen Glykoproteinen, wahrscheinlich durch Aufnahme und Abbau in der Leber (Young et al., 1984).